Name: imaging calcium in drosophila at egg activation
Uploaded: 2016-08-06T14:00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation at JoVE.com

ونحن ممتنون لورا بامبتون، أليكس ديفيدسون، ريتشارد بارتون، Arita أتشاريا للحصول على المساعدة أثناء إعداد هذه المخطوطة. ماريانا Wolfner لمناقشة تفعيل البيض. مات ايلاندز لدعم التصوير. ونان هو جين تاو عن الدعم العام في المختبر. وأيد هذا العمل من قبل جامعة كامبريدج، للرماية لTTW [منحة رقم 097814].

ملاحظة: القيام بجميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة ما لم ينص على خلاف ذلك. 1. الاستعداد للتشريح ملاحظة: الخطوات المذكورة هنا هي وفقا للE. Gavis، جامعة برينستون وويل آخرون. آل 18. نفذ الخطوات التالية قبل يومين من التصوير. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خذ قنينة الطيران التي تحتوي على ما يقرب من 10 مل من المواد الغذائية الصلبة وإضافة كمية صغيرة من الخميرة المجففة إلى زاوية واحدة، وأقل من 1 غرام كافية. ملاحظة: للحصول على معلومات حول قارورة ذبابة أو الطعام انظر &quot;الصيانة ذبابة الفاكهة&quot; 19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1-3 قطرات من الماء لترطيب الخميرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين قارورة جانبا في زاوية 45 درجة والسماح 3-5 دقيقة لخميرة لتناول الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن الخميرة يمتص الماء، حدد زجاجة من الذباب معربا عن UASt- MYR GCaMP5 20 يقودها حوض-VP16GAL4 (المشار إليها باسم GCaMP5) التي ظهرت في الآونة الأخيرة (أ myristoyوقد تم اختيار النموذج ذا الصلة من GCaMP5 لتوفير إشارة إلى ارتفاع نسبة الضوضاء من خلال الربط في GECI إلى الغشاء في البيضة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الذباب في زجاجة مع غاز ثاني أكسيد الكربون 2. تأكد للحفاظ على زجاجة المقلوب حتى لا تفقد الذباب في الغذاء الرطب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تلميح الذباب تخدير على وسادة CO 2 ونوع 10-15 إناث و 5 ذكور باستخدام الفرشاة تحت المجهر تشريح. ملاحظة: من هو المعيار ليشمل الذكور إلى الإناث توفير صحية للتشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما القارورة من الخطوة 1.3 جاهزة، إضافة الذباب المحدد إلى القارورة. احرص على إبقاء الأفقي قارورة حتى تصبح الذباب النشطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع القارورة عند 25 درجة مئوية لمدة حوالي 36 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العودة الذباب المتبقية من لوحة CO 2 إلى زجاجة أو تجاهل. </li></ol> 2. تشريح ذبابة الفاكهة المبايض ملاحظة: الخطوات المذكورة هنا هي وفقا للويل وآخرون. الله. <sتصل&gt; 18. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 36 ساعة، تخدير الذباب من القنينة yeasted مع CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم تخدير الذباب داخل القارورة نصيحة لهم على لوحة CO 2 يمكن فرزها مع فرشاة الطلاء تحت المجهر تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار الإناث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل اثنين من المبيضين من الإناث. لبروتوكول مفصلة الكامل نرى ويل آخرون. آل 18. باختصار: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطرة صغيرة من زيت الهالوكربون المؤكسج (سلسلة 95) على رقم 1.5، 22 × 40 مم ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فهم الأنثى مع ملقط في الجزء الأمامي من البطن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد الأنثى تحت المجهر تشريح، استخدم مجموعة ثانية من ملقط لإزالة بلطف الخلفي من الإناث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمحو النسيج الخلفي من ملقط الثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضغط على تجويف البطن مع ملقط الثانية من الجزء الأمامي إلى الخلفي من البطن. يجب المبايض مبهمة اثنين التمسك ملقط عند الخروج من الاناثجنيه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمس المبيضين في الزيت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أي نوع من الأنسجة من ملقط من قبل محو ملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر هذه الخطوات (2.4.1 - 2.4.7) للحصول على ثلاثة coverslips، كل المبايض تحتوي على من ذبابة واحدة. </li></ol></li></ol> 3. عزل الأفراد الناضجة البيض <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت المجهر تشريح القياسية مع التكبير المقرر أن 4X، على ساترة الأولى من الخطوة 2.4، فصل اثنين من المبيضين عن طريق تمزيق قناة البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعرض زوج من ملقط مغلقة في وسط المبيض واحد، مع الحرص على عدم ثقب أي غرف البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج التحقيق تشريح القياسية في وسط المبيض بجانب ملقط مغلقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب بلطف التحقيق تشريح عن طريق المبيض نحو القطب الخلفي، حيث توجد البيض نضجا (المرحلة 14 غرف البيض). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 3،1-3،4 2-5 مرات اعتمادا على حجم المبيض وعدد من البيض. ملاحظة: إضافة CO 2 </فرعية&gt; عادة ما يسبب ترسب بويضة واحدة والتي سوف تظهر أكبر مع الزوائد ظهري أثار من البيض أودعت مسبقا. يجب التخلص من هذه البويضة للتصوير لأنه قد تم تفعيلها داخل الأنثى. ملاحظة: من المحتمل أن تفصل بسهولة من النسيج الضام المبيض البيض الناضجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لم يكن هناك البيض نضجا مرئية خارج المبيض، ومواصلة بلطف إغاظة مع لجنة التحقيق تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة البيض نضجا واضحة على ساترة خارج المبيض، والمناورة 3-5 في خط في وسط ساترة. ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، قم بتشغيل التحقيق بلطف على طول الجانب من البيض. ملاحظة: تجنب سحب على الزوائد الظهرية وهذا يمكن أن يؤدي إلى تلف البيض. ملاحظة: اعتمادا على التصوير في المستقبل انشاء، محاذاة البيض حوالي 200 ميكرون وبصرف النظر عمودي على ساترة لمنطقة التصوير القصوى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة الانحياز، وإزالة ما تبقى من أنسجة المبيض عن طريق سحبه بعيدا عن البيض الانحياز استخدام وorceps. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الزيت الزائد بواسطة اللمس مع زاوية مسح لفحص طبي. يجب الحرص على عدم لمس البيض ناضجة مع الطبية مسح البيض الناضجة التي يتم الاتصال بها سوف تضيع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم التقاطع على ساترة مع علامة لتبسيط تحديد العينة تحت المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين ساترة في مكان آمن وترك الدوائر البيض مستعدة على ساترة للراحة لمدة 5-10 دقائق. وهذا يسمح للبيضة ليستقر في مجال النفط. عينات يمكن استخدام ما يصل إلى 1 ساعة بعد تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 3،1-3،11 لبقية لل coverslips مع المبايض عليها. </li></ol> 4. إعداد للتصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جلب عازلة تفعيل استعداد 15 إلى درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: عازلة التنشيط هو العازلة منخفض التوتر: 3.3 ملي ناه 2 ص 4، 16.6 ملي KH 2 PO 4، 10 مم كلوريد الصوديوم، و 50 ملي بوكل، 5٪ البولي ايثيلين جلايكول 8000، 2 مم CaCl 2، جلبت لدرجة الحموضة 6.4 مع 1: 5 نسبة هيدروكسيد الصوديوم: KOH.لمزيد من المعلومات راجع Mahowald، 1983 15. أجزاء مأخوذة من العازلة التنشيط يمكن تخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة أشهر، وعند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية نقل coverslips مستعدة العازلة التنشيط والماصات الزجاجية إلى مرفق التصوير. ملاحظة: A-حقل واسع، متحد، القرص الغزل أو ضوء المجهر ورقة يمكن استخدامها. نحن نوصي باستخدام مجهر مقلوب. وقد تم الحصول على نتائجنا تمثيلية باستخدام مجهر متحد البؤر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي اختيار هدف مناسب لتصوير البويضة الناضجة بأكمله (هنا: 20X 0.7 NA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركيب أول ساترة المعدة إلى المرحلة المجهر. الحرص على عدم كسر لل coverslips على المسرح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نوعيا تحديد مجال الرؤية مع غرفة بيضة ناضجة من أجل التنشيط. لا صورة ثقب غرف البيض أو تلك مع blebbing في الغشاء. ملاحظة: للحصول على خطوات 4،6-4،7، وأوامر البرنامج تختلف تبعا المجهر والشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين الفقرة التصويرمتر عن الإثارة القياسية GFP (488 نانومتر) والانبعاثات (500-580 نانومتر). كذلك وضعت وجهة نظر مشرق الميدان من أجل رؤية وتوجيه البويضة الناضجة والنفط النازحين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار أقل Z-الطائرة حيث البيض نضجا واضحة ووضع كامل Z-كومة الواجب اتخاذها لمدة 40 ميكرون في ما يقرب من 2 ميكرون لكل خطوة. تعيين المعلمات حتى لا يكون هناك أي تأخير بين اكتساب Z-المكدس. تعيين سلسلة من الوقت لالتقاط ما يقرب من 30 دقيقة. </li></ol> تفعيل 5. التصوير فيفو السابقين البيض <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء التقاط الصور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتظر 1-2 كامل Z-المداخن التي سيتم اكتسابها. وهذا يدل على البويضة الناضجة قبل التنشيط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب ما يقرب من 300 ميكرولتر من العازلة التنشيط إلى ماصة الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد المواقع غيض من ماصة زجاجية تحتوي عازلة تفعيل بزاوية 45 درجة فوق ساترة، تتحرك ببطء ماصة في مسار الشعاع حتى يتم مباشرة فوق البويضة الناضجة التي يجري تصويرها. ماصة الزجاج ينبغييكون 1-2 سم فوق الزيت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1-2 قطرات من العازلة التنشيط في أقل من 5 ثوان من ماصة الزجاج. وهذا ينبغي أن تحل محل النفط. تجنب إضافة عازلة تفعيل الزائد أو لمس البيض مع ماصة الزجاج لأنها يمكن أن تسبب تشريد البويضة الناضجة. والحرص على عدم لمس ساترة مع ماصة وهذا يمكن أن يؤدي إلى تغيير في الطائرة أو فقاعات الهواء التنسيق لتشكيل في مجال النفط الغمر بين الهدف وساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين مضيفا عازلة تفعيل خلال الحصول على الصور، والتحقق من قناة مشرق الميدان للتأكد من أن النفط قد نزحوا من المنطقة العازلة التنشيط. ملاحظة: سوف تظهر هذه الجملة لأول مرة كما ظل بسبب ماصة كسر مسار الشعاع ولكن سوف يؤدي أيضا إلى ظهور قطرات النفط الصغيرة. يمكن أن تبقى بعض قطرات النفط المرتبطة البويضة الناضجة التي سوف تؤثر على النتائج التجريبية وجودة الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لم يتم النازحين النفط من إضافة الأولية من تكرار عازلة تفعيل الخطوات 5،4-50.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد النازحين النفط بنجاح، والسماح للسلاسل الزمنية لتشغيل حتى الانتهاء. ملاحظة: نظرا لتورم من البويضات في التنشيط، وبعض الدوائر البيض تتحرك بشكل كبير من المستوى البؤري أو مجال الرؤية على إضافة عازلة التنشيط. في هذا الوضع، والتوقف عن اقتناء وتركيب ساترة المقبلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد اكتمال تسلسل الحصول على الصور، وحفظ البيانات. </li></ol> 6. بعد اكتساب معالجة الصور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح مجموعة البيانات باستخدام فيجي (http://fiji.sc/Downloads#Fiji)، أو ما يعادلها برامج معالجة الصور، وحدد الملفات ذات الصلة لتحليلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لبناء الإسقاط من البيانات التي حصل عليها تحديد: صورة&gt; الأكوام&gt; Z المشروع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد بداية Z-شريحة ووقف Z-شريحة، وعادة الفرع بأكمله. اختر نوع الإسقاط، عادة لمجموعة &#39;كثافة ماكس &quot;. خانة علامة &#39;كل الأطر الزمنية &quot;لتطبيق الإعدادات المحددة إلى سلسلة كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذاوقد تم تصوير أكثر من قناة واحدة الفلورسنت، استخدم أداة القنوات لتمكين التنقل بين الألوان، وجعل المركبة، أو جعل الرمادي صورة. صورة مختارة&gt; الألوان&gt; القنوات الأداة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لضبط سطوع الصورة وعلى النقيض اختر صورة&gt; ضبط&gt; السطوع / التباين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتصدير صورة واحدة، نقل المنزلق الزمني لإطار ذات الصلة، وحدد ملف&gt; حفظ باسم&gt; الحياة السياسية في فرنسا، أو أي شكل المفضل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار موقع وعنوان الملف الذي تم تصديره، ثم حفظ. سوف نلاحظ معدل الإطار من برامج التصوير تكون هناك حاجة لإعطاء الطابع الزمني على الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصدير سلسلة زمنية كفيلم حدد: ملف&gt; حفظ باسم&gt; AVI، ثم حدد معدل الإطار (~ 7 إطارات في الثانية الواحدة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار موقع وعنوان الملف الذي تم تصديره، ثم حفظ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحفظ الملف المعدل في شكل فيجي، حدد ملف&gt; حفظ. </li></ol>

<ol>
	<li>Stricker, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+biology+of+calcium+signaling+during+fertilization+and+egg+activation+in+animals.">Comparative biology of calcium signaling during fertilization and egg activation in animals.</a> Dev Biol. 211 (2), 157-176 (1999).</li><li>Horner, V. L., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transitioning+from+egg+to+embryo:+triggers+and+mechanisms+of+egg+activation.">Transitioning from egg to embryo: triggers and mechanisms of egg activation.</a> Dev Dyn. 237 (3), 527-544 (2008).</li><li>Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+free+calcium+wave+traverses+the+activating+egg+of+the+medaka,+Oryzias+latipes.">A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes.</a> J Chem Biol. 76 (2), 448-466 (1978).</li><li>Fujiwara, T., Nakada, K., Shirakawa, H., Miyazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+inositol+trisphosphate-induced+calcium+release+mechanism+during+maturation+of+hamster+oocytes.">Development of inositol trisphosphate-induced calcium release mechanism during maturation of hamster oocytes.</a> Dev Biol. 156 (1), 69-79 (1993).</li><li>Hafner, M., Petzelt, C., Nobiling, R., Pawley, J. B., Kramp, D., Schatten, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wave+of+free+calcium+at+fertilization+in+the+sea+urchin+egg+visualized+with+fura-2.">Wave of free calcium at fertilization in the sea urchin egg visualized with fura-2.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 9 (3), 271-277 (1988).</li><li>Fontanilla, R. A., Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+sperm-induced+calcium+wave+in+Xenopus+eggs+using+confocal+microscopy.">Characterization of the sperm-induced calcium wave in Xenopus eggs using confocal microscopy.</a> Biophys J. 75 (4), 2079-2087 (1998).</li><li>Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+Ca2++indicators:+using+genetics+and+molecular+design+to+understand+complex+physiology.">Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology.</a> J Physiol. 578, 55-67 (2007).</li><li>Douglass, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> New Techniques in Systems Neuroscience. , (2015).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging.">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li><li>Chen, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Wang, J., Wong, A., Flores, J., Vosshall, L., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain.">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112 (2), 271-282 (2003).</li><li>Kaneuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+waves+occur+as+Drosophila+oocytes+activate.">Calcium waves occur as Drosophila oocytes activate.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 791-796 (2015).</li><li>York-Andersen, A. H., Parton, R. M., Bi, C. J., Bromley, C. L., Davis, I., Weil, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+and+rapid+calcium+wave+at+egg+activation+in+Drosophila.">A single and rapid calcium wave at egg activation in Drosophila.</a> Biol Open. 4 (4), 553-560 (2015).</li><li>Mahowald, A. P., Goralski, T. J., Caulton, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+activation+of+Drosophila+eggs.">In vitro activation of Drosophila eggs.</a> Dev Biol. 98 (2), 437-445 (1983).</li><li>Page, A. W., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+meiotic+divisions+in+Drosophila+oocytes.">Activation of the meiotic divisions in Drosophila oocytes.</a> Dev Biol. 183 (2), 195-207 (1997).</li><li>Horner, V. L., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stimulation+by+osmotic+and+hydrostatic+pressure+activates+Drosophila+oocytes+in+vitro+in+a+calcium-dependent+manner.">Mechanical stimulation by osmotic and hydrostatic pressure activates Drosophila oocytes in vitro in a calcium-dependent manner.</a> Dev Biol. 316 (1), 100-109 (2008).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging.">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> J Vis Exp. (60), (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essentials+of+Biology+1:+yeast,+Drosophila+and+C.+elegans.+Drosophila+Maintenance.">Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila Maintenance.</a> JoVE Science Education Database. , (2016).</li><li>Melom, J. E., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+a+NCKX+Eliminates+Glial+Microdomain+Calcium+Oscillations+and+Enhances+Seizure+Susceptibility.">Mutation of a NCKX Eliminates Glial Microdomain Calcium Oscillations and Enhances Seizure Susceptibility.</a> J Neurosci. 33 (3), 1169-1178 (2013).</li><li>Munro, E., Nance, J., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+flows+powered+by+asymmetrical+contraction+transport+PAR+proteins+to+establish+and+maintain+anterior-posterior+polarity+in+the+early+C.+elegans+embryo.">Cortical flows powered by asymmetrical contraction transport PAR proteins to establish and maintain anterior-posterior polarity in the early C. elegans embryo.</a> Dev Cell. 7 (3), 413-424 (2004).</li><li>Maruyama, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGG-3+regulates+cell-surface+and+cortex+rearrangements+during+egg+activation+in+Caenorhabditis+elegans.">EGG-3 regulates cell-surface and cortex rearrangements during egg activation in Caenorhabditis elegans.</a> Curr Biol. 17 (18), 1555-1560 (2007).</li><li>Wong, G. K., Woods, M. A., Szymczak, R. K., Gavlik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+normal+actin+cytoskeletal+reorganization+affects+cell+cycle+time+in+fertilized+sea+urchin+eggs.">Disruption of normal actin cytoskeletal reorganization affects cell cycle time in fertilized sea urchin eggs.</a> Mol Biol Cell. 15, 23 (2004).</li><li>Horner, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+calcipressin+sarah+is+required+for+several+aspects+of+egg+activation.">The Drosophila calcipressin sarah is required for several aspects of egg activation.</a> Curr Biol. 16 (14), 1441-1446 (2006).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

The first critical step in this protocol is isolating the mature eggs without damage. This can be achieved by gentile maneuvering of the eggs with the dissecting probe. Practice will enable this manipulation to be executed without damage to the eggs. A second crucial step is avoiding the loss of the sample when activation buffer is applied to the mature egg in oil. Application of the activation buffer should be done slowly and without contact with the coverslip. This step can be challenging if the microscope set-up does not allow for an easy access to the sample. Moving axillary parts of the microscope, such as a temperature incubator, is advisable. 
Modifications to this protocol can be made in order to visualize other fluorescently tagged factors, instead of Ca2+ at egg activation. More generally, different stages of Drosophila development or the results of adding a different buffer could be analyzed using this protocol. 
Troubleshooting may be required if the settings on the microscope are not optimal for visualizing the signal from the sample. This can be achieved by increasing or decreasing the laser power, altering capture range and adjusting the Z-stack parameters. Another issue might be eggs consistently moving out of the field of view upon the addition of activation buffer. If this happens regularly, allow the mature eggs to settle on the coverslips for a longer period of time, 15 to 20 minutes. Beware that using a higher viscosity oil will alter the displacement of the oil by activation buffer. 
This technique presented here is limited by the working distance of the objective, dehydration of the mature eggs and the ability to dissect the mature eggs without damage. However, when compared to in vivo imaging methods where the mature oocyte passes through the adult female and is deposited 13, our method enables more spatial resolution, the option to physically manipulate the mature egg before activation and the ability to test the role of egg activation without fertilization. 
There are many potential future applications of this technique, including testing reporter constructs for cellular components at egg activation and visualizing the Ca2+ wave in mutant backgrounds 14,24. Together with experimental and genetic tools, the ex vivo egg activation assay presented here enables the study of the trigger, propagation and downstream effects of the universally conserved Ca2+ wave.

أي تغيير في الكالسيوم داخل الخلايا 2+ تركيز على البيض (البويضة) تفعيل عنصرا المحافظ في جميع الكائنات درس 1،2. هذا الحدث يبدأ مجموعة واسعة من العمليات معتمد على الكالسيوم 2+، بما في ذلك استئناف دورة الخلية وترجمة من mRNAs المخزنة. وكان نتيجة لهذا الشرط ل Ca 2+، تصور التغييرات عابرة في الخلايا تركيزات الكالسيوم 2+ من الفائدة الرئيسية. تاريخيا، تم اختيار الكائنات نموذج للدراسات على تفعيل البيض على أساس حجم ومدى توافر بيضها. وقد تم استخدام نهج التصور المختلفة لمتابعة وقياس التغيرات في الكالسيوم داخل الخلايا 2+ التركيزات في هذه الأنظمة، بما في ذلك: aequorin photoprotein في الأسماك الميداكا 3؛ كاليفورنيا الأصباغ الفلورية الحساسة 2+ مثل FURA-2 في قنفذ البحر والهامستر 4،5. والكالسيوم الأخضر-1-ديكستران في القيطم 6. حولت توليد وتحسين مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs) القدرة على تصور كا 2+ ديناميكية في الجسم الحي 7. يتم التعبير عن هذه التركيبات الوراثية في أنسجة معينة وتحد من الحاجة إلى الاستعدادات الأنسجة الغازية 8. GCaMPs هي بروتين فلوري (GFP) فئة المستندة الخضراء GECIs التي كانت فعالة جدا بسبب بهم عالية الكالسيوم 2+ تقارب، نسبة الإشارة إلى الضوضاء والقدرة على تخصيص 9-11. في وجود الكالسيوم 2+، مجمع GCaMP يخضع لسلسلة من التغييرات متعلق بتكوين، بدءا من الربط من الكالسيوم 2+ لكالمودولين، أن النتائج في زيادة كثافة الفلورسنت من عنصر GFP 9. وقد استخدمت GCaMPs نطاق واسع في الأبحاث على الخلايا العصبية ذبابة الفاكهة لرؤية التغييرات في الكالسيوم داخل الخلايا 12. في تطبيق والأخيرةعلى التكنولوجيا GCaMP لتصور كا 2+ في البيض ذبابة الفاكهة الناضجة قد كشفت عن وجود واحدة عابرة الكالسيوم 2+ موجة في تنشيط البويضة 13،14. يمكن تصور موجة الكالسيوم 2+ في تضخم منخفض خلال الإباضة في الجسم الحي 13 أو في أعلى التكبير باستخدام المجراة سابقا تفعيل الفحص 13،14. في مقايسة خارج الجسم، يتم عزل البويضات الناضجة من المبيض الفردية وتفعيلها باستخدام محلول منخفض التوتر، ويشار إلى عازلة التنشيط، وهو ما ثبت لتلخيص أحداث في الجسم الحي تفعيل 15-17. هذا الاختبار خارج الحي تمكن من السهل عالية الدقة تصور كا 2+ موجة تحت ظروف تجريبية مختلفة بما في ذلك تعطيل الدوائية، التلاعب المادية والمسوخ الوراثية. توضح هذه المقالة إعداد البيض ذبابة الفاكهة الناضجة لالسابقين تنشيط الجسم الحي والعشرينالبريد المجهري لاحقة تستخدم لتصور موجة الكالسيوم 2+ باستخدام GCaMP. هذا النهج يمكن استخدامها لاختبار بدء والسيطرة على موجة الكالسيوم 2+ وتحقيق النتائج النهائية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="999">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dry active yeast</td>
			<td style="width:373px;">Fleischman&#8217;s</td>
			<td style="width:243px;">#2192</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>Various will work</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lamp</td>
			<td>Mircotec Fibre optic</td>
			<td>MF0-90</td>
			<td>Various will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Medical wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Corporation</td>
			<td>KLEW3020&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Marker pen</td>
			<td>Stabilo</td>
			<td>841/46</td>
			<td>OHPen universal, black - available in most stationary shops. Superfine Width 0.4mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CO2 pad</td>
			<td>&#160;Genesee Scientific</td>
			<td>59-114 (789060 Dutscher)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slip No. 1.5, 22 x 50mm</td>
			<td>International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm</td>
			<td>Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" rowspan="2" style="height:40px;">Halocarbon oil, series 95</td>
			<td rowspan="2">Halocarbon Products Corp.</td>
			<td>Distributor in Europe:</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Solvadis (GMBH)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oil 10 S</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td align="right">24627.188</td>
			<td>Can be used instead of Halocarbon oil, series 95</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>Whilst these tool should be clean, use of an autoclave is not necessary, ethanol would be sufficient.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Probe</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10140-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass pipette</td>
			<td>Fisherbrand,</td>
			<td>FB50251</td>
			<td>Pasteur Pipettes, glass, unplugged, 150mm length&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vial</td>
			<td style="width:373px;">Regina Industries</td>
			<td style="width:243px;">P1014</td>
			<td>GPPS&#160; 80mm x 25mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging calcium in drosophila at egg activation

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a 'Ca2+ wave'. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.

هنا لقد أثبتنا كيفية تحضير البيض ذبابة الفاكهة الناضجة لتفعيل خارج الحي. البيض تعبر عن GECI تمكين التصوير من الكالسيوم 2+ ديناميكية في تنشيط البويضة وبداية التطور الجنيني (الشكل 1). وتجدر الإشارة إلى أن الاعتماد على GCaMP المستخدمة، وتحديدا وجود مجموعة myristoyl، قد يكون لها نتائج اختلافات نوعية طفيفة 13 14. لقد أثبتنا أيضا دور للالأكتين وظيفية خلال تفعيل البيض من خلال إضافة المانع من بلمرة الأكتين، مثبط حركة الخلايا D، إلى المخزن المؤقت تفعيل (الشكل 2) 14. وحفظها ومتطلبات الهيكل الخلوي في تنشيط البويضة. في C. ايليجانس بعد الإخصاب، وإعادة تنظيم مكونات هيكل الخلية لإعداد الجنين خلية واحدة لدوري الدرجة الاولى غير متناظرة 21،22. في قنفذ البحر وانقطاع cytoskeleوقد تبين التل إعادة تنظيم التالية تفعيل تؤثر على دورة الخلية عن طريق منع مقلص تشكيل حلقة 23. يبقى دور الأكتين في التوسط موجة الكالسيوم 2+ وظيفة المصب لها في تفعيل البيض في ذبابة الفاكهة إلى أن توضح تماما. في ذبابة الفاكهة، وشارك في تصور كا 2+ موجة والأكتين الهيكل الخلوي يمكن تحقيقه باستخدام هذا خارج الحي تفعيل الفحص. سلسلة زمنية من قنوات متعددة يمكن الحصول عليها وديناميات الكالسيوم داخل الخلايا 2+ يمكن أن تتطابق مع التغييرات في المؤسسة الأكتين في البويضة (الشكل 3). <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig1.jpg" /> الشكل 1: واحدة الكالسيوم 2+ موجة في سلسلة ذبابة الفاكهة البيض وقت التنشيط من خارج الحي تنضج ذبابة الفاكهة البيض معربا عن UASt- myrGCaMP5 بعد لddition العازلة تفعيل (ه). ارتفاع الكالسيوم حشوية 2+ ينشأ في القطب الخلفي (B) ويكاثر (BF) مع سرعة متوسط ​​ما يقرب من 1.5 ميكرون / ثانية. وعادة ما لوحظ بدء موجة بعد 3 دقائق من إضافة العازلة التنشيط. بعد التنشيط، ومستويات الكالسيوم داخل الخلايا من البويضة الناضجة ترجع إلى ما قبل تفعيل مستويات (G، H). رؤية فيلم التكميلي 1 (مجموع الوقت 33 دقيقة). الحانات النطاق = 50 ميكرون. ماكس الإسقاط = 40 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig2.jpg" /> الشكل 2: إضافة مثبط حركة الخلايا D لتنشيط العازلة يشوش كاليفورنيا2+ انتشار الموجات. السلاسل الزمنية من خارج الحي تنضج ذبابة الفاكهة البيض معربا عن UASt- myrGCaMP5 التالية إضافة عازلة تفعيل تحتوي على 10 ميكروغرام / مل مثبط حركة الخلايا D التركيز النهائي (ه). في حين يتم بدء 2+ موجة الكالسيوم في القطب الخلفي (A)، وخطر ذلك ولا تصل الأمامي من البيضة (F) (السهام البيضاء للدلالة على جبهة الموجة). أبعد وقد لوحظت تغييرات الكالسيوم 2+ أكثر من 30 دقيقة). رؤية فيلم التكميلي 2 (مجموع الوقت 30 دقيقة). الحانات النطاق = 50 ميكرون. ماكس الإسقاط = 40 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig3.jpg" /> الشكل (3): شارك في التصور أكتين والكالسيوم 2+ في Eتفعيل زز في سلسلة ذبابة الفاكهة. وقت خارج الحي تنضج ذبابة الفاكهة البيض معربا عن UASt- myrGCaMP5 (سماوي) وUASp -F-Tractin.tdTomato (أرجواني) بعد إضافة عازلة تفعيل (ه). و2+ موجة الكالسيوم يبادر من القطب الخلفي وتسترد كما في الشكل 1. يبدو أكتين أن تغيير مع مرور الوقت، السهام البيضاء (A مباراة H). ومن المقرر أن تنقل العينة أثناء التقاط الصور لعدم وجود الكالسيوم 2+ الكشف عن إشارة في وسط البويضة الناضجة. الحانات النطاق = 50 ميكرون. ماكس الإسقاط = 40 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation at JoVE.com

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

توضح هذه المقالة بروتوكول تكيف خارج الحي لتصور كا 2+ خلال تفعيل البيض في ذبابة الفاكهة.

التصوير الكالسيوم في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; في تنشيط البيض

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

يعيش التصوير لل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; العذراء العين

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

التصوير تستقيم من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; غرف البيض

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

تتبع الخلايا في الزرد-GFP المعدلة وراثيا باستخدام نظام Photoconvertible PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

طرق لفحص الليمفاوية الغدة وHemocytes في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; يرقات

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

في فيفو تصوير Morphogenesis وتر العضلات في المورفولوجية الخوادر

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

تحليل ديناميات Actomyosin في جداول الخلوية والأنسجة المحلية باستخدام أفلام الفاصل الزمني من غرف البيض Drosophila المستزرعة

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

التصوير الحي وتحليل تقلصات العضلات في جنين دروسوفيلا

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

ذوبان الجليد واستزراع كريوبريسيرفينج خطوط الخلايا المورفولوجية

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

تصوير الكالسيوم الفلوري والتهجين في الموقع اللاحق لتوصيف السلائف العصبية في زينوبوس laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

التصوير داخل النواة أكتين رودز في الحرارة الحية وشدد الأجنة Drosophila

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...