Name: aggregate size optimization in microwells for suspension-based cardiac differentiation of human pluripotent stem cells
Uploaded: 2016-09-25T15:00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Aggregate Size Optimization in Microwells for Suspension-based Cardiac Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

We thank Dr. Peter Zandstra, in whose laboratory this protocol was developed, and Drs. Mark Gagliardi and Gordon Keller who provided assistance in establishing the initial methods on which this process was based. Protocol development was supported by an Ontario Graduate Scholarship in Science and Technology to C.B. and a grant from the Heart and Stroke Foundation of Ontario to Peter Zandstra.

<ol>
	<li>Wintermantel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+scaffolds+using+superstructures.">Tissue engineering scaffolds using superstructures.</a> Biomaterials. 17, 83-91 (1996).</li><li>Lazar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+porcine+hepatocyte+spheroids+for+use+in+a+bioartificial+liver.">Formation of porcine hepatocyte spheroids for use in a bioartificial liver.</a> Cell Transplant. 4, 259-268 (1995).</li><li>Sachlos, E., Auguste, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryoid+body+morphology+influences+diffusive+transport+of+inductive+biochemicals:+a+strategy+for+stem+cell+differentiation.">Embryoid body morphology influences diffusive transport of inductive biochemicals: a strategy for stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 29, 4471-4480 (2008).</li><li>Johnstone, B., Hering, T. M., Caplan, A. I., Goldberg, V. M., Yoo, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+chondrogenesis+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+progenitor+cells.">In vitro chondrogenesis of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells.</a> Exp. Cell Res. 238, 265-272 (1998).</li><li>Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+differential+adhesion+govern+self-assembly+processes+in+histogenesis?+Equilibrium+configurations+and+the+emergence+of+a+hierarchy+among+populations+of+embryonic+cells.">Does differential adhesion govern self-assembly processes in histogenesis? Equilibrium configurations and the emergence of a hierarchy among populations of embryonic cells.</a> J. Exp. Zool. 173, 395-433 (1970).</li><li>Bauwens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+human+embryonic+stem+cell+colony+and+aggregate+size+heterogeneity+influences+differentiation+trajectories.">Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories.</a> Stem Cells Dayt. Ohio. 26, 2300-2310 (2008).</li><li>Koike, M., Kurosawa, H., Amano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Round-bottom+96-well+Polystyrene+Plate+Coated+with+2-methacryloyloxyethyl+Phosphorylcholine+as+an+Effective+Tool+for+Embryoid+Body+Formation.">A Round-bottom 96-well Polystyrene Plate Coated with 2-methacryloyloxyethyl Phosphorylcholine as an Effective Tool for Embryoid Body Formation.</a> Cytotechnology. 47, 3-10 (2005).</li><li>Ng, E. S., Davis, R. P., Azzola, L., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forced+aggregation+of+defined+numbers+of+human+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies+fosters+robust,+reproducible+hematopoietic+differentiation.">Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation.</a> Blood. 106, 1601-1603 (2005).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+human+embryonic+stem+cell+embryoid+body+homogeneity+and+cardiomyocyte+differentiation+from+a+novel+V-96+plate+aggregation+system+highlights+interline+variability.">Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability.</a> Stem Cells Dayt. Ohio. 25, 929-938 (2007).</li><li>Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible,+ultra+high-throughput+formation+of+multicellular+organization+from+single+cell+suspension-derived+human+embryonic+stem+cell+aggregates.">Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates.</a> PloS One. 3, e1565 (2008).</li><li>Kozhich, O. A., Hamilton, R. S., Mallon, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+generation+and+differentiation+of+neural+precursor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Standardized generation and differentiation of neural precursor cells from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rev. 9, 531-536 (2013).</li><li>Ungrin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+bioprocess+design+for+human+pluripotent+stem+cell+expansion+and+endoderm+differentiation+based+on+cellular+dynamics.">Rational bioprocess design for human pluripotent stem cell expansion and endoderm differentiation based on cellular dynamics.</a> Biotechnol. Bioeng. 109, 853-866 (2012).</li><li>Bauwens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+cardiomyogenic+induction+in+human+pluripotent+stem+cells.">Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells.</a> Tissue Eng. Part A. 17, 1901-1909 (2011).</li><li>Golos, T. G., Giakoumopoulos, M., Garthwaite, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells+as+models+of+trophoblast+differentiation:+progress,+opportunities,+and+limitations.">Embryonic stem cells as models of trophoblast differentiation: progress, opportunities, and limitations.</a> Reprod. Camb. Engl. 140, 3-9 (2010).</li><li>Markway, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+chondrogenic+differentiation+of+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+in+low+oxygen+environment+micropellet+cultures.">Enhanced chondrogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in low oxygen environment micropellet cultures.</a> Cell Transplant. 19, 29-42 (2010).</li><li>Fey, S. J., Wrzesinski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+drug+toxicity+using+3D+spheroids+constructed+from+an+immortal+human+hepatocyte+cell.">Determination of drug toxicity using 3D spheroids constructed from an immortal human hepatocyte cell.</a> Toxicol. Sci. Off. J. Soc. Toxicol. 127, 403-411 (2012).</li><li>Wallace, L., Reichelt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+3D+culture+to+investigate+the+role+of+mechanical+signaling+in+keratinocyte+stem+cells.">Using 3D culture to investigate the role of mechanical signaling in keratinocyte stem cells.</a> Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 989, 153-164 (2013).</li><li>Ungrin, M., O'Connor, M., Eaves, C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+human+embryonic+stem+cells.">Phenotypic analysis of human embryonic stem cells.</a> Curr. Protoc. Stem Cell Biol. , (2007).</li><li>Bhattacharya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes+and+characterization+by+flow+cytometry.">High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. JoVE. , e52010 (2014).</li><li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+signaling+through+TGF&#946;+family+members+and+WNT+regulates+patterning+and+pancreatic+specification+of+human+pluripotent+stem+cells.">Stage-specific signaling through TGF&#946; family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells.</a> Dev. Camb. Engl. 138, 861-871 (2011).</li><li>Niebruegge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+mesoderm+and+cardiac+cells+using+size-specified+aggregates+in+an+oxygen-controlled+bioreactor.">Generation of human embryonic stem cell-derived mesoderm and cardiac cells using size-specified aggregates in an oxygen-controlled bioreactor.</a> Biotechnol. Bioeng. 102, 493-507 (2009).</li></ol>

M.U. has a financial interest in the underlying microwell technology.

זה נצפה כי בידול הלב ביותר של תאי גזע פלוריפוטנטיים הוא תהליך משתנה מאוד. אמנם זה לא מפתיע כי שורות תאים שונות להפגין נטיות שונות עבור קיבולת בידול כדי סוגי תאים מסוימים, היא נצפתה כי יעילות בידול הלב משתנה באופן דרמטי בין לשכפל פועל באמצעות באותו תא קו 6. הפרוטוקול המתואר כאן כתובות מקור עיקרי אחת מהשונות ידי ישירות השליט את המספר הסלולרי קלט לכל המצרפי. כדי לצמצם עוד יותר השתנות בין ריצות, מומלץ כי קווי hPSC המותאמים passaging תא בודד משמשים, כמו צורה זו של תוצאות הרחבה ותחזוקת hPSC באוכלוסיות פלוריפוטנטיים עקביות יותר ביחס תדרי ביטוי של סמני pluripotency (למשל, Oct4, Nanog, tra-1-60, וכו.). הפרוטוקול כפי שנכתב כאן מציין גודל כולל של 1,000 תאים עבור oאינדוקצית לב ptimal משורת תאי גזע עוברית הס-2. כדי להחיל בפרוטוקול זה כדי שורות תאים שונות, זה קריטי, כי מסך גודל מצטבר ראשוני שיש לבצע כדי לקבוע את גודל המצטבר האופטימלי ספציפי שורת תאים. אמנם זה לא משפיע על הנהלים ישירות להיות אחריו כאן, אנו מזכירים לקורא שמשנה בגודל המצרפי צפיפות תאים הכוללות צפויים להשפיע אספקת חמצן. זה עשוי להיות שיקול רלוונטי ביישומים במורד הזרם. בנוסף, מוות של תאים אפופטוטיים היא דאגה במהלך דיסוציאציה של hPSCs תאים בודדים. לכן, חשוב להבטיח כי מעכב ROCK הוא נוכח במהלך צבירת תא כפיית microwells. לבסוף, זה קריטי, כי ביום 4 של בידול המצרפים נשטפים היטב כדי להסיר עקבות Activin A, נוכח בינוני 1 אינדוקציה, לפני resuspension אינדוקציה 2 בינוני. לאחר יום 4 של בידול, Activin מקדם בידול האנדודרם על החשבון טווהאינדוקציה Derm 20. היישום העיקרי של שיטה זו הוא להקרין בגדלים המצרפי המקדמים בידול הלב ביותר. עם זאת, אחת המגבלות של הטכניקה הנוכחית היא כי אתה עשוי להתקשות הייצור בקנה מידה לב לרמות רלוונטיות קלינית באמצעות צלחות microwell. עד בסולם של בידול לב בדרך כלל מתבצע בתנאי תרבות בתפזורת bioreactors השעיה עורר 21. לכן, ברגע שמערכת microwell נעשה שימוש כדי לקבוע טווחים מקובלים של גודל מצטבר לזירוז הלב ביותר, הצעד הבא בהיקף של עד הוא לקבוע מהירויות מאיצות bioreactor שיכול ליצור את הגודל מצטבר תא הרצוי. אחד ההבדלים המשמעותיים של טכניקה זו ביחס לשיטות אחרות לבידול לב המצרפי מבוסס הוא בכך שהוא מאפשר חקירות ישירות לתוך ויסות את ההשפעות של איתות אנדוגני אגרגטים וכןשיתוף התרבות של סוגי רקמות אינדוקטיביים / מעכבות עם hPSCs ב -13 המצרפי. אלו סוגים של חקירות יכולים להודיע ​​פיתוח תהליך ייצור לב בקנה מידה גדולה.

תרבית תאים במבחנה יכולה להתבצע תחת מספר שיטות, אבל בדרך כלל מתבצע בין אם דו ממדי תנאים חסידים או בתנאי השעיה תלת ממדים שיותר לשחזר באופן מלא במערכות vivo. כתוצאה מכך קיימת מגמה הולכת וגוברת בתחומים רבים של מחקר לפיתוח שיטות חזקות ליצירה תלת ממדי בונת רקמות. בתרחישים בם סוגי תהליכים בתא דורשים מטריקס תומך (ECM) אותות משטח דבקים, תלת ממד תרבות עשויה להיות מופעלת באמצעות בונת פיגום, שבו תאים בתרבית על או בתוך אקסוגניים תמיכת מטריקס 1. תאים ותהליכים שאינם דורשים הדבקה למטריצה תומכת יכולים להתבצע השעיה כמערכות unscaffolded המורכבות בעיקר או באופן בלעדי של תאים (אשר עשוי מכן להמשיך ליצור מטריצות אנדוגני משלהם) 2,3. כאן, אנו מציגים פרוטוקול o בידול לבתאי גזע פלוריפוטנטיים אדם f (hPSCs - תאי גזע מסוגלים להפוך לכל סוג תא בגוף, אם ממקורות עובריים או אחרים) מבוקרים בגודל, מדים, אגרגטים unscaffolded. דיפרנציאציה של hPSCs כמו אגרגטים השעיה סובלת וריאציות גדולות גודל מצטבר הוא בתוך לרוץ בין ריצות. השתנות זו היא תוצאה של השיטה המועסקת בדרך כלל כדי ליצור אגרגטים אלה, אשר כרוך ניתוק מכאני של מושבות תאים. כדי להפחית השתנות זו, מספר גישות שמשו לשלוט במספר תאים לכל סך הכל וכן בקוטר המצרפי ואחיד. דוגמאות כוללות היווצרות של אגרגטים צינורות microcentrifuge 4 או כפי תלוי טיפות 5, micropatterning מוגדרות דו ממדי מושבות hPSC 6 אז מה שיכול להיות מועבר ההשעיה, או צנטריפוגה של תאים לתוך U- או V-תחתון צלחות רבות גם 7,8, 9. עם זאת, כל אלה approaches מוגבל על ידי התפוקה שלהם הנמוכה של דור המצרפי. ובכן מבוססות מערכות לנקוט גישה דומה למערכות צלחת V-תחתון, אולם הגודל הקטן יותר של microwells (בפרוטוקול זה שלכל אחד מהם ברוחב של 400 מיקרומטר) מאפשר את הדור של מספרים גדולים יותר של אגרגטים אחיד מתרבות-צלחת אחת גם (בקוטר רמת ~ 15.5 מ&quot;מ המכיל ~ 1,200 microwells) מאשר היה להיווצר מתוך צלחת V-התחתון כולו 10. ובכן מבוססי היווצרות המצרפי נעשה שימוש בכמה הגדרות כולל בידול של hPSCs כדי Ectodermal 11, endodermal 12, mesodermal 13 ו extraembryonic 14 גורלות; chondrogenesis מתאי גזע mesenchymal 15; דור של מצעים אחידים להקרנה טוקסיקולוגית 16; וחקירות של mechanobiology 17. אחד האתגרים העיקריים בפיתוח פרוטוקולים הייצור חזקים לייצור hPSC הנגזרות cardiomyocytes כבר וחוסר השחזור יעיל בידול לב בין ריצות. הראינו בעבר ששונה זו ניתן לייחס ההטרוגניות באוכלוסיית hPSC החלה, המהווה הוא עצמי חידוש hPSCs ומבדל תאים המבטאים גנים הקשורים בידול האנדודרם עצבי 6,18. איתותי המופרשים מתאי המבדילים הללו להשפיע אינדוקציה הלב. באופן ספציפי, endoderm extraembryonic מקדם אינדוקצית לב, ואילו אבות עצביים לעכב אינדוקצית לב. עם צבירת hPSC, תאים בתוך להבדיל האוספים ומארגנים כך hPSCs המובחן מוקפים בשכבת תאי extraembryonic endoderm המתפתחים על פני השטח המצרפי 13. על ידי שליטת גודל מצטבר, אנו יכולים לווסת את היחס של תאי האנדודרם וישכנע לב כדי hPSCs המובחן (שטח פן יחס נפח) לייעל את היחס הזה לזירוז לב מרבי 13.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="645">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biological safety cabinet</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette aid</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">&#160;Serological pipettes (5 to 25 mL)&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aspirator</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aspirator or Pasteur pipettes</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;15 and 50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fume hood</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:216px;">5% CO2, 5% O2, and humidity controlled cell culture incubator&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Hypoxic (low oxygen) incubator</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:216px;">5% CO2, 20% O2, and humidity controlled cell culture incubator&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Low speed centrifuge with a swinging bucket rotor fitted with a plate holder&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">P2, P20, P200, and P1000 micropipettors and associated tips&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Inverted microscope with 4X, 10X and 20X phase objectives&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultra-Low Attachment (ULA) 24 well plates&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Corning/Costar</td>
			<td style="width:119px;">3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bench-top microcentrifuge</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-Ascorbic Acid</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sterile Ultrapure distilled water</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">W3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vortex</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ice</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">-20C freezer</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Monothioglycerol</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6145</td>
			<td>Toxic; Aliquoting of MTG is strongly recommended to minimize oxidation due to repeated opening. Aliquots can be stored at 4 &#176;C for up to 3 months, -20 &#176;C is recommended for long-term storage.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">StemPro-34 Medium</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10639-011</td>
			<td>Basal Cardiac Induction Medium; The supplement is stored at -20 &#176;C and the basal medium at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Transferrin</td>
			<td style="width:143px;">Roche</td>
			<td>10652202001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">BMP-4</td>
			<td style="width:143px;">R&#38;D Technologies</td>
			<td style="width:119px;">314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">bFGF</td>
			<td style="width:143px;">R&#38;D Technologies</td>
			<td style="width:119px;">233-FB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">VEGF</td>
			<td style="width:143px;">R&#38;D Technologies</td>
			<td style="width:119px;">293-VE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Activin A</td>
			<td style="width:143px;">R&#38;D Technologies</td>
			<td style="width:119px;">338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IWP-2</td>
			<td style="width:143px;">Reagents Direct</td>
			<td style="width:119px;">57-G89</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hydrochloric acid&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DMEM/F-12</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">100X Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">100X L-glutamine</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Knockout Serum Replacement</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10828010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TrypLE Select</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12563</td>
			<td>Dissociation enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Aggrewell 400 plates</td>
			<td style="width:143px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">27845</td>
			<td>Microwell Plates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Aggrewell Rinsing Solution</td>
			<td style="width:143px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">7010</td>
			<td>Microwell Rinsing Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Y-27632 ROCK Inhibitor</td>
			<td style="width:143px;">Tocris</td>
			<td style="width:119px;">1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase Type II</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6885&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96 well plate (for FACS staining)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Intraprep Permeabilization Reagent</td>
			<td style="width:143px;">Beckman Coulter</td>
			<td>IM2389</td>
			<td>Kit with 2 parts: Fixation Solution and Permeabilization Solution; Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cTnT antibody</td>
			<td>Neomarkers&#160;</td>
			<td style="width:119px;">MS-295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">goat anti-mouse-IgG APC antibodyThermoFisher</td>
			<td style="width:143px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">5 mL round bottom flow cytometry tubes</td>
			<td style="width:143px;">FACS machine dependent</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

aggregate size optimization in microwells for suspension-based cardiac differentiation of human pluripotent stem cells

Cardiac differentiation of human pluripotent stems cells (hPSCs) is typically carried out in suspension cell aggregates. Conventional aggregate formation of hPSCs involves dissociating cell colonies into smaller clumps, with size control of the clumps crudely controlled by pipetting the cell suspension until the desired clump size is achieved. One of the main challenges of conventional aggregate-based cardiac differentiation of hPSCs is that culture heterogeneity and spatial disorganization lead to variable and inefficient cardiomyocyte yield. We and others have previously reported that human embryonic stem cell (hESC) aggregate size can be modulated to optimize cardiac induction efficiency. We have addressed this challenge by employing a scalable, microwell-based approach to control physical parameters of aggregate formation, specifically aggregate size and shape. The method we describe here consists of forced aggregation of defined hPSC numbers in microwells, and the subsequent culture of these aggregates in conditions that direct cardiac induction. This protocol can be readily scaled depending on the size and number of wells used. Using this method, we can consistently achieve culture outputs with cardiomyocyte frequencies greater than 70%.

אגרגטים שבשליטת גודל של hPSCs יכול להיווצר ביעילות באמצעות מערכת microwell, תלוי רק ריכוז של תאים ואת שטח microwell. בעקבות צנטריפוגה קצר, המספרים המתאימים של תאים (1,000 בפרוטוקול זה) הם הביאו יחד בכל microwell (איור 1 א). חשוב לציין, תאים אלה מחדש קשרים תאיים בתוך 24 שעות, ולא צריך עוד למלא באר, אך הן מופיעים אגרגטים קומפקטיים עם קצוות חלקים (איור 1 ב). אגרגטים אלה מספקים את החומרים המוצא לבידול נוסף לקראת גורל לב. אם התאים אינם מהווים אשכולות חזקים, זה מצביע על מוות של תאים אפשריים בעקבות התנתקות reaggregation, ואת התאמתו של ריכוזי passaging ורוק התא בודדים מעכב עבור קו תא מסוים צריכים להיבחן. שלושת הימים הבאים microwells להראות שינוי קטן מורפו המצרפי<html> משעמם, למרות צמיחה כמה ניכרת. כאשר יוסר microwells, אגרגטים צריכים לשמור ההקפה, מורפולוגיה צפופה ולהיות בסדר גודל דומה לזה (איור 1 ג). תרבות 24 גם צלחות אולא תאפשר הרחבת תא נוספת וצמיחה. במשך היום 8, לאחר החשיפה הראשונה איתות Activin, ועיכוב Wnt, המצרפים יתחילו להופיע כמו אגרגטים גדולים ובהירים (1D איור). במהלך תקופה זו, פסולת הסלולר ניכרת תהיה ברורה בתחתית כל טוב יש להסיר על ידי המאפשר אגרגטים להתיישב לפני הסרת תקשורת. לפעמים, אגרגטים רבים מךתןז. זה לא לעכב את הבידול של אגרגטים אחרים הבאר, אם כי אלה &quot;אגרגטים סופר&quot; נוטים שלא להציג את השינויים המורפולוגיים לראות עם אגרגטים קטנים נוטים פחות לעבור התמיינות מלאה. <html> &quot;Jove_content&quot; FO: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; תוצאות בידול המשך שינויים מורפולוגיים בולטים המצרפים עם גודל מוגבר והופעת האזורים סיביים מאורגנים. במשך היום 12, אגרגטים קבלנות ניתן לצפות. אלה תמיד יהיו מורכבים של תאים גדולים, שקופים ולעתים קרובות כוללים תאי מטריקס נרחבים מחוץ במצטבר (איור 2). בעוד צירים המצרפי-רחבים מצביעים אבחון מוצלח, ביטוי סמן לב עשוי להיות גם ציין אגרגטים שאינו מופיעים להתכווץ. בעקבות ניתוק של אגרגטים immunolabeling, רוב התאים יהיה חיובי עבור cTnT סמן cardiomyocyte ידי cytometry זרימה (איור 3). הביטוי של סמן זה הוא יציב לתאים ועלולים להיות שנצפה אגרגטים מאוחר ככל יום 19 של בידול. 1.jpg &quot;/&gt; איור 1: ציר הזמן של hPSC הבדיל כלפי גורל לב מיד לאחר צבירה, תאים כמעט ממלאים כל microwell (א).. יום אחד מאוחר יותר, המצרפים להופיע מרוכז וחלקה (B). מורפולוגיה זו נמשכת גם כאשר אגרגטים יוסרו מן microwells ו מצופה לתוך צלחות גם (C). במשך היום 8, אגרגטים מתחילים להתרחב להופיע בהיר (ד &#39;). סרגל קנה מידה:. 250 מיקרומטר <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54308/54308fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54308/54308fig2.jpg" /> איור 2: אגרגטים בגין המתקשרים יום 12 של בידול לאחר שישה ימים Cardiac אינדוקציה שלב 3 בינוני, התכווצויות המצרפי-רחב כוחנית נצפו (הפאנל העליון:. להירגעation, פאנל באמצע: התכווצות). הפנל התחתון נגזר הפחתת הלוחות הגבוהים ובינוניים, עם רוב ההבדלים משמעותיים המופיעים כשחור או לבן (ראשי חץ). סרגל קנה מידה:. 250 מיקרומטר <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54308/54308fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54308/54308fig3.jpg" /> איור 3:. Immunolabeling עבור Cardiac Troponin T ב הבדיל hPSCs באותו יום 17, רוב התאים הם חיוביים עבור T טרופונין לבבי ידי cytometry זרימה (היסטוגרמה מלא). מוצג גם הם תאים מוכתם נוגדנים משני בלבד (היסטוגרמה ללא מילוי). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54308/54308fig3large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Aggregate Size Optimization in Microwells for Suspension-based Cardiac Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Aggregate Size Optimization in Microwells for Suspension-based Cardiac Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells

בשיטות מקובלות ליזום בידול מצטבר המבוסס השעית לב של פלוריפוטנטיים אדם נובע תאים (hPSCs) הם הטרידו עם ההטרוגניות תרבות ביחס גודל וצורה המצרפי. כאן אנו מתארים שיטה חזקה לבידול לב העסקת microwells ליצור שבשליטת הגודל hPSC אגרגטים בתרבית בתנאים לקידום לב.

אופטימיזציה גודל המצרפי Microwells עבור מבוססי השעיה בידול לב של תאי גזע אנושיים pluripotent

Cardiac differentiation of human pluripotent stems cells (hPSCs) is typically carried out in suspension cell aggregates.  Conventional aggregate formation ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

סטנסיל micropatterning של תאי גזע האנושי pluripotent עבור גשוש הארגון המרחבי של גורל הבידול

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

ייצור בקנה מידה גדולה של cardiomyocytes מתאי גזע פלוריפוטנטיים אדם באמצעות פרוטוקול בידול מולקולה קטן המבוססת לשחזור ביותר

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

בידול העצבי המהיר של גזע תאים המושרה pluripotent למדידת פעילות רשת על מערכי מייקרו-אלקטרודה

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Cells for Myocardial Repair

תאי גזע פלוריפוטנטיים נגזרים תאי לב לתיקון שריר לב

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) must be fully differentiated into specific cell types before administration, but conventional protocols for ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

ביים הבידול של אבות Hematopoietic פרימיטיבי, מהווים הסופית מתאי גזע Pluripotent אנושי

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

במבחנה בידול של האדם pluripotent בתאי גזע לתאי Trophoblastic

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

הבידול מהירה, מכוונת של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית מתאי גזע Pluripotent האנושי עובריים או מושרה

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

יעיל הבידול של תאים האדם Pluriפוטנטי לתוך תאי הכבד

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

בדור חוץ גופית של Somite נגזרים מן האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

הומוגניים אנדותל בידול מתאי גזע האדם Pluriפוטנטי במזין-ו-Xeno-תנאי מוגדר חינם

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...