Name: imaging calcium in drosophila at egg activation
Uploaded: 2016-08-06T14:00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation at JoVE.com

We zijn dankbaar voor Laura Bampton, Alex Davidson, Richard Parton, Arita Acharya voor hulp tijdens de voorbereiding van dit manuscript; Mariana Wolfner voor discussies op ei activering; Matt Wayland voor imaging-ondersteuning; en Nan Hu algemene steun in het laboratorium. Dit werk werd ondersteund door de Universiteit van Cambridge, ISSF om TTW [subsidie ​​nummer 097.814].

Opmerking: Voer alle stappen bij kamertemperatuur tenzij anders aangegeven. 1. Voorbereidingen voor Dissection Opmerking: De hier beschreven stappen zijn in overeenstemming met E. Gavis, Princeton University &amp; Weil et. al. 18. Voer de volgende stappen twee dagen voor de beeldvorming. <ol><li> Neem een ​​vlieg flacon ongeveer 10 ml vast voedsel en voeg een kleine hoeveelheid gedroogde gist een hoek, minder dan 1 g volstaat. Opmerking: Voor informatie over fly flesjes of voedsel zie &#39;Drosophila Maintenance&#39; 19. </li><li> Voeg 1-3 druppels water de gist hydrateren. </li><li> Zet de flacon opzij in een hoek van 45 ° en laat 3-5 min voor de gist tot het nemen van het water. </li><li> Terwijl de gist wordt het water absorberen, selecteert u een fles vliegen uitdrukken UASt- myr GCaMP5 20 gedreven door bad-VP16GAL4 (aangeduid als GCaMP5) die onlangs zijn ontstaan ​​(een myristoyberekende vorm van de GCaMP5 werd gekozen om een ​​hoge signaal-ruisverhouding met aanbinden de GECI het membraan in het ei). </li><li> Verdoven de vliegen in de fles met CO 2 gas. Zorg ervoor dat u de fles omgekeerd, zodat er geen vliegen te verliezen in het natvoer te houden. </li><li> Tip de verdoofd vliegen op een CO 2 pad en sorteren 10 - 15 vrouwen en 5 mannen met behulp van een penseel onder een dissectie microscoop. Opmerking: Het is standaard om mannetjes aan gezonde vrouwen voor dissectie bevatten. </li><li> Wanneer de flacon uit stap 1.3 is klaar, voeg de geselecteerde vliegen aan de flacon. Zorg ervoor dat de flacon horizontaal te houden totdat de vliegen actief worden. </li><li> Plaats het flesje bij 25 ° C gedurende ongeveer 36 uur. </li><li> De terugkeer van de resterende vliegt van de CO 2 pad naar de fles of discard. </li></ol> 2. Ontleden Drosophila Eierstokken Opmerking: De hier beschreven stappen zijn overeenkomstig Weil et. al. <sup&gt; 18. <ol><li> Na 36 uur, verdoven de vliegen uit de gegiste flacon met CO 2. </li><li> Zodra de vliegen in de flacon worden verdoofd tip hen op de CO 2 pad worden opgelost met een kwast onder een dissectie microscoop. </li><li> Selecteer een vrouw. </li><li> Isoleer beide eierstokken van de vrouw. Voor de volledige gedetailleerd protocol zie Weil et. al. 18. Samengevat: <ol><li> Plaats een kleine daling van zuurstofrijk halogene olie (serie 95) op een No. 1.5, 22 x 40 mm dekglaasje. </li><li> Pak de vrouw met tang op de voorste van de buik. </li><li> Het houden van de vrouwelijke onder de microscoop ontleden, gebruik maken van de tweede set van een tang om voorzichtig verwijderen van de achterkant van het vrouwtje. </li><li> Veeg het achterste weefsel van de tweede tang. </li><li> Knijp de buikholte tweede tang uit de voorste naar het achterste van de buik. De twee ondoorzichtige eierstokken moet vasthouden aan de tang als buitenkant van de female. </li><li> Raak de eierstokken in de olie. </li><li> Verwijder eventuele weefsel uit de tang door afvegen de tang. </li><li> Herhaal deze stappen (2.4.1 - 2.4.7) tot drie dekglaasjes te verkrijgen, die elk eierstokken van een vlieg. </li></ol></li></ol> 3. Isoleren Individuele rijpe eicellen <ol><li> Onder een standaard dissectie microscoop met het ingesteld op 4X, op de eerste dekglaasje van stap 2,4 vergroting, scheiden de twee eierstokken door het scheuren van de eileider. </li><li> Invoering van een paar gesloten pincet in het midden van een eierstok, verzorgen elk ei kamers niet doorboren. </li><li> Plaats een standaard dissectie sonde in het midden van het ovarium naast de gesloten tang. </li><li> Voorzichtig sleept u de ontleden sonde door de eierstok naar de achterste paal, waar de rijpe eicellen (fase 14 ei kamers) bevinden zich. </li><li> Herhaal stap 3,1-3,4 2-5 keer afhankelijk van de grootte van het ovarium en het aantal eieren. Opmerking: Toevoeging van CO 2 </sub&gt; veroorzaakt meestal de afzetting van een enkel ei die groter zijn met opgeheven dorsale aanhangsels dan eerder afgegeven eieren zal verschijnen. Deze eieren moeten worden weggegooid voor beeldvorming omdat het reeds in de vrouwelijke geactiveerd. Opmerking: De rijpe eieren zijn waarschijnlijk gemakkelijk te scheiden van de eierstokken bindweefsel. </li><li> Als er geen rijpe eicellen zijn zichtbaar buiten de eierstok, blijven voorzichtig plagen met het ontleden sonde. </li><li> Zodra de rijpe eicellen zijn zichtbaar op het dekglaasje buitenkant van de eierstok, manoeuvreren 3-5 in een lijn in het midden van het dekglaasje. Opmerking: Voor de beste resultaten voert u de sonde voorzichtig langs de zijkant van de eieren. Opmerking: Vermijd het trekken aan de dorsale aanhangsels, omdat dit het ei kan beschadigen. Opmerking: Afhankelijk van de toekomst beeldvorming set-up, uitlijnen de eieren ongeveer 200 urn van elkaar loodrecht op het dekglaasje voor maximale beeldgebied. </li><li> Eenmaal uitgelijnd, verwijder de rest van het eierstokweefsel door het weg te slepen uit de uitgelijnde eieren behulp van de forceps. </li><li> Verwijder overtollige olie door deppen met de hoek van een medische vegen. Zorg ervoor dat u de rijpe eicellen te raken met de medische veegt als rijpe eicellen die worden benaderd zullen verloren gaan. </li><li> Teken een draadkruis op het dekglaasje met een marker te vereenvoudigen lokaliseren van het monster onder de microscoop. </li><li> Stel de dekglaasje op een veilige plaats en laat de voorbereide ei kamers op het dekglaasje te rusten voor 5-10 min. Dit maakt het mogelijk eieren te vestigen in de olie. Monsters kunnen gebruikt worden tot 1 uur na dissectie. </li><li> Herhaal stap 3,1-3,11 de rest van de dekglaasjes met eierstokken erop. </li></ol> 4. Voorbereiding van Imaging <ol><li> Breng bereid activeringsbuffer 15 tot kamertemperatuur. Opmerking: activering buffer is een hypotonische buffer: 3,3 mM NaH 2PO 4, 16,6 mM KH 2PO 4, 10 mM NaCl, 50 mM KCl, 5% polyethyleenglycol 8000, 2 mM CaCl2, pH 6,4 gebracht met 1: 5 verhouding van NaOH: KOH.Voor meer informatie zie Mahowald, 1983 15. Porties activeringsbuffer kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C gedurende maanden bij 4 ° C gedurende maximaal 2 weken. </li><li> vervoeren zorgvuldig voorbereide dekglaasjes, activering buffer en glazen pipetten voor de beeldvorming faciliteit. Opmerking: Een breed gebied confocale, draaiende schijf of plaat licht microscoop kan worden gebruikt. We raden het gebruik van een omgekeerde microscoop. De representatieve resultaten werden verkregen met een confocale microscoop. </li><li> Een objectieve geschikt voor beeldvorming van het gehele rijpe eicel moet (hier: 20X 0.7 NA) worden gekozen. </li><li> Monteer de eerste voorbereide dekglaasje op de microscoop podium. Zorg ervoor dat u de dekglaasjes op het podium te breken. </li><li> Kwalitatief selecteert u een gezichtsveld met een volwassen ei kamer voor activering. Niet image doorboord ei kamers of mensen met blebbing in het membraan. Opmerking: voor de stappen 4,6-4,7, softwareopdrachten is afhankelijk van microscoop en fabrikant. </li><li> Set imaging parameter voor standaard GFP excitatie (488 nm) en emissie (500-580 nm). Ook het opzetten van een bright-field oog in oog te visualiseren en te oriënteren de rijpe eicel en ontheemde olie. </li><li> Selecteer de laagste Z-vlak waarbinnen rijpe eicellen zijn toegankelijk en tot fullcolour Z-stack te worden genomen voor 40 urn ongeveer 2 micrometer per stap. Stel de parameters zodat er geen vertraging tussen Z-stack acquisitie. Stel de tijdreeks te leggen gedurende ongeveer 30 minuten. </li></ol> 5. Imaging Ex Vivo Egg Activation <ol><li> Start beeld vast te leggen. </li><li> Wacht 1-2 full Z-stacks te verwerven. Dit toont de rijpe eicel voorafgaande aan activatie. </li><li> Trekken ongeveer 300 gl buffer activatie in een glazen pipet. </li><li> Positioneren van het uiteinde van de glazen pipet met activatie buffer bij een 45 ° hoek boven het dekglaasje, langzaam de pipet in de stralengang totdat deze direct boven de rijpe eicel wordt afgebeeld. De glazen pipet moetzijn 1-2 cm boven de olie. </li><li> Voeg 1-2 druppels activeringsbuffer in minder dan 5 seconden van de glazen pipet. Dit moet de olie vervangen. Vermijd het toevoegen overtollige activering buffer of het aanraken van het ei met de glazen pipet als het verplaatsen van de rijpe eicel kan veroorzaken. Zorg ervoor dat u het dekglaasje te raken met de pipet, omdat dit een verandering in de focal plane of luchtbellen kunnen veroorzaken te vormen in de immersie olie tussen de objectieve en dekglaasje. </li><li> Terwijl het toevoegen van activering buffer tijdens beeldacquisitie, controleer dan de bright-field kanaal om ervoor te zorgen dat de olie is verdrongen door de activering buffer. Opmerking: Deze verschijnt eerst als een schaduw door het breken van de pipet stralengang maar zal ook leiden tot het verschijnen van kleine oliedruppeltjes. Sommige oliedruppeltjes kan geassocieerd blijven met de rijpe eicel die experimentele resultaten en de beeldkwaliteit zal beïnvloeden. </li><li> Als de olie niet wordt verplaatst van de eerste toevoeging van activering buffer herhaalt u stap 5,4-50,6. </li><li> Zodra de olie met succes wordt verplaatst, zodat de tijdreeksen te lopen tot aan de voltooiing. Let op: Als gevolg van zwelling van eicellen bij activering, sommige ei kamers zal drastisch uit de focal plane of gezichtsveld verplaatsen na toevoeging van de activering buffer. In deze situatie, stopt de verwerving en monteer de volgende dekglaasje. </li><li> Na de reeks afbeeldingen overname heeft afgerond, opslaan van gegevens. </li></ol> 6. Post-acquisitie Image Processing <ol><li> Open de dataset met behulp van Fiji (http://fiji.sc/Downloads#Fiji), of gelijkwaardige software voor beeldverwerking, en selecteer de relevante bestanden voor analyse. </li><li> Om een ​​projectie van de verkregen gegevens te bouwen selecteren: Afbeelding&gt; Stacks&gt; Z-project. </li><li> Selecteer een start Z-slice en een stop Z-slice, meestal de hele sectie. Selecteer een projectie type doorgaans ingesteld op &#39;Max Intensity&#39;. Controleer hokje &#39;All Time Frames&#39; om de gekozen instellingen toe te passen op de hele reeks. </li><li> Alsmeer dan een TL-kanaal is afgebeeld, gebruik maken van de Kanalen tool om beweging tussen kleuren maken, maak een composiet, of maak de afbeelding grijstinten. Selecteer Afbeelding&gt; Kleuren&gt; Kanalen tool. </li><li> Om de helderheid van het beeld aan te passen en het contrast te selecteren Afbeelding&gt; Aanpassen&gt; Helderheid / Contrast. </li><li> Om een ​​enkel beeld te exporteren, verplaatsen tijdschaal schuifregelaar naar relevante frame en selecteer Bestand&gt; Opslaan als&gt; Jpeg, of iedere gewenste formaat. </li><li> Kies een locatie en naam voor het geëxporteerde bestand en vervolgens op te slaan. Opmerking Het frame rate van de imaging software vereist zal zijn om een ​​tijdstempel op het beeld te geven. </li><li> Exporteren de tijdreeks als een film te selecteren: Bestand&gt; Opslaan als&gt; AVI, selecteer frame rate (~ 7 frames per seconde). </li><li> Kies een locatie en naam voor het geëxporteerde bestand en vervolgens op te slaan. </li><li> Om de aangepaste bestand in Fiji formaat op te slaan, selecteert u Bestand&gt; Opslaan. </li></ol>

<ol>
	<li>Stricker, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+biology+of+calcium+signaling+during+fertilization+and+egg+activation+in+animals.">Comparative biology of calcium signaling during fertilization and egg activation in animals.</a> Dev Biol. 211 (2), 157-176 (1999).</li><li>Horner, V. L., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transitioning+from+egg+to+embryo:+triggers+and+mechanisms+of+egg+activation.">Transitioning from egg to embryo: triggers and mechanisms of egg activation.</a> Dev Dyn. 237 (3), 527-544 (2008).</li><li>Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+free+calcium+wave+traverses+the+activating+egg+of+the+medaka,+Oryzias+latipes.">A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes.</a> J Chem Biol. 76 (2), 448-466 (1978).</li><li>Fujiwara, T., Nakada, K., Shirakawa, H., Miyazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+inositol+trisphosphate-induced+calcium+release+mechanism+during+maturation+of+hamster+oocytes.">Development of inositol trisphosphate-induced calcium release mechanism during maturation of hamster oocytes.</a> Dev Biol. 156 (1), 69-79 (1993).</li><li>Hafner, M., Petzelt, C., Nobiling, R., Pawley, J. B., Kramp, D., Schatten, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wave+of+free+calcium+at+fertilization+in+the+sea+urchin+egg+visualized+with+fura-2.">Wave of free calcium at fertilization in the sea urchin egg visualized with fura-2.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 9 (3), 271-277 (1988).</li><li>Fontanilla, R. A., Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+sperm-induced+calcium+wave+in+Xenopus+eggs+using+confocal+microscopy.">Characterization of the sperm-induced calcium wave in Xenopus eggs using confocal microscopy.</a> Biophys J. 75 (4), 2079-2087 (1998).</li><li>Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+Ca2++indicators:+using+genetics+and+molecular+design+to+understand+complex+physiology.">Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology.</a> J Physiol. 578, 55-67 (2007).</li><li>Douglass, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> New Techniques in Systems Neuroscience. , (2015).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging.">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li><li>Chen, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Wang, J., Wong, A., Flores, J., Vosshall, L., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain.">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112 (2), 271-282 (2003).</li><li>Kaneuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+waves+occur+as+Drosophila+oocytes+activate.">Calcium waves occur as Drosophila oocytes activate.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 791-796 (2015).</li><li>York-Andersen, A. H., Parton, R. M., Bi, C. J., Bromley, C. L., Davis, I., Weil, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+and+rapid+calcium+wave+at+egg+activation+in+Drosophila.">A single and rapid calcium wave at egg activation in Drosophila.</a> Biol Open. 4 (4), 553-560 (2015).</li><li>Mahowald, A. P., Goralski, T. J., Caulton, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+activation+of+Drosophila+eggs.">In vitro activation of Drosophila eggs.</a> Dev Biol. 98 (2), 437-445 (1983).</li><li>Page, A. W., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+meiotic+divisions+in+Drosophila+oocytes.">Activation of the meiotic divisions in Drosophila oocytes.</a> Dev Biol. 183 (2), 195-207 (1997).</li><li>Horner, V. L., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stimulation+by+osmotic+and+hydrostatic+pressure+activates+Drosophila+oocytes+in+vitro+in+a+calcium-dependent+manner.">Mechanical stimulation by osmotic and hydrostatic pressure activates Drosophila oocytes in vitro in a calcium-dependent manner.</a> Dev Biol. 316 (1), 100-109 (2008).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging.">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> J Vis Exp. (60), (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essentials+of+Biology+1:+yeast,+Drosophila+and+C.+elegans.+Drosophila+Maintenance.">Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila Maintenance.</a> JoVE Science Education Database. , (2016).</li><li>Melom, J. E., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+a+NCKX+Eliminates+Glial+Microdomain+Calcium+Oscillations+and+Enhances+Seizure+Susceptibility.">Mutation of a NCKX Eliminates Glial Microdomain Calcium Oscillations and Enhances Seizure Susceptibility.</a> J Neurosci. 33 (3), 1169-1178 (2013).</li><li>Munro, E., Nance, J., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+flows+powered+by+asymmetrical+contraction+transport+PAR+proteins+to+establish+and+maintain+anterior-posterior+polarity+in+the+early+C.+elegans+embryo.">Cortical flows powered by asymmetrical contraction transport PAR proteins to establish and maintain anterior-posterior polarity in the early C. elegans embryo.</a> Dev Cell. 7 (3), 413-424 (2004).</li><li>Maruyama, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGG-3+regulates+cell-surface+and+cortex+rearrangements+during+egg+activation+in+Caenorhabditis+elegans.">EGG-3 regulates cell-surface and cortex rearrangements during egg activation in Caenorhabditis elegans.</a> Curr Biol. 17 (18), 1555-1560 (2007).</li><li>Wong, G. K., Woods, M. A., Szymczak, R. K., Gavlik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+normal+actin+cytoskeletal+reorganization+affects+cell+cycle+time+in+fertilized+sea+urchin+eggs.">Disruption of normal actin cytoskeletal reorganization affects cell cycle time in fertilized sea urchin eggs.</a> Mol Biol Cell. 15, 23 (2004).</li><li>Horner, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+calcipressin+sarah+is+required+for+several+aspects+of+egg+activation.">The Drosophila calcipressin sarah is required for several aspects of egg activation.</a> Curr Biol. 16 (14), 1441-1446 (2006).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

The first critical step in this protocol is isolating the mature eggs without damage. This can be achieved by gentile maneuvering of the eggs with the dissecting probe. Practice will enable this manipulation to be executed without damage to the eggs. A second crucial step is avoiding the loss of the sample when activation buffer is applied to the mature egg in oil. Application of the activation buffer should be done slowly and without contact with the coverslip. This step can be challenging if the microscope set-up does not allow for an easy access to the sample. Moving axillary parts of the microscope, such as a temperature incubator, is advisable. 
Modifications to this protocol can be made in order to visualize other fluorescently tagged factors, instead of Ca2+ at egg activation. More generally, different stages of Drosophila development or the results of adding a different buffer could be analyzed using this protocol. 
Troubleshooting may be required if the settings on the microscope are not optimal for visualizing the signal from the sample. This can be achieved by increasing or decreasing the laser power, altering capture range and adjusting the Z-stack parameters. Another issue might be eggs consistently moving out of the field of view upon the addition of activation buffer. If this happens regularly, allow the mature eggs to settle on the coverslips for a longer period of time, 15 to 20 minutes. Beware that using a higher viscosity oil will alter the displacement of the oil by activation buffer. 
This technique presented here is limited by the working distance of the objective, dehydration of the mature eggs and the ability to dissect the mature eggs without damage. However, when compared to in vivo imaging methods where the mature oocyte passes through the adult female and is deposited 13, our method enables more spatial resolution, the option to physically manipulate the mature egg before activation and the ability to test the role of egg activation without fertilization. 
There are many potential future applications of this technique, including testing reporter constructs for cellular components at egg activation and visualizing the Ca2+ wave in mutant backgrounds 14,24. Together with experimental and genetic tools, the ex vivo egg activation assay presented here enables the study of the trigger, propagation and downstream effects of the universally conserved Ca2+ wave.

Een verandering van de intracellulaire Ca2 + concentratie ei (eicel) activering is een geconserveerd deel van alle onderzochte organismen 1,2. Deze gebeurtenis start uiteenlopende Ca2 + -afhankelijke processen, waaronder de hervatting van de celcyclus en translatie van mRNAs opgeslagen. Door deze eis voor Ca2 + visualiseert de voorbijgaande veranderingen in de intracellulaire Ca2 + concentratie is van essentieel belang. Historisch gezien werden modelorganismen geselecteerd studies over eieren activatie gebaseerd op de grootte en de beschikbaarheid van eieren. Verschillende visualisatie benaderingen zijn gebruikt om veranderingen te volgen en kwantificeren intracellulaire Ca2 + concentraties in deze systemen, inclusief: het fotoproteïne aequorine in medaka vis 3; Ca 2+ gevoelige fluorescerende kleurstoffen zoals Fura-2 in zee-egels en hamster 4,5; en calcium groen-1-dextran in Xenopus 6. Het genereren en verbetering van genetisch gecodeerd calcium indicatoren (Geçiş) heeft de mogelijkheid om te visualiseren Ca 2+ dynamiek in vivo 7 omgezet. Deze genetische constructen uitgedrukt in specifieke weefsels en beperken de noodzaak voor invasieve weefselpreparaten 8. GCaMPs een groen fluorescerend eiwit (GFP) gebaseerde klasse Geçiş die zeer effectief zijn vanwege hun hoge Ca2 + affiniteit, signaal-ruisverhouding en capaciteit worden aangepast 9-11. In de aanwezigheid van Ca2 +, de GCaMP complex ondergaat een reeks conformationele veranderingen, te beginnen met de binding van Ca2 + aan calmoduline, wat leidt tot een toegenomen fluorescentie-intensiteit van het GFP component 9. GCaMPs zijn uitgebreid gebruikt in onderzoek Drosophila neuronen veranderingen in intracellulaire calcium 12 visualiseren. De recente applicatiop van GCaMP technologie om Ca 2+ te visualiseren in de volwassen Drosophila eieren is gebleken dat één van voorbijgaande aard Ca 2+ golf bij ei activering 13,14. De Ca 2+ golf kan worden gevisualiseerd op lage vergroting tijdens de ovulatie in vivo 13 of bij een hogere vergroting met behulp van een ex vivo activering assay 13,14. In de ex vivo analyse worden afzonderlijke rijpe oöcyten geïsoleerd van de eierstokken en geactiveerd door een hypotone oplossing, genoemd activeringsbuffer, waarvan is aangetoond dat de gebeurtenissen van in vivo activering 15-17 recapituleren. Deze ex vivo test maakt een eenvoudige hoge resolutie visualisatie van de Ca 2+ golf onder verschillende experimentele condities waaronder farmacologische verstoring, fysieke manipulaties en genetische mutanten. In dit artikel wordt de voorbereiding van de volwassen Drosophila eieren voor ex vivo activering en the daaropvolgende microscopie gebruikt om de Ca 2+ wave met behulp van GCaMP visualiseren. Deze benadering kan worden gebruikt voor de initiatie en controle van de Ca2 + golf testen en resultaten downstream probe.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="999">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dry active yeast</td>
			<td style="width:373px;">Fleischman&#8217;s</td>
			<td style="width:243px;">#2192</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>Various will work</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lamp</td>
			<td>Mircotec Fibre optic</td>
			<td>MF0-90</td>
			<td>Various will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Medical wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Corporation</td>
			<td>KLEW3020&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Marker pen</td>
			<td>Stabilo</td>
			<td>841/46</td>
			<td>OHPen universal, black - available in most stationary shops. Superfine Width 0.4mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CO2 pad</td>
			<td>&#160;Genesee Scientific</td>
			<td>59-114 (789060 Dutscher)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slip No. 1.5, 22 x 50mm</td>
			<td>International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm</td>
			<td>Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" rowspan="2" style="height:40px;">Halocarbon oil, series 95</td>
			<td rowspan="2">Halocarbon Products Corp.</td>
			<td>Distributor in Europe:</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Solvadis (GMBH)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oil 10 S</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td align="right">24627.188</td>
			<td>Can be used instead of Halocarbon oil, series 95</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>Whilst these tool should be clean, use of an autoclave is not necessary, ethanol would be sufficient.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Probe</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10140-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass pipette</td>
			<td>Fisherbrand,</td>
			<td>FB50251</td>
			<td>Pasteur Pipettes, glass, unplugged, 150mm length&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vial</td>
			<td style="width:373px;">Regina Industries</td>
			<td style="width:243px;">P1014</td>
			<td>GPPS&#160; 80mm x 25mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging calcium in drosophila at egg activation

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a 'Ca2+ wave'. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.

Hier hebben we aangetoond hoe volwassen Drosophila eieren voor te bereiden op ex vivo activering. Eieren expressie een GECI mogelijk imaging Ca2 + dynamiek ei activering en het begin van de embryonale ontwikkeling (figuur 1). Opgemerkt wordt dat afhankelijk van de GCaMP gebruikt, met name de aanwezigheid van een myristoyl groep, kunnen de resultaten kleine kwaliteitsverschillen 13 14 hebben. Wij hebben ook een rol voor functionele actine tijdens de eieren activatie aangetoond door toevoeging van een remmer van actine polymerisatie, cytochalasine D, tot de activering buffer (figuur 2) 14. Een vereiste voor het cytoskelet bij ei activering wordt geconserveerd. In C. elegans, na de bevruchting, het cytoskelet componenten worden gereorganiseerd om de een-cel embryo voor te bereiden op de eerste asymmetrische divisie 21,22. In de zee-egel, verstoring van cytoskeletal reorganisatie na activering is aangetoond dat de celcyclus te beïnvloeden door het voorkomen contractiele ringvorming 23. De rol van actine in het bemiddelen van een Ca 2+ wave en de downstream-functie op ei activering in Drosophila nog niet volledig opgehelderd. In Drosophila, kan co-visualisatie van de Ca2 + golf en actine cytoskelet worden bereikt met deze ex vivo activatie assay. Tijdreeksen van meerdere kanalen kan worden verkregen en dynamiek van de intracellulaire Ca2 + kan worden gekoppeld aan veranderingen in actine organisatie in de eicel (figuur 3). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig1.jpg" /> Figuur 1:. A Single Ca 2+ golf bij Drosophila Egg Activering Time reeks ex vivo volwassen Drosophila ei uitdrukken UASt- myrGCaMP5 na eenddition van de activering buffer (AH). De stijging van cytoplasmatische Ca2 + beginnend op het achterpool (B) en voortplant (BF) met een gemiddelde snelheid van ongeveer 1,5 um / sec. Initiatie van de golf wordt meestal waargenomen binnen 3 minuten van de toevoeging van activeringsbuffer. Na activering, het intracellulaire calciumgehalte van de rijpe eicel terug naar pre-activatie niveau (G, H). Zie aanvullende film 1 (totale tijd 33 min). Schaalbalken = 50 urn. Max projectie = 40 micrometer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig2.jpg" /> Figuur 2: Toevoeging van cytochalasine D op Activation Buffer verstoort Ca2+ golfvoortplanting. Time reeks ex vivo volwassen Drosophila ei uitdrukken UASt- myrGCaMP5 na toevoeging van activering buffer die 10 ug / ml cytochalasine D uiteindelijke concentratie (AH). Terwijl de Ca2 + golf wordt ingeleid op achterpool (A) wordt aangetast en niet het voorste van het ei (F) te bereiken (witte pijlen duiden de voorkant van de golf). Geen verdere Ca2 + veranderingen werden waargenomen gedurende 30 min). Zie aanvullende film 2 (totale tijd 30 min). Schaalbalken = 50 urn. Max projectie = 40 micrometer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig3.jpg" /> Figuur 3: Co-visualisatie van Actin en Ca2 + bij Egg activering in Drosophila. Time reeks ex vivo volwassen Drosophila ei uitdrukken UASt- myrGCaMP5 (cyaan) en UASP -F-Tractin.tdTomato (Magenta) na toevoeging van activering buffer (AH). De Ca 2+ golf initieert uit de achterste paal en herstelt als in figuur 1. Actine lijkt te veranderen in de tijd, witte pijlpunten (A vs H). Het ontbreken van Ca2 + signaaldetectie in het midden van het rijpe eicel wordt veroorzaakt door beweging van het monster gedurende beeldopname. Schaalbalken = 50 urn. Max projectie = 40 micrometer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation at JoVE.com

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Dit artikel beschrijft een aanpasbare ex vivo protocol voor het visualiseren van Ca 2+ tijdens ei activering in Drosophila.

Beeldvorming Calcium in<em&gt; Drosophila</em&gt; Bij Egg Activering

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-beeldvorming van de<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Rechtop Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Het bijhouden van cellen in GFP-transgene zebravis Met behulp van de photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methoden om Onderzoek de lymfeklier en Hemocytes in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Beeldvorming van de spier-pees morfogenese in Drosophila poppen

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Analyse van Actomyosin dynamiek op lokale cellulaire en weefsel schalen met behulp van timelapse-films van gekweekte Drosophila Eier kamers

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live beeldvorming en analyse van spiercontracties in Drosophila embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Ontdooien, kweken en Cryopreserving van Drosophila cellijnen

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescerende calciumbeeldvorming en daaropvolgende in situ hybridisatie voor neuronale precursorkarakterisering in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Beeldvorming Intranucleaire Actin Staven in Live Heat Stressed Drosophila Embryo's

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...