Name: imaging calcium in drosophila at egg activation
Uploaded: 2016-08-06T14:00:00
Duration: 7 min 45 s
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हम इस पांडुलिपि की तैयारी के दौरान सहायता के लिए लौरा Bampton, एलेक्स डेविडसन, रिचर्ड पार्टन, Arita आचार्य के आभारी हैं; अंडे की सक्रियता पर विचार विमर्श के लिए मारियाना Wolfner; इमेजिंग समर्थन के लिए मैट वेलैंड; और प्रयोगशाला में सामान्य समर्थन के लिए नेन हू। इस काम के लिए TTW कैम्ब्रिज, आईएसएसएफ विश्वविद्यालय [अनुदान संख्या 097814] द्वारा समर्थित किया गया।

<ol>
	<li>Stricker, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+biology+of+calcium+signaling+during+fertilization+and+egg+activation+in+animals.">Comparative biology of calcium signaling during fertilization and egg activation in animals.</a> Dev Biol. 211 (2), 157-176 (1999).</li><li>Horner, V. L., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transitioning+from+egg+to+embryo:+triggers+and+mechanisms+of+egg+activation.">Transitioning from egg to embryo: triggers and mechanisms of egg activation.</a> Dev Dyn. 237 (3), 527-544 (2008).</li><li>Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. 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लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

The first critical step in this protocol is isolating the mature eggs without damage. This can be achieved by gentile maneuvering of the eggs with the dissecting probe. Practice will enable this manipulation to be executed without damage to the eggs. A second crucial step is avoiding the loss of the sample when activation buffer is applied to the mature egg in oil. Application of the activation buffer should be done slowly and without contact with the coverslip. This step can be challenging if the microscope set-up does not allow for an easy access to the sample. Moving axillary parts of the microscope, such as a temperature incubator, is advisable. 
Modifications to this protocol can be made in order to visualize other fluorescently tagged factors, instead of Ca2+ at egg activation. More generally, different stages of Drosophila development or the results of adding a different buffer could be analyzed using this protocol. 
Troubleshooting may be required if the settings on the microscope are not optimal for visualizing the signal from the sample. This can be achieved by increasing or decreasing the laser power, altering capture range and adjusting the Z-stack parameters. Another issue might be eggs consistently moving out of the field of view upon the addition of activation buffer. If this happens regularly, allow the mature eggs to settle on the coverslips for a longer period of time, 15 to 20 minutes. Beware that using a higher viscosity oil will alter the displacement of the oil by activation buffer. 
This technique presented here is limited by the working distance of the objective, dehydration of the mature eggs and the ability to dissect the mature eggs without damage. However, when compared to in vivo imaging methods where the mature oocyte passes through the adult female and is deposited 13, our method enables more spatial resolution, the option to physically manipulate the mature egg before activation and the ability to test the role of egg activation without fertilization. 
There are many potential future applications of this technique, including testing reporter constructs for cellular components at egg activation and visualizing the Ca2+ wave in mutant backgrounds 14,24. Together with experimental and genetic tools, the ex vivo egg activation assay presented here enables the study of the trigger, propagation and downstream effects of the universally conserved Ca2+ wave.

अंडे (oocyte) सक्रियण पर intracellular सीए में बदलाव 2 + एकाग्रता सभी का अध्ययन जीवों 1,2 के एक संरक्षित घटक है। इस घटना को सीए 2 निर्भर प्रक्रियाओं की एक विस्तृत रेंज, कोशिका चक्र की बहाली और संग्रहीत mRNAs का अनुवाद सहित शुरू की। सीए 2 के लिए इस आवश्यकता, intracellular सीए 2 सांद्रता में क्षणिक परिवर्तन visualizing के कारण प्रमुख ब्याज की गई है। ऐतिहासिक दृष्टि से, मॉडल जीवों अंडा सक्रियण पर अध्ययन आकार और उनके अंडे की उपलब्धता के आधार पर चयन किया गया था। विभिन्न दृश्य दृष्टिकोण का पालन करें और इन प्रणालियों में 2 + सांद्रता, सहित intracellular सीए में बदलाव यों के लिए उपयोग किया गया है: medaka मछली 3 में photoprotein aequorin; ऐसे Fura-2 के समुद्री साही और हम्सटर 4,5 के रूप में सीए 2 संवेदनशील फ्लोरोसेंट रंगों; और कैल्शियम हरी-1-dextran Xenopus 6 में। पीढ़ी और आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम संकेतक (GECIS) में सुधार की विवो 7 में सीए 2 गतिशीलता कल्पना करने की क्षमता तब्दील हो गया है। ये आनुवंशिक निर्माणों विशिष्ट ऊतकों में व्यक्त किया और आक्रामक ऊतक की तैयारी 8 के लिए जरूरत की सीमा रहे हैं। GCaMPs उनके उच्च सीए 2 आत्मीयता के कारण एक हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) GECIS है कि बहुत प्रभावी किया गया है की आधारित वर्ग के हैं, संकेत करने वाली शोर अनुपात और क्षमता 9-11 अनुकूलित किया जाना है। सीए 2 की उपस्थिति में, GCaMP जटिल गठनात्मक परिवर्तन की एक श्रृंखला आए, calmodulin करने के लिए सीए 2 के बंधन के साथ शुरू, कि GFP घटक 9 का एक बढ़ा फ्लोरोसेंट तीव्रता में परिणाम है। GCaMPs बड़े पैमाने पर intracellular कैल्शियम 12 में परिवर्तन कल्पना करने के लिए ड्रोसोफिला न्यूरॉन्स पर अनुसंधान के क्षेत्र में इस्तेमाल किया गया है। हाल ही में आवेदनGCaMP प्रौद्योगिकी परिपक्व ड्रोसोफिला अंडे में 2 + सीए कल्पना करने की पर एक भी क्षणिक सीए 2 अंडे सक्रियण 13,14 पर लहर पता चला है। सीए 2 लहर विवो 13 में ovulation के दौरान या उच्च बढ़ाई एक पूर्व vivo सक्रियण परख 13,14 का उपयोग कर कम बढ़ाई देखे जा सकते हैं। पूर्व vivo परख में, अलग-अलग परिपक्व oocytes अंडाशय से अलग है और एक hypotonic समाधान का उपयोग कर सक्रिय कर रहे हैं, सक्रियण बफर, जो इन विवो सक्रियण 15-17 की घटनाओं की पुनरावृत्ति को दिखाया गया है के रूप में भेजा। इस पूर्व vivo परख औषधीय व्यवधान, शारीरिक जोड़तोड़ और आनुवंशिक म्यूटेंट सहित विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों के तहत सीए 2 लहर के आसान उच्च संकल्प दृश्य सक्षम बनाता है। यह लेख पूर्व vivo सक्रियण और वीं के लिए परिपक्व ड्रोसोफिला अंडे की तैयारी दर्शाता हैई बाद GCaMP का उपयोग करते हुए सीए 2 लहर कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया माइक्रोस्कोपी। यह दृष्टिकोण दीक्षा और सीए 2 लहर के नियंत्रण परीक्षण करने के लिए और नीचे की ओर परिणामों की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="999">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dry active yeast</td>
			<td style="width:373px;">Fleischman&#8217;s</td>
			<td style="width:243px;">#2192</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>Various will work</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lamp</td>
			<td>Mircotec Fibre optic</td>
			<td>MF0-90</td>
			<td>Various will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Medical wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Corporation</td>
			<td>KLEW3020&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Marker pen</td>
			<td>Stabilo</td>
			<td>841/46</td>
			<td>OHPen universal, black - available in most stationary shops. Superfine Width 0.4mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CO2 pad</td>
			<td>&#160;Genesee Scientific</td>
			<td>59-114 (789060 Dutscher)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slip No. 1.5, 22 x 50mm</td>
			<td>International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm</td>
			<td>Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" rowspan="2" style="height:40px;">Halocarbon oil, series 95</td>
			<td rowspan="2">Halocarbon Products Corp.</td>
			<td>Distributor in Europe:</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Solvadis (GMBH)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oil 10 S</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td align="right">24627.188</td>
			<td>Can be used instead of Halocarbon oil, series 95</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>Whilst these tool should be clean, use of an autoclave is not necessary, ethanol would be sufficient.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Probe</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10140-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass pipette</td>
			<td>Fisherbrand,</td>
			<td>FB50251</td>
			<td>Pasteur Pipettes, glass, unplugged, 150mm length&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vial</td>
			<td style="width:373px;">Regina Industries</td>
			<td style="width:243px;">P1014</td>
			<td>GPPS&#160; 80mm x 25mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging calcium in drosophila at egg activation

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a 'Ca2+ wave'. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.

यहाँ हम कैसे पूर्व vivo सक्रियण के लिए परिपक्व ड्रोसोफिला अंडे तैयार करने के लिए प्रदर्शन किया है। अंडे अंडे सक्रियण पर 2 + गतिशीलता सीए की एक GECI इमेजिंग सक्षम और भ्रूण के विकास की शुरुआत (चित्रा 1) व्यक्त। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि GCaMP के आधार पर इस्तेमाल किया है, विशेष रूप से एक myristoyl समूह की उपस्थिति, परिणाम मामूली गुणात्मक मतभेद 13 14 हो सकती है। हम यह भी actin polymerization के एक अवरोध के अलावा द्वारा अंडे सक्रियण के दौरान कार्यात्मक actin के लिए एक भूमिका का प्रदर्शन किया है, cytochalasin डी, सक्रियण बफर (चित्रा 2) 14। अंडा सक्रियण पर cytoskeleton के लिए एक आवश्यकता संरक्षित है। सी में एलिगेंस, निषेचन के बाद, cytoskeletal घटकों पहली विषम विभाजन 21,22 के लिए एक सेल भ्रूण तैयार करने के लिए पुनर्गठित कर रहे हैं। समुद्री साही में, cytoskele के विघटनताल पुनर्गठन सक्रियण निम्नलिखित सिकुड़ा अंगूठी गठन 23 को रोकने के द्वारा सेल चक्र को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है। एक सीए 2 लहर और ड्रोसोफिला में अंडा सक्रियण पर अपने बहाव समारोह में मध्यस्थता में actin की भूमिका पूरी तरह से स्पष्ट किया जाना है। ड्रोसोफिला में, सीए 2 लहर और actin cytoskeleton के सह दृश्य इस पूर्व vivo सक्रियण परख का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है। कई चैनलों के समय श्रृंखला का अधिग्रहण किया जा सकता है और intracellular सीए 2 की गतिशीलता oocyte (चित्रा 3) में actin संगठन में परिवर्तन के साथ मिलान किया जा सकता है। <img alt="आकृति 1" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig1.jpg" /> चित्रा 1:। पूर्व vivo की ड्रोसोफिला अंडे सक्रियण समय श्रृंखला में एक ही सीए 2 वेव ड्रोसोफिला अंडे एक के बाद UASt- myrGCaMP5 व्यक्त परिपक्वसक्रियण बफर (एएच) की ddition। Cytoplasmic सीए में वृद्धि 2 + पीछे ध्रुव (बी) और propagates (बीएफ) लगभग 1.5 माइक्रोन / सेकंड की औसत वेग के साथ कम से निकलती है। लहर की शुरूआत आमतौर पर सक्रियण बफर के अलावा के 3 मिनट के भीतर मनाया जाता है। सक्रियण के बाद, परिपक्व अंडे के intracellular कैल्शियम का स्तर पूर्व सक्रियण स्तर (जी, एच) के लिए आए। पूरक मूवी 1 (कुल समय 33 मिनट) देखें। स्केल सलाखों = 50 माइक्रोन। मैक्स प्रक्षेपण = 40 माइक्रोन। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig1large.jpg" target="_blank">यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a> <img alt="चित्र 2" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig2.jpg" /> चित्रा 2: सक्रियण बफर Perturbs सीए को cytochalasin डी के अलावा2 + वेव प्रचार। पूर्व vivo के समय श्रृंखला ड्रोसोफिला अंडे निम्नलिखित सक्रियण 10 माइक्रोग्राम / एमएल cytochalasin डी अंतिम एकाग्रता (एएच) युक्त बफर के अलावा UASt- myrGCaMP5 व्यक्त परिपक्व। नदीम सीए 2 लहर पीछे ध्रुव (ए) में शुरू की है, यह समझौता किया है और अंडे (एफ) के पूर्वकाल तक पहुँच नहीं है (सफेद तीर लहर के सामने निरूपित)। आगे कोई सीए 2 परिवर्तन 30 मिनट से अधिक मनाया गया)। पूरक मूवी 2 (कुल समय 30 मिनट) देखें। स्केल सलाखों = 50 माइक्रोन। मैक्स प्रक्षेपण = 40 माइक्रोन। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig2large.jpg" target="_blank">यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a> <img alt="चित्र तीन" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig3.jpg" /> चित्रा 3: ई पर actin और सीए 2 के सह-दृश्यपूर्व vivo की ड्रोसोफिला। समय श्रृंखला में जी जी एक्टिवेशन ड्रोसोफिला अंडे UASt- myrGCaMP5 (सियान) और UASp एफ-Tractin.tdTomato (मैजंटा) सक्रियण बफर के निम्नलिखित अलावा (एएच) व्यक्त परिपक्व। सीए 2 लहर पीछे ध्रुव से शुरू की और चित्रा के रूप में ठीक हो जाए 1। Actin, सफेद तीर (ए बनाम एच) समय के साथ बदल रहा प्रतीत होता है। परिपक्व अंडे के केंद्र में सीए 2 संकेत का पता लगाने की कमी छवि पर कब्जा दौरान नमूना के आंदोलन की वजह से है। स्केल सलाखों = 50 माइक्रोन। मैक्स प्रक्षेपण = 40 माइक्रोन। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig3large.jpg" target="_blank">यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>

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Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

यह लेख ड्रोसोफिला में अंडा सक्रियण के दौरान 2 + सीए visualizing के लिए एक अनुकूलनीय पूर्व vivo प्रोटोकॉल का वर्णन है।

में इमेजिंग कैल्शियम<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; अंडा एक्टिवेशन पर

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

का लाइव-इमेजिंग<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; पोटा संबंधी नेत्र

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

की ईमानदार इमेजिंग<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; अंडे मंडलों

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

GFP ट्रांसजेनिक Zebrafish Photoconvertible PSmOrange प्रणाली का प्रयोग में कोशिकाओं की ट्रैकिंग

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

तरीके लसीका ग्रंथि और hemocytes में जांच<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; लार्वा

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Vivo में मांसपेशी की इमेजिंग- Drosophila कोषस्थों में पट्टा Morphogenesis

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

स्थानीय सेलुलर और ऊतक तराजू पर Actomyosin गतिशीलता का विश्लेषण संस्कृतिD Drosophila अंडे कक्षों के समय चूक सिनेमा का उपयोग

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

लाइव इमेजिंग और Drosophila भ्रूण में मांसपेशी संकुचन का विश्लेषण

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

गल, Culturing, और Cryopreserving Drosophila सेल लाइनों

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

फ्लोरोसेंट कैल्शियम इमेजिंग और उसके बाद सिटू संकरण में ज़ेनोपस लेवेइस में न्यूरोनल अग्रदूत लक्षण वर्णन के लिए

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

लाइव हीट में इमेजिंग इंट्रान्यूक्लियर ऐक्टिन रॉड्स ने ड्रोसोफिला भ्रूण पर जोर दिया

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...