Name: imaging calcium in drosophila at egg activation
Uploaded: 2016-08-06T14:00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation at JoVE.com

Vi er taknemmelige for Laura Bampton, Alex Davidson, Richard Parton, Arita Acharya for hjælp under udarbejdelsen af ​​dette manuskript; Mariana Wolfner for diskussioner om æg aktivering; Matt Wayland for billeddannelse støtte; og Nan Hu for generel støtte i laboratoriet. Dette arbejde blev støttet af University of Cambridge, ISSF til TTW [tilskud nummer 097.814].

Bemærk: Foretag alle trin ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet. 1. Forberedelse til Dissection Bemærk: De beskrevne trin er i overensstemmelse med E. Gavis, Princeton University &amp; Weil et. al. 18. Udfør følgende trin to dage før billeddannelse. <ol><li> Tag en flue hætteglas indeholdende ca. 10 ml fast føde og tilføje en lille mængde af tørret gær til det ene hjørne, mindre end 1 g er tilstrækkelig. Bemærk: Oplysninger om flyve hætteglas eller mad se &#39;Drosophila Vedligeholdelse «19. </li><li> Tilsæt 1 - 3 dråber vand til hydratisering af gær. </li><li> Sæt hætteglasset til side i en 45 ° vinkel og tillade 3 - 5 min i gær til at optage vand. </li><li> Mens gæren absorbere vandet, skal du vælge en flaske fluer, der udtrykker UASt- myr GCaMP5 20 drevet af kar-VP16GAL4 (benævnt GCaMP5), der for nylig opstået (en myristoynes form GCaMP5 blev valgt for at tilvejebringe et højt signal-støjforhold gennem tøjring af GECI til membranen i ægget). </li><li> Bedøve fluerne i flasken med CO2-gas. Sørg for at holde flasken omvendt for ikke at miste fluer i vådfoder. </li><li> Tip bedøvede fluer på en CO 2 pad og sortering 10 - 15 hunner og 5 hanner bruger pensel under et dissektionsmikroskop. Bemærk: Det er standard at omfatte mænd til at give raske kvinder til dissektion. </li><li> Når hætteglasset fra trin 1.3 er klar tilføje specifikke fluer til hætteglasset. Vær omhyggelig med at holde hætteglasset vandret indtil fluerne bliver aktive. </li><li> Placer hætteglasset ved 25 ° C i cirka 36 timer. </li><li> Retur de resterende fluer fra CO 2 pad til flasken eller discard. </li></ol> 2. Dissecting Drosophila ovarier Bemærk: De beskrevne trin er i overensstemmelse med Weil et. al. <sop&gt; 18. <ol><li> Efter 36 timer, bedøve fluerne fra yeasted hætteglas med CO 2. </li><li> Når fluer inde i hætteglasset bedøves tip dem på CO 2 puden skal sorteres med en pensel under et dissektionsmikroskop. </li><li> Vælg en kvinde. </li><li> Isoler de to æggestokke fra den kvindelige. For fuld detaljeret protokol se Weil et. al. 18. Sammenfattende: <ol><li> Placer en lille dråbe iltet halogencarbon olie (serie 95) på en nr 1,5, 22 x 40 mm dækglas. </li><li> Tag fat i kvinder med pincet ved den forreste af maven. </li><li> Hold kvindelige under dissektionsmikroskop, bruge det andet sæt af pincet til forsigtigt at fjerne den bageste af den kvindelige. </li><li> Tør den bageste væv fra den anden pincet. </li><li> Klem på maven hulrum med det andet pincet fra den forreste til den bageste af maven. De to uigennemsigtige æggestokke bør holde sig til tangen, når uden for FEMAle. </li><li> Berør æggestokkene i olien. </li><li> Fjerne eventuelle væv fra tangen ved aftørring tangen. </li><li> Gentag disse trin (2.4.1 - 2.4.7) for at opnå tre dækglas, hver indeholdende æggestokke fra en flue. </li></ol></li></ol> 3. Isolering Individuel modne æg <ol><li> Under en standard dissektionsmikroskop med forstørrelsen indstillet til 4X, på den første dækglas fra trin 2.4, adskille de to æggestokke ved at rive æggelederen. </li><li> Indføre et par lukkede pincet ind i midten af ​​en enkelt æggestok, pas på ikke at punktere eventuelle æg kamre. </li><li> Indsæt en standard dissekere sonde ind i midten af ​​ovariet ud for de lukkede pincet. </li><li> Træk forsigtigt dissekere sonde gennem æggestok mod bageste pol, hvor de modne æg (fase 14 æg kamre) er placeret. </li><li> Gentag trin 3.1 - 3.4 2. - 5. gange afhængigt af størrelsen af ​​ovariet og antallet af æg. Bemærk: Tilsætning af CO 2 </sub&gt; typisk forårsager aflejring af et enkelt æg, som vil blive vist større med hævede dorsale vedhæng end prædeponeret æg. Dette æg skal kasseres til billeddannelse, da det allerede er blevet aktiveret inde i hunnen. Bemærk: modne æg sandsynligvis let at adskille fra æggestokkene bindevæv. </li><li> Hvis der ikke modne æg er synlige uden i æggestokkene, fortsætte forsigtigt drille med dissekere sonden. </li><li> Når de modne æg er synlige på dækglasset uden i æggestokkene, manøvrere 3 - 5 i en linje i midten af ​​dækglasset. Bemærk: For det bedste resultat, køre sonden forsigtigt langs siden af ​​æggene. Bemærk: Undgå at trække i dorsale vedhæng, da dette kan beskadige ægget. Bemærk: Afhængigt af den fremtidige imaging opsætning, justere æggene ca. 200 um fra hinanden vinkelret på dækglasset for maksimal imaging område. </li><li> Når den er sidestillet, fjerne resten af ​​ovarievævet ved at trække den væk fra de flugtende æg ved hjælp af forceps. </li><li> Fjern overskydende olie ved duppe med hjørnet af en medicinsk serviet. Pas på ikke at røre ved de modne æg med den medicinske tørre så modne æg, der er kontaktet, vil blive tabt. </li><li> Tegn et trådkors på dækglasset med en markør for at forenkle placere prøven under mikroskop. </li><li> Sæt dækglasset på et sikkert sted og lad den forberedte æg kamre på dækglasset for at hvile i 5 - 10 min. Dette giver mulighed for ægget at bosætte sig i olien. Prøverne kan anvendes op til 1 time efter dissektion. </li><li> Gentag trin 3.1 - 3.11 for resten af ​​dækglassene med æggestokke på dem. </li></ol> 4. Forberedelse til Imaging <ol><li> Bring forberedt aktivering buffer 15 til stuetemperatur. Bemærk: Aktivering buffer er en hypotonisk puffer: 3,3 mM NaH 2 PO4, 16,6 mM KH 2 PO 4, 10 mM NaCl, 50 mM KCI, 5% polyethylenglycol 8.000, 2 mM CaCl2, bragt til pH 6,4 med en 1: 5-forhold af NaOH: KOH.For mere information se Mahowald, 1983 15. Prøver af aktivering buffer kan opbevares ved -20 ° C i flere måneder, og ved 4 ° C i op til 2 uger. </li><li> transportere omhyggeligt tilberedte dækglas, aktivering buffer og glas pipetter til imaging facilitet. Bemærk: Der kan anvendes en bred-felt, konfokal, spinning disc eller lys ark mikroskop. Vi anbefaler at bruge et omvendt mikroskop. Vores repræsentative resultater blev opnået under anvendelse af et konfokalt mikroskop. </li><li> En objektiv egnet til afbildning af hele det modne æg bør vælges (her: 20X 0.7 NA). </li><li> Monter første rede dækglas på objektbordet. Pas på ikke at bryde dækglas på scenen. </li><li> Kvalitativt vælge et synsfelt med et modent æg kammer til aktivering. Må ikke billede punkteret æg kamre eller dem med blæredannelse i membranen. Bemærk: For trin 4.6 - 4.7, softwarekommandoer vil variere afhængigt af mikroskop og producent. </li><li> Set imaging parameter for standard GFP excitation (488 nm) og emission (500-580 nm). Også oprette en lys-felt view for at visualisere og orientere modent æg og fordrevne olie. </li><li> Vælg den laveste Z-plan, hvor modne æg er synlige og sætte en fuld Z-stack, der skal tages for 40 pm på ca. 2 um per trin. Indstil parametrene så der er ingen forsinkelse mellem Z-stack erhvervelse. Indstil tiden serien til at fange i ca. 30 min. </li></ol> 5. Imaging Ex Vivo Egg Aktivering <ol><li> Start billedoptagelse. </li><li> Vent 1 - 2 fulde Z-stakke, der skal erhverves. Dette viser den modne æg før aktivering. </li><li> Trække ca. 300 pi aktivering puffer i et glas pipette. </li><li> Placering af spidsen af ​​glaspipette indeholdende aktivering puffer ved en 45 ° vinkel over dækglasset, langsomt bevæge pipetten ind i strålegangen, indtil det er direkte over modent æg, der afbildes. Den glaspipette børvære 1 - 2 cm over olien. </li><li> Tilsæt 1 - 2 dråber aktivering buffer på mindre end 5 sekunder fra glaspipette. Dette skulle fortrænge olien. Undgå at tilføje overskydende aktivering buffer eller røre ægget med glaspipette da det kan forårsage forskydning af modent æg. Pas på ikke at røre ved dækglasset med pipetten, da dette kan medføre en ændring i fokusplanet eller at der dannes luftbobler i fordybelse olie mellem målet og dækglasset. </li><li> Mens tilføje aktivering buffer under erhvervelse billede, tjek den lyse-feltet kanal for at sikre, at olien er blevet fordrevet af aktivering buffer. Bemærk: Dette vil først blive vist som en skygge på grund af pipetten bryde strålen vej, men vil også resultere i fremkomsten af ​​små oliedråber. Nogle små oliedråber kan forblive forbundet med det modne æg, som vil påvirke eksperimentelle resultater og billedkvalitet. </li><li> Hvis olien ikke forskydes fra den indledende tilsætning af aktivering buffer gentage trin 5,4-50,6. </li><li> Når olien er med succes forskudt, give tidsserier til at køre indtil afslutning. Bemærk: På grund hævelse af oocytter ved aktivering, vil nogle æg kamre flytte dramatisk ud af fokusplanet eller synsfelt efter tilsætning af aktivering buffer. I denne situation, stoppe købet og monter næste dækglas. </li><li> Når billedet sekvens har afsluttet købet, gemme data. </li></ol> 6. Post-erhvervelse billedbehandling <ol><li> Åbn datasættet hjælp Fiji (http://fiji.sc/Downloads#Fiji), eller tilsvarende billedbehandling software, og vælg de relevante filer til analyse. </li><li> At opbygge en fremskrivning af de indsamlede data vælge: Image&gt; Stakke&gt; Z-projekt. </li><li> Vælg en start Z-skive og et stop Z-skive, typisk hele afsnittet. Vælg en projektion type, typisk indstillet til &#39;Max Intensitet «. Kontroller afkrydsningsfeltet &#39;All Time Frames&#39; for at anvende de valgte indstillinger til hele serien. </li><li> Hvismere end én fluorescerende kanal er blevet afbildet, bruge Kanaler værktøj til at muliggøre bevægelse mellem farver, lave en sammensat, eller gøre billedet gråtoner. Vælg Image&gt; Farver&gt; Kanaler værktøj. </li><li> For at justere billedets lysstyrke og kontrast vælge Billede&gt; Juster&gt; Lysstyrke / Kontrast. </li><li> For at eksportere et enkelt billede, flytte tidsskala skyderen til relevant ramme og vælge Filer&gt; Gem som&gt; Jpeg, eller enhver foretrukne format. </li><li> Vælg en placering og titel til den eksporterede fil, og gem derefter. Bemærk Rammen sats fra imaging software vil blive forpligtet til at give et tidsstempel på billedet. </li><li> For at eksportere tidsserier som en film vælge: Filer&gt; Gem som&gt; AVI, vælg derefter billedhastighed (~ 7 billeder i sekundet). </li><li> Vælg en placering og titel til den eksporterede fil, og gem derefter. </li><li> Hvis du vil gemme det justerede filen i Fiji-format, skal du vælge Filer&gt; Gem. </li></ol>

<ol>
	<li>Stricker, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+biology+of+calcium+signaling+during+fertilization+and+egg+activation+in+animals.">Comparative biology of calcium signaling during fertilization and egg activation in animals.</a> Dev Biol. 211 (2), 157-176 (1999).</li><li>Horner, V. L., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transitioning+from+egg+to+embryo:+triggers+and+mechanisms+of+egg+activation.">Transitioning from egg to embryo: triggers and mechanisms of egg activation.</a> Dev Dyn. 237 (3), 527-544 (2008).</li><li>Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+free+calcium+wave+traverses+the+activating+egg+of+the+medaka,+Oryzias+latipes.">A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes.</a> J Chem Biol. 76 (2), 448-466 (1978).</li><li>Fujiwara, T., Nakada, K., Shirakawa, H., Miyazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+inositol+trisphosphate-induced+calcium+release+mechanism+during+maturation+of+hamster+oocytes.">Development of inositol trisphosphate-induced calcium release mechanism during maturation of hamster oocytes.</a> Dev Biol. 156 (1), 69-79 (1993).</li><li>Hafner, M., Petzelt, C., Nobiling, R., Pawley, J. B., Kramp, D., Schatten, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wave+of+free+calcium+at+fertilization+in+the+sea+urchin+egg+visualized+with+fura-2.">Wave of free calcium at fertilization in the sea urchin egg visualized with fura-2.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 9 (3), 271-277 (1988).</li><li>Fontanilla, R. A., Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+sperm-induced+calcium+wave+in+Xenopus+eggs+using+confocal+microscopy.">Characterization of the sperm-induced calcium wave in Xenopus eggs using confocal microscopy.</a> Biophys J. 75 (4), 2079-2087 (1998).</li><li>Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+Ca2++indicators:+using+genetics+and+molecular+design+to+understand+complex+physiology.">Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology.</a> J Physiol. 578, 55-67 (2007).</li><li>Douglass, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> New Techniques in Systems Neuroscience. , (2015).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging.">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li><li>Chen, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Wang, J., Wong, A., Flores, J., Vosshall, L., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain.">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112 (2), 271-282 (2003).</li><li>Kaneuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+waves+occur+as+Drosophila+oocytes+activate.">Calcium waves occur as Drosophila oocytes activate.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 791-796 (2015).</li><li>York-Andersen, A. H., Parton, R. M., Bi, C. J., Bromley, C. L., Davis, I., Weil, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+and+rapid+calcium+wave+at+egg+activation+in+Drosophila.">A single and rapid calcium wave at egg activation in Drosophila.</a> Biol Open. 4 (4), 553-560 (2015).</li><li>Mahowald, A. P., Goralski, T. J., Caulton, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+activation+of+Drosophila+eggs.">In vitro activation of Drosophila eggs.</a> Dev Biol. 98 (2), 437-445 (1983).</li><li>Page, A. W., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+meiotic+divisions+in+Drosophila+oocytes.">Activation of the meiotic divisions in Drosophila oocytes.</a> Dev Biol. 183 (2), 195-207 (1997).</li><li>Horner, V. L., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stimulation+by+osmotic+and+hydrostatic+pressure+activates+Drosophila+oocytes+in+vitro+in+a+calcium-dependent+manner.">Mechanical stimulation by osmotic and hydrostatic pressure activates Drosophila oocytes in vitro in a calcium-dependent manner.</a> Dev Biol. 316 (1), 100-109 (2008).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging.">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> J Vis Exp. (60), (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essentials+of+Biology+1:+yeast,+Drosophila+and+C.+elegans.+Drosophila+Maintenance.">Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila Maintenance.</a> JoVE Science Education Database. , (2016).</li><li>Melom, J. E., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+a+NCKX+Eliminates+Glial+Microdomain+Calcium+Oscillations+and+Enhances+Seizure+Susceptibility.">Mutation of a NCKX Eliminates Glial Microdomain Calcium Oscillations and Enhances Seizure Susceptibility.</a> J Neurosci. 33 (3), 1169-1178 (2013).</li><li>Munro, E., Nance, J., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+flows+powered+by+asymmetrical+contraction+transport+PAR+proteins+to+establish+and+maintain+anterior-posterior+polarity+in+the+early+C.+elegans+embryo.">Cortical flows powered by asymmetrical contraction transport PAR proteins to establish and maintain anterior-posterior polarity in the early C. elegans embryo.</a> Dev Cell. 7 (3), 413-424 (2004).</li><li>Maruyama, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGG-3+regulates+cell-surface+and+cortex+rearrangements+during+egg+activation+in+Caenorhabditis+elegans.">EGG-3 regulates cell-surface and cortex rearrangements during egg activation in Caenorhabditis elegans.</a> Curr Biol. 17 (18), 1555-1560 (2007).</li><li>Wong, G. K., Woods, M. A., Szymczak, R. K., Gavlik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+normal+actin+cytoskeletal+reorganization+affects+cell+cycle+time+in+fertilized+sea+urchin+eggs.">Disruption of normal actin cytoskeletal reorganization affects cell cycle time in fertilized sea urchin eggs.</a> Mol Biol Cell. 15, 23 (2004).</li><li>Horner, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+calcipressin+sarah+is+required+for+several+aspects+of+egg+activation.">The Drosophila calcipressin sarah is required for several aspects of egg activation.</a> Curr Biol. 16 (14), 1441-1446 (2006).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

The first critical step in this protocol is isolating the mature eggs without damage. This can be achieved by gentile maneuvering of the eggs with the dissecting probe. Practice will enable this manipulation to be executed without damage to the eggs. A second crucial step is avoiding the loss of the sample when activation buffer is applied to the mature egg in oil. Application of the activation buffer should be done slowly and without contact with the coverslip. This step can be challenging if the microscope set-up does not allow for an easy access to the sample. Moving axillary parts of the microscope, such as a temperature incubator, is advisable. 
Modifications to this protocol can be made in order to visualize other fluorescently tagged factors, instead of Ca2+ at egg activation. More generally, different stages of Drosophila development or the results of adding a different buffer could be analyzed using this protocol. 
Troubleshooting may be required if the settings on the microscope are not optimal for visualizing the signal from the sample. This can be achieved by increasing or decreasing the laser power, altering capture range and adjusting the Z-stack parameters. Another issue might be eggs consistently moving out of the field of view upon the addition of activation buffer. If this happens regularly, allow the mature eggs to settle on the coverslips for a longer period of time, 15 to 20 minutes. Beware that using a higher viscosity oil will alter the displacement of the oil by activation buffer. 
This technique presented here is limited by the working distance of the objective, dehydration of the mature eggs and the ability to dissect the mature eggs without damage. However, when compared to in vivo imaging methods where the mature oocyte passes through the adult female and is deposited 13, our method enables more spatial resolution, the option to physically manipulate the mature egg before activation and the ability to test the role of egg activation without fertilization. 
There are many potential future applications of this technique, including testing reporter constructs for cellular components at egg activation and visualizing the Ca2+ wave in mutant backgrounds 14,24. Together with experimental and genetic tools, the ex vivo egg activation assay presented here enables the study of the trigger, propagation and downstream effects of the universally conserved Ca2+ wave.

En ændring i intracellulær Ca2 + -koncentration på æg (oocyt) aktivering er et konserveret komponent i alle undersøgte organismer 1,2. Denne begivenhed indleder en bred vifte af Ca2 + -afhængige processer, herunder genoptagelse af cellecyklussen og oversættelse af lagrede mRNA&#39;er. På grund af dette krav for Ca 2+, visualisere de forbigående ændringer i intracellulære Ca 2 + koncentrationer har været af afgørende interesse. Historisk set blev modelorganismer udvalgt til undersøgelser af æg aktivering baseret på størrelsen og tilgængeligheden af ​​deres æg. Forskellige visualisering fremgangsmåder er blevet anvendt til at følge og kvantificere ændringer i intracellulær Ca2 + koncentrationer i disse systemer, herunder: fotoproteinet aequorin i Medaka fisk 3; Ca 2 + følsomme fluorescerende farvestoffer såsom Fura-2 i søpindsvin og hamster 4,5; og calcium grøn-1-dextran i Xenopus 6. Frembringelsen og forbedring af genetisk kodede calcium indikatorer (GECIs) har forvandlet den evne til at visualisere Ca 2+ dynamik in vivo 7. Disse genetiske konstruktioner er udtrykt i specifikke væv og begrænse behovet for invasive vævspræparater 8. GCaMPs er et grønt fluorescerende protein (GFP) -baseret klasse af GECIs som har været meget effektive på grund af deres høje Ca2 + affinitet, at signal-til-støj-forhold og kapacitet tilpasses 9-11. I nærvær af Ca2 +, den GCaMP kompleks undergår en række konformationsændringer, startende med bindingen af Ca2 + til calmodulin, der resulterer i en forøget fluorescensintensitet af GFP-komponenten 9. GCaMPs har været flittigt brugt i forskning i Drosophila neuroner til at visualisere ændringer i intracellulær Calcium 12. De seneste applicatipå af GCaMP teknologi til at visualisere Ca2 + i modne Drosophila æg har afsløret en enkelt transient Ca2 + bølge på æg aktivering 13,14. Ca2 + bølge kan visualiseres ved lav forstørrelse under ægløsning in vivo 13 eller ved højere forstørrelse under anvendelse af en ex vivo-aktivering assay 13,14. I ex vivo-assay, der individuelle modne oocytter isoleret fra ovarierne og aktiveres med en hypotonisk opløsning, benævnt aktivering buffer, som er blevet vist at rekapitulere begivenhederne i in vivo-aktivering 15-17. Denne ex vivo-assay muliggør nem høj opløsning visualisering af Ca2 + bølge under forskellige eksperimentelle betingelser, herunder farmakologisk forstyrrelser, fysiske manipulationer og genetiske mutanter. Denne artikel viser fremstillingen af modne Drosophila æg til ex vivo aktivering og the efterfølgende mikroskopi bruges til at visualisere Ca2 + bølge hjælp GCaMP. Denne fremgangsmåde kan anvendes til at teste initiering og kontrol af Ca2 + bølge og til at probe downstream resultater.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="999">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dry active yeast</td>
			<td style="width:373px;">Fleischman&#8217;s</td>
			<td style="width:243px;">#2192</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>Various will work</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lamp</td>
			<td>Mircotec Fibre optic</td>
			<td>MF0-90</td>
			<td>Various will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Medical wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Corporation</td>
			<td>KLEW3020&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Marker pen</td>
			<td>Stabilo</td>
			<td>841/46</td>
			<td>OHPen universal, black - available in most stationary shops. Superfine Width 0.4mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CO2 pad</td>
			<td>&#160;Genesee Scientific</td>
			<td>59-114 (789060 Dutscher)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slip No. 1.5, 22 x 50mm</td>
			<td>International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm</td>
			<td>Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" rowspan="2" style="height:40px;">Halocarbon oil, series 95</td>
			<td rowspan="2">Halocarbon Products Corp.</td>
			<td>Distributor in Europe:</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Solvadis (GMBH)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oil 10 S</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td align="right">24627.188</td>
			<td>Can be used instead of Halocarbon oil, series 95</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>Whilst these tool should be clean, use of an autoclave is not necessary, ethanol would be sufficient.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Probe</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10140-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass pipette</td>
			<td>Fisherbrand,</td>
			<td>FB50251</td>
			<td>Pasteur Pipettes, glass, unplugged, 150mm length&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vial</td>
			<td style="width:373px;">Regina Industries</td>
			<td style="width:243px;">P1014</td>
			<td>GPPS&#160; 80mm x 25mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging calcium in drosophila at egg activation

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a 'Ca2+ wave'. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.

Her har vi vist, hvordan man forbereder modne Drosophila æg til ex vivo aktivering. Æg, der udtrykker en GECI muliggøre billeddannelse af Ca 2 + dynamikker på æg aktivering og begyndelsen af fosterudviklingen (figur 1). Det skal bemærkes, at afhængigt af GCaMP anvendt, specielt tilstedeværelsen af en myristoyl gruppe, kan resultaterne have lette kvalitative forskelle 13 14. Vi har også påvist en rolle for funktionel actin during egg aktivering ved tilsætning af en inhibitor af actinpolymerisation, cytochalasin D, til aktivering buffer (figur 2) 14. Et krav om cytoskelettet på ægget aktivering er bevaret. I C. elegans efter befrugtningen, er cytoskeletale komponenter omorganiseret til at forberede en celle embryon for første asymmetriske division 21,22. I søpindsvin, afbrydelse af cytoskeletal omorganisering efter aktivering har vist sig at påvirke cellecyklussen ved at forhindre kontraktile ringdannelse 23. Stadig at blive fuldstændigt belyst rollen af actin ved mediering en Ca2 + bølge og dens nedstrøms funktion på æg aktivering i Drosophila. I Drosophila, kan co-visualisering af Ca2 + bølge og aktincytoskelettet opnås ved anvendelse af denne ex vivo-aktivering assay. Tidsserier af flere kanaler kan erhverves og dynamik den intracellulære Ca2 + kan matches med ændringer i actin organisation i oocyt (figur 3). <img alt="figur 1" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig1.jpg" /> Figur 1:. A Single Ca 2+ Wave på Drosophila Egg Aktivering Tidsserier af ex vivo modne Drosophila æg udtrykker UASt- myrGCaMP5 efter enddition af aktivering puffer (AH). Stigningen i cytoplasmatiske Ca2 + stammer ved den bageste pol (B) og udbreder (BF) med en gennemsnitlig hastighed på ca. 1,5 um / sek. Indledning af bølgen typisk observeres indenfor 3 minutter efter tilsætning af aktivering buffer. Efter aktivering, de intracellulære calciumniveauer i det modne æg vender tilbage til præ-aktiveringsniveauer (G, H). Se supplerende film 1 (total tid 33 min). Scale barer = 50 um. Max projektion = 40 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig2.jpg" /> Figur 2: Tilsætning af Cytochalasin D til Activation Buffer forstyrrer Ca2+ Wave Formering. Tidsserier af ex vivo modne Drosophila æg udtrykker UASt- myrGCaMP5 efter tilsætning af aktivering buffer indeholdende 10 ug / ml cytochalasin D endelig koncentration (AH). Medens Ca2 + bølge initieres ved den bageste pol (A), er det kompromitteret og ikke når den forreste af ægget (F) (hvide pilespidser angiver forsiden af bølgen). Ingen yderligere Ca2 + ændringer blev observeret i løbet af 30 min). Se supplerende film 2 (total tid 30 min). Scale barer = 50 um. Max projektion = 40 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig3.jpg" /> Figur 3: Co-visualisering af actin og Ca2 + ved Egg Aktivering i Drosophila. Tidsserier af ex vivo modne Drosophila æg udtrykker UASt- myrGCaMP5 (cyan) og UASp -F-Tractin.tdTomato (Magenta) efter tilsætning af aktivering buffer (AH). Ca2 + bølge initierer fra den bageste pol og gendanner som i figur 1. Actin synes at have ændret sig med tiden, hvide pilespidser (A vs H). Manglen på Ca2 + signal detektion i centrum af det modne æg skyldes bevægelse af prøven under billedoptagelse. Scale barer = 50 um. Max projektion = 40 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation at JoVE.com

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Denne artikel beskriver en fleksibel ex vivo protokol for visualisering Ca2 + under æg aktivering i Drosophila.

Imaging Calcium i<em&gt; Drosophila</em&gt; På Egg Aktivering

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Levende-billeddannelse af<em&gt; Drosophila</em&gt; Puppe Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Upright Imaging af<em&gt; Drosophila</em&gt; Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Sporing Celler i GFP-transgene zebrafisk Brug af Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Metoder til at undersøge lymfeknuder kirtel og hæmocytter i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Billeddannelse af muskel-sene morfogenese i Drosophila pupper

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Analyse af Actomyosin dynamik på lokale cellulære og vævs skalaer ved hjælp af time-lapse film af dyrkede Drosophila ægge kamre

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Levende billeddannelse og analyse af muskelsammentrækninger i Drosophila embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Optøning, dyrkning og Cryopreserving Drosophila cellelinjer

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescerende calciumimaging og efterfølgende In Situ Hybridisering for neuronal precursor karakterisering i Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Imaging Intranuclear Actin Stænger i Live Heat Stressed Drosophila Embryoner

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...