Name: aggregate size optimization in microwells for suspension-based cardiac differentiation of human pluripotent stem cells
Uploaded: 2016-09-25T15:00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Aggregate Size Optimization in Microwells for Suspension-based Cardiac Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

We thank Dr. Peter Zandstra, in whose laboratory this protocol was developed, and Drs. Mark Gagliardi and Gordon Keller who provided assistance in establishing the initial methods on which this process was based. Protocol development was supported by an Ontario Graduate Scholarship in Science and Technology to C.B. and a grant from the Heart and Stroke Foundation of Ontario to Peter Zandstra.

<ol>
	<li>Wintermantel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+scaffolds+using+superstructures.">Tissue engineering scaffolds using superstructures.</a> Biomaterials. 17, 83-91 (1996).</li><li>Lazar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+porcine+hepatocyte+spheroids+for+use+in+a+bioartificial+liver.">Formation of porcine hepatocyte spheroids for use in a bioartificial liver.</a> Cell Transplant. 4, 259-268 (1995).</li><li>Sachlos, E., Auguste, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryoid+body+morphology+influences+diffusive+transport+of+inductive+biochemicals:+a+strategy+for+stem+cell+differentiation.">Embryoid body morphology influences diffusive transport of inductive biochemicals: a strategy for stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 29, 4471-4480 (2008).</li><li>Johnstone, B., Hering, T. M., Caplan, A. I., Goldberg, V. M., Yoo, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+chondrogenesis+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+progenitor+cells.">In vitro chondrogenesis of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells.</a> Exp. Cell Res. 238, 265-272 (1998).</li><li>Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+differential+adhesion+govern+self-assembly+processes+in+histogenesis?+Equilibrium+configurations+and+the+emergence+of+a+hierarchy+among+populations+of+embryonic+cells.">Does differential adhesion govern self-assembly processes in histogenesis? Equilibrium configurations and the emergence of a hierarchy among populations of embryonic cells.</a> J. Exp. Zool. 173, 395-433 (1970).</li><li>Bauwens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+human+embryonic+stem+cell+colony+and+aggregate+size+heterogeneity+influences+differentiation+trajectories.">Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories.</a> Stem Cells Dayt. Ohio. 26, 2300-2310 (2008).</li><li>Koike, M., Kurosawa, H., Amano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Round-bottom+96-well+Polystyrene+Plate+Coated+with+2-methacryloyloxyethyl+Phosphorylcholine+as+an+Effective+Tool+for+Embryoid+Body+Formation.">A Round-bottom 96-well Polystyrene Plate Coated with 2-methacryloyloxyethyl Phosphorylcholine as an Effective Tool for Embryoid Body Formation.</a> Cytotechnology. 47, 3-10 (2005).</li><li>Ng, E. S., Davis, R. P., Azzola, L., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forced+aggregation+of+defined+numbers+of+human+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies+fosters+robust,+reproducible+hematopoietic+differentiation.">Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation.</a> Blood. 106, 1601-1603 (2005).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+human+embryonic+stem+cell+embryoid+body+homogeneity+and+cardiomyocyte+differentiation+from+a+novel+V-96+plate+aggregation+system+highlights+interline+variability.">Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability.</a> Stem Cells Dayt. Ohio. 25, 929-938 (2007).</li><li>Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible,+ultra+high-throughput+formation+of+multicellular+organization+from+single+cell+suspension-derived+human+embryonic+stem+cell+aggregates.">Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates.</a> PloS One. 3, e1565 (2008).</li><li>Kozhich, O. A., Hamilton, R. S., Mallon, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+generation+and+differentiation+of+neural+precursor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Standardized generation and differentiation of neural precursor cells from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rev. 9, 531-536 (2013).</li><li>Ungrin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+bioprocess+design+for+human+pluripotent+stem+cell+expansion+and+endoderm+differentiation+based+on+cellular+dynamics.">Rational bioprocess design for human pluripotent stem cell expansion and endoderm differentiation based on cellular dynamics.</a> Biotechnol. Bioeng. 109, 853-866 (2012).</li><li>Bauwens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+cardiomyogenic+induction+in+human+pluripotent+stem+cells.">Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells.</a> Tissue Eng. Part A. 17, 1901-1909 (2011).</li><li>Golos, T. G., Giakoumopoulos, M., Garthwaite, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells+as+models+of+trophoblast+differentiation:+progress,+opportunities,+and+limitations.">Embryonic stem cells as models of trophoblast differentiation: progress, opportunities, and limitations.</a> Reprod. Camb. Engl. 140, 3-9 (2010).</li><li>Markway, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+chondrogenic+differentiation+of+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+in+low+oxygen+environment+micropellet+cultures.">Enhanced chondrogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in low oxygen environment micropellet cultures.</a> Cell Transplant. 19, 29-42 (2010).</li><li>Fey, S. J., Wrzesinski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+drug+toxicity+using+3D+spheroids+constructed+from+an+immortal+human+hepatocyte+cell.">Determination of drug toxicity using 3D spheroids constructed from an immortal human hepatocyte cell.</a> Toxicol. Sci. Off. J. Soc. Toxicol. 127, 403-411 (2012).</li><li>Wallace, L., Reichelt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+3D+culture+to+investigate+the+role+of+mechanical+signaling+in+keratinocyte+stem+cells.">Using 3D culture to investigate the role of mechanical signaling in keratinocyte stem cells.</a> Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 989, 153-164 (2013).</li><li>Ungrin, M., O'Connor, M., Eaves, C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+human+embryonic+stem+cells.">Phenotypic analysis of human embryonic stem cells.</a> Curr. Protoc. Stem Cell Biol. , (2007).</li><li>Bhattacharya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes+and+characterization+by+flow+cytometry.">High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. JoVE. , e52010 (2014).</li><li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+signaling+through+TGF&#946;+family+members+and+WNT+regulates+patterning+and+pancreatic+specification+of+human+pluripotent+stem+cells.">Stage-specific signaling through TGF&#946; family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells.</a> Dev. Camb. Engl. 138, 861-871 (2011).</li><li>Niebruegge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+mesoderm+and+cardiac+cells+using+size-specified+aggregates+in+an+oxygen-controlled+bioreactor.">Generation of human embryonic stem cell-derived mesoderm and cardiac cells using size-specified aggregates in an oxygen-controlled bioreactor.</a> Biotechnol. Bioeng. 102, 493-507 (2009).</li></ol>

M.U. has a financial interest in the underlying microwell technology.

Было отмечено, что эффективная сердечная дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток является весьма переменной процесса. В то время как это не удивительно , что различные клеточные линии показывают различные наклонности к дифференцировке способности к определенным типам клеток, было обнаружено , что сердечная эффективность дифференциации резко колеблется между прогонов с использованием повторности ту же клеточную линию 6. Протокол, описанный здесь обращается один главный источник этой изменчивости путем непосредственного управления числом входных клеток на агрегат. Для дальнейшего уменьшения вариабельности между прогонами, рекомендуется HPSC линии , приспособленные для одной ячейки пассирования используются, так как эта форма результатов HPSC расширения и технического обслуживания в более последовательных плюрипотентных населения в отношении экспрессии частот маркеров плюрипотентности (например, Oct4, Nanog, TRA-1-60 и др.). Протокол, как написано здесь, определяет совокупный размер 1000 ячеек для оptimal сердечной индукции из эмбриональных стволовых клеток линии HES-2. Чтобы применить этот протокол для различных клеточных линий, очень важно, чтобы начальный экран размер агрегата производится для определения клеточной линии конкретного оптимального совокупного размера. В то время как это непосредственно не влияет на процедуры, которым необходимо следовать здесь, напомним, что изменения в совокупном размере и общей плотности клеток, как ожидается, влияют на доставку кислорода. Это может стать существенным фактором в последующих применений. Кроме того, апоптическая гибель клеток вызывает беспокойство во время диссоциации hPSCs до отдельных клеток. Поэтому крайне важно, чтобы гарантировать, что ингибитор ROCK присутствует во время агрегации принудительному клеток в лунках. И, наконец, очень важно, что на 4-й день дифференциации агрегаты хорошо промывают для удаления следов активин А, присутствующий в Индукционная 1 средний, до ресуспендирования в индукционных 2 средних. После того, как 4-й день дифференциации, активин А способствует дифференциации энтодермы за счет мезоDerm индукция 20. Основное применение этой методики заключается в скрининге агрегатные размеры, которые способствуют эффективному сердечной дифференциации. Тем не менее, одним из недостатков текущего метода заключается в том, что она является сложной задачей для масштабирования сердца производства до клинически значимых уровней с использованием Планшетный. Шкала до сердечной дифференциации , как правило , осуществляют в массе условиях культивирования в биореакторах перемешиваемой суспензии 21. Поэтому, как только система Микропланшетная была использована для определения допустимых диапазонов размеров агрегатов для эффективной сердечной индукции, следующий шаг для расширения заключается в определении скорости биореактор рабочего колеса, которые могут генерировать требуемый размер ячейки заполнителя. Одним из существенных отличий этого метода в отношении других методов агрегатного на основе сердечной дифференциации является то, что она позволяет прямые исследования в модулирующий действие эндогенных сигналов в агрегатах, а такжесовместное культивирование индуктивных / типов ингибирующих ткани с hPSCs в совокупности 13. Эти виды исследований могут информировать развитие процесс крупномасштабного производства сердца.

В пробирке культуре клеток может быть выполнена в соответствии с рядом условий, но , как правило , осуществляется либо в двумерных прилипших условиях или в трехмерных условиях подвески , которые более полно резюмировать в системах естественных условиях. Следовательно, существует растущая тенденция во многих областях исследований с целью разработки надежных методов для создания трехмерных конструкций ткани. В ситуациях , когда типы и клеточные процессы требуют поддерживающих внеклеточного матрикса (ЕСМ) прилипание поверхности и сигналы, трехмерная культура может быть включена с помощью scaffolded конструктов, где клетки культивируют на или в экзогенный поддерживающей матрицы 1. Клетки и процессы , которые не требуют адгезии к поддерживающей матрицы может быть выполнена в виде суспензии в качестве unscaffolded систем , состоящих в основном или исключительно из клеток (которые могут затем перейти к генерировать свои собственные эндогенные матрицы) 2,3. Здесь мы приводим протокол для сердечной дифференциации OF человека плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs - стволовые клетки, способные стать любым типом клеток в организме, будь то из эмбриональных или других источников) по размеру контролируемой, униформы, unscaffolded агрегатов. Дифференциация hPSCs в виде суспензии агрегатов страдает от значительных колебаний совокупного размера как в пределах пробега и между пробегами. Эта изменчивость является следствием метода, обычно используемых для создания этих агрегатов, которая включает в себя механическую диссоциации клеточных колоний. Чтобы уменьшить эту изменчивость, ряд подходов, которые были использованы для контроля количества клеток на совокупности, а также совокупный диаметр и однородность. Примеры включают в себя образование агрегатов в микропробирок 4 или висячей капли 5, micropatterning определены двумерные HPSC колонии 6 , которые затем могут быть перенесены в суспензии или центрифугирование клеток в U- или V-дно мульти-луночных планшетах 7,8, 9. Тем не менее, все эти проверoaches ограничены их низкой пропускной способностью совокупного поколения. Системы обоснованному используют аналогичный подход к системам V-образным дном, однако меньший размер лунках (в данном протоколе каждый из которых имеет ширину 400 мкм) позволяет поколение большего числа однородных агрегатов из одной культуры-плашки (стандартный диаметр ~ 15,5 мм , содержащих ~ 1200 миропланшет) , чем будет генерироваться из целого V-образным дном 10. Образование агрегатов Хорошо основе был использован в ряде установок , включая дифференциацию hPSCs до Эктодермальные 11, энтодермальная 12, 13 и Мезодермальные внеэмбриональной 14 судьбами; хондрогенез из мезенхимальных стволовых клеток 15; формирование единых подложек для токсикологического скрининга 16; и исследования mechanobiology 17. Одной из основных проблем в разработке надежных протоколов производства для производства HPSC-производного cardiomyocytes было отсутствие воспроизводимости в сердечной эффективности дифференциации между запусками. Ранее мы показали , что эта изменчивость может быть отнесена к неоднородности в исходной популяции HPSC, который включает оба самообновлению hPSCs и дифференциации клеток , которые экспрессируют гены , связанные с эндодермы и нервной дифференцировки 6,18. Сигналы, секретируемые этими дифференцирующихся клеток влияют на сердечную индукцию. В частности, внезародышевый энтодерма способствует сердечной индукции, в то время как нервные клетки-предшественники подавляют сердечной индукции. При агрегации HPSC, клетки в пределах общей дифференцироваться и организоваться , чтобы недифференцированные hPSCs окружены слоем внеэмбриональные эндодермы клеток , которые развиваются на поверхности агрегата 13. Контролируя совокупный размер, мы можем модулировать соотношение количества сердечных индуцирующих эндодермы клеток к недифференцированных hPSCs (площадь поверхности к объему) , и оптимизировать это отношение для максимального сердечного индукции 13.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="645">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biological safety cabinet</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette aid</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">&#160;Serological pipettes (5 to 25 mL)&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aspirator</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aspirator or Pasteur pipettes</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;15 and 50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fume hood</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:216px;">5% CO2, 5% O2, and humidity controlled cell culture incubator&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Hypoxic (low oxygen) incubator</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:216px;">5% CO2, 20% O2, and humidity controlled cell culture incubator&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Low speed centrifuge with a swinging bucket rotor fitted with a plate holder&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">P2, P20, P200, and P1000 micropipettors and associated tips&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Inverted microscope with 4X, 10X and 20X phase objectives&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultra-Low Attachment (ULA) 24 well plates&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Corning/Costar</td>
			<td style="width:119px;">3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bench-top microcentrifuge</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-Ascorbic Acid</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sterile Ultrapure distilled water</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">W3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vortex</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ice</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">-20C freezer</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Monothioglycerol</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6145</td>
			<td>Toxic; Aliquoting of MTG is strongly recommended to minimize oxidation due to repeated opening. Aliquots can be stored at 4 &#176;C for up to 3 months, -20 &#176;C is recommended for long-term storage.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">StemPro-34 Medium</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10639-011</td>
			<td>Basal Cardiac Induction Medium; The supplement is stored at -20 &#176;C and the basal medium at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Transferrin</td>
			<td style="width:143px;">Roche</td>
			<td>10652202001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">BMP-4</td>
			<td style="width:143px;">R&#38;D Technologies</td>
			<td style="width:119px;">314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">bFGF</td>
			<td style="width:143px;">R&#38;D Technologies</td>
			<td style="width:119px;">233-FB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">VEGF</td>
			<td style="width:143px;">R&#38;D Technologies</td>
			<td style="width:119px;">293-VE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Activin A</td>
			<td style="width:143px;">R&#38;D Technologies</td>
			<td style="width:119px;">338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IWP-2</td>
			<td style="width:143px;">Reagents Direct</td>
			<td style="width:119px;">57-G89</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hydrochloric acid&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DMEM/F-12</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">100X Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">100X L-glutamine</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Knockout Serum Replacement</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10828010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TrypLE Select</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12563</td>
			<td>Dissociation enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Aggrewell 400 plates</td>
			<td style="width:143px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">27845</td>
			<td>Microwell Plates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Aggrewell Rinsing Solution</td>
			<td style="width:143px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">7010</td>
			<td>Microwell Rinsing Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Y-27632 ROCK Inhibitor</td>
			<td style="width:143px;">Tocris</td>
			<td style="width:119px;">1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase Type II</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6885&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96 well plate (for FACS staining)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Intraprep Permeabilization Reagent</td>
			<td style="width:143px;">Beckman Coulter</td>
			<td>IM2389</td>
			<td>Kit with 2 parts: Fixation Solution and Permeabilization Solution; Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cTnT antibody</td>
			<td>Neomarkers&#160;</td>
			<td style="width:119px;">MS-295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">goat anti-mouse-IgG APC antibodyThermoFisher</td>
			<td style="width:143px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">5 mL round bottom flow cytometry tubes</td>
			<td style="width:143px;">FACS machine dependent</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

aggregate size optimization in microwells for suspension-based cardiac differentiation of human pluripotent stem cells

Cardiac differentiation of human pluripotent stems cells (hPSCs) is typically carried out in suspension cell aggregates. Conventional aggregate formation of hPSCs involves dissociating cell colonies into smaller clumps, with size control of the clumps crudely controlled by pipetting the cell suspension until the desired clump size is achieved. One of the main challenges of conventional aggregate-based cardiac differentiation of hPSCs is that culture heterogeneity and spatial disorganization lead to variable and inefficient cardiomyocyte yield. We and others have previously reported that human embryonic stem cell (hESC) aggregate size can be modulated to optimize cardiac induction efficiency. We have addressed this challenge by employing a scalable, microwell-based approach to control physical parameters of aggregate formation, specifically aggregate size and shape. The method we describe here consists of forced aggregation of defined hPSC numbers in microwells, and the subsequent culture of these aggregates in conditions that direct cardiac induction. This protocol can be readily scaled depending on the size and number of wells used. Using this method, we can consistently achieve culture outputs with cardiomyocyte frequencies greater than 70%.

Контролировали по размеру агрегаты hPSCs эффективно могут быть сформированы с использованием системы микропланештным, зависит только от концентрации клеток и площади поверхности микропланештным. После короткого центрифугирования, соответствующие количества клеток (1000 в данном протоколе) сведены вместе в каждом микролуночным (рис 1А). Важно отметить, что эти клетки восстановить внутриклеточные соединения в течение 24 ч, и больше не должны заполнять скважину, но появляются в виде компактных агрегатов с гладкими краями (рис 1В). Эти агрегаты обеспечивают исходные материалы для дальнейшей дифференциации к сердечной судьбы. Если клетки не образуют плотные кластеры, это говорит о том возможную гибель клеток после диссоциации и реагрегация, а также пригодность единичных концентраций клеток пассирования и ингибитором ROCK для конкретной клеточной линии должны быть проверены. Следующие три дня в лунках показывают незначительные изменения в совокупности морфология, хотя некоторый рост налицо. Когда удаляется из лунках, агрегаты должны сохранять свою круглую, плотно упакованную морфологии и быть такого же размера , как друг к другу (рис 1C). Культура в ULA 24-луночные планшеты позволит дальнейшее расширение и рост клеток. К 8 -й день, после воздействия первого на передачу сигналов активина и Wnt торможения, агрегаты начнут появляться , как больше и ярче агрегатов (рис 1D). В этот период значительный клеточный дебрис будет видно в нижней части каждой лунки и должны быть удалены, позволяя заполнители обосноваться перед удалением носителя. Время от времени, многие агрегаты сольются. Это не будет препятствовать дифференциацию других агрегатов в скважине, хотя эти &quot;супер агрегатами&quot;, как правило, не проявляют морфологические изменения, наблюдаемые при меньших агрегатов и менее вероятно, происходит полная дифференциации. &quot;Jove_content&quot; ВОК: Keep-together.within-страницу = &quot;1&quot;&gt; Продолжение результаты дифференциации в заметных морфологических изменений в агрегатах с увеличенным размером и появлением организованных волокнистых регионов. К 12-й день, можно наблюдать договаривающиеся агрегаты. Они будут всегда состоять из больших, прозрачных клеток и часто включают в себя обширный внеклеточный матрикс вне агрегата (рисунок 2). В то время как совокупный масштабах сокращений указывают на успешную дифференциацию, выражение сердечный маркер также может наблюдаться в агрегатах, которые не появляются сокращаться. После диссоциации агрегатов и иммунноокрашивания, большинство клеток будет положительным для маркера кардиомиоцитов cTnT методом проточной цитометрии (рисунок 3). Выражение этого маркера стабилен в клетках и может наблюдаться в агрегатах, как в конце 19-й день дифференциации. 1.jpg &quot;/&gt; Рисунок 1: Хронология HPSC дифференцированы по отношению к сердечной судьбы Сразу после агрегации, клетки почти Заполните каждую лунку (A).. Через день, агрегаты появляются конденсируются и гладкими (В). Эта морфология сохраняется даже тогда , когда агрегаты удаляются из лунках и высевают в лунки планшетов (C). К 8 -й день, агрегаты начинают расширяться и появляются более светлого цвета (D). Шкала бар:. 250 мкм <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54308/54308fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54308/54308fig1large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54308/54308fig1large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="фигура 2" src="/files/ftp_upload/54308/54308fig2.jpg" /> Рисунок 2: Совокупные Begin сократившись на 12 день дифференциации После шести дней в кардиохирургии Induction Этап 3 средних наблюдались, силовые агрегатные для всей схватки (верхнюю панель:. Расслабитьсявания, средняя панель: сокращение). Нижняя панель получена вычитанием верхний и средний панелей, при этом большинство существенных отличий, появляющихся в виде черных или белых (наконечниками). Шкала бар:. 250 мкм <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54308/54308fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54308/54308fig2large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54308/54308fig2large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/54308/54308fig3.jpg" /> Рис . 3: иммунноокрашивания для сердечного тропонина Т в дифференцированной hPSCs На 17 -й день, большинство клеток являются позитивными для сердечного тропонина Т с помощью проточной цитометрии (заполняется гистограмма). Также показаны клетки окрашивали только вторичным антителом (незаполненными гистограмма). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54308/54308fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54308/54308fig3large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54308/54308fig3large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Aggregate Size Optimization in Microwells for Suspension-based Cardiac Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Aggregate Size Optimization in Microwells for Suspension-based Cardiac Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells

Обычные методы для инициирования Суспензия на основе совокупного сердечной дифференциацию человеческих плюрипотентных клеток (стебли hPSCs) являются сталкивалась с культурой гетерогенности по отношению к совокупной форме и размеру. Здесь мы опишем надежный метод для сердечной дифференциации с использованием миропланшет генерировать размер контролируемых HPSC агрегатов культивируют в условиях, способствующих сердечных.

Совокупный размер Оптимизация в Микролунки, для подвески на основе сердечной дифференциации человеческого плюрипотентные стволовые клетки

Cardiac differentiation of human pluripotent stems cells (hPSCs) is typically carried out in suspension cell aggregates.  Conventional aggregate formation ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

Трафарет Micropatterning человеческих плюрипотентных стволовых клеток для исследования пространственной организации дифференциации Судеб

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Крупномасштабное производство кардиомиоцитов из человеческих плюрипотентных стволовых клеток с использованием высокой воспроизводимостью Малый протокол Дифференциация Molecule на основе

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Быстрое Нейрональная Дифференциация индуцированные плюрипотентные стволовые клетки для измерения сетевой активности на микро-электродных Массивы

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Cells for Myocardial Repair

Плюрипотентных стволовых клеток, полученных клеток сердца для инфарктом Ремонт

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) must be fully differentiated into specific cell types before administration, but conventional protocols for ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Направлено дифференциация примитивные и окончательного гемопоэтических прародителей от человеческих плюрипотентных стволовых клеток

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Дифференциация человека плюрипотентных стволовых клеток в клетки трофобласта

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Быстрое, режиссер дифференциация клеток эпителия сетчатки пигмента от человеческого эмбриона или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Эффективная дифференциация стволовых клеток человека в клетки печени

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

В Vitro поколения Сомит производных от человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Гемогенная дифференциация эндотелия от стволовых клеток человека в Feeder- и Ксено-свободноопределенное состояние

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...