Name: imaging calcium in drosophila at egg activation
Uploaded: 2016-08-06T14:00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation at JoVE.com

Мы благодарны Лаура Bampton, Алекс Дэвидсон, Ричард Партон, Арита Ачарья за помощь при подготовке этой рукописи; Мариана Wolfner для обсуждения активации яйца; Мэтт Wayland для поддержки формирования изображения; и Nan Ху для общей поддержки в лаборатории. Эта работа была поддержана Кембриджского университета, ISSF в ТТЦ [грант номер 097814].

Примечание: Выполнить все операции, при комнатной температуре, если не указано иное. 1. Подготовка к Dissection Примечание: Описанные здесь шаги в соответствии с E. Гавис, Принстонский университет и Weil и др. и др. 18. Выполните следующие шаги, за два дня до съемки. <ol><li> Возьмем муху флакон, содержащий приблизительно 10 мл твердой пищи и добавить небольшое количество сухих дрожжей на один угол, менее 1 г достаточно. Примечание: Для получения информации о летучей флаконах или пищевых продуктов см &#39;Drosophila Техническое обслуживание »19. </li><li> Добавьте 1 - 3 капли воды для гидратации дрожжей. </li><li> Установите флакон в сторону под углом 45 ° и позволяют 3 - 5 мин для дрожжей, чтобы принять вверх воду. </li><li> В то время как дрожжи поглощает воду, выбрать бутылку мух , экспрессирующих UASt- Миэр GCaMP5 20 , приводимый Тюб-VP16GAL4 (называемый GCaMP5) , которые в последнее время появились (в myristoyняющей форма GCaMP5 была выбрана, чтобы обеспечить высокое отношение сигнал-шум путем привязывания к Geci к мембране в яйце). </li><li> Анестезировать мух в бутылке с CO 2 газа. Обязательно держите бутылку перевернутой таким образом, чтобы не потерять мух в мокрой пищи. </li><li> Совет анестезированных мух на СО 2 колодки и сортировки 10 - 15 самок и 5 самцов с помощью кисти под рассекает микроскопом. Примечание: стандарт включает мужчин, чтобы обеспечить здоровые женщины для рассечения. </li><li> Когда флакон с шага 1.3 будет готова, добавить выбранные мух во флакон. Позаботьтесь, чтобы держать флакон в горизонтальном положении, пока мухи не станут активными. </li><li> Помещают пробирку при 25 ° С в течение приблизительно 36 часов. </li><li> Возвращение оставшихся мух от СО 2 подушки к бутылке или выбраковки. </li></ol> 2. Режущая Drosophila Яичники Примечание: Описанные здесь шаги в соответствии с Weil и др. и др. <sдо&gt; 18. <ol><li> После того, как 36 ч, анестезию мух из дрожжевого флакона с CO 2. </li><li> После того, как мухи внутри флакона анестезируют кончик их на СО 2 площадку для сортировки с кистью под микроскопом рассекает. </li><li> Выберите женщину. </li><li> Изолировать два яичники от самки. Для полного детального протокола см Weil эт. и др. 18. В итоге: <ol><li> Поместите небольшую каплю окисленной Галокарбоновое масло (серия 95) на N: 1,5, 22 х 40 мм покровным. </li><li> Возьмитесь самки с пинцетом в передней части живота. </li><li> Держа самка под микроскопом рассекает, используйте второй набор щипцов, чтобы аккуратно снять заднюю самки. </li><li> Протрите заднюю ткань от второго щипцами. </li><li> Выдавить на животе полости со вторыми пинцетом от передней к задней части живота. Два непрозрачные яичники должны придерживаться щипцов, когда за пределами FEMAле. </li><li> Прикоснитесь к яичники в масло. </li><li> Удалите ткань из пинцета, вытирая щипцов. </li><li> Повторите эти действия (2.4.1 - 2.4.7), чтобы получить три покровные, каждый из которых содержит яичники из одной мухи. </li></ol></li></ol> 3. Индивидуальные изолируя Зрелые яйца <ol><li> Под стандартным рассекает микроскопом с увеличением, установленным в 4 раза, на первом покровное с шага 2.4, разделить два яичники, оторвав яйцевод. </li><li> Представьте пару закрытых щипцов в центре одного яичника, следя за тем, чтобы не проколоть любые яичные камеры. </li><li> Вставьте стандартный рассекает зонд в центре яичник рядом с закрытым пинцетом. </li><li> Аккуратно перетащите рассекает зонд через яичнике к заднему полюсу, где зрелые яйца (этап 14 яиц камеры) расположены. </li><li> Повторите шаги 3.1 - 3.4 2 - 5 раз в зависимости от размера яичнике и количества яиц. Примечание: Добавление CO 2 </к югу&gt; обычно вызывает осаждение одного яйца, которое появится больше с поднятыми спинных придатков, чем предварительно депонированы яиц. Это яйцо должно быть отброшено для работы с изображениями, так как она уже была активирована внутри самки. Примечание: Зрелые яйца могут легко отделить от яичников соединительной ткани. </li><li> Если не зрелые яйца не видны снаружи яичника, продолжайте мягко дразнит с рассекает зондом. </li><li> После того, как зрелые яйца видны на покровное за пределами яичник, маневрировать 3 - 5 в линию в центре покровное. Примечание: Для достижения наилучших результатов, запустить зонд осторожно вдоль стороны яйца. Примечание: Избегайте потянув на спинных придатков, так как это может повредить яйцо. Примечание: В зависимости от будущего изображения установка, выравнивание яйца примерно 200 мкм друг от друга перпендикулярно покровное для максимальной области визуализации. </li><li> После того, как выровнен, удалите остальную часть ткани яичников, перетащив его от выровненных яиц с использованием пorceps. </li><li> Удалите излишки масла путем протирания углу медицинской салфеткой. Будьте осторожны, чтобы не касаться зрелых яиц с медицинским вытирать, как зрелые яйца, которые контактировали будут потеряны. </li><li> Draw перекрестие на покровное с маркером для упрощения размещения образца под микроскопом. </li><li> Установите покровное в безопасном месте и оставить подготовленные яичные камеры на покровное, чтобы отдохнуть в течение 5 - 10 мин. Это позволяет яйцу оседают в масле. Образцы могут быть использованы до 1 ч после рассечения. </li><li> Повторите шаги 3.1 - 3.11 для остальной части покровные с яичниками на них. </li></ol> 4. Подготовка к визуализации <ol><li> Доведите подготовленный буфер активации 15 до комнатной температуры. Примечание: Буфер активации представляет собой гипотонический буфер: 3,3 мМ NaH 2 PO 4, 16,6 мМ КН 2 РО 4, 10 мМ NaCl, 50 мМ КСl, 5% полиэтиленгликоль 8000, 2 мМ CaCl 2, доводили до рН 6,4 с 1: 5 отношение NaOH: КОН.Для получения дополнительной информации см Маховальда, 1983 15. Аликвоты буфера активации можно хранить при температуре -20 ° С в течение нескольких месяцев , и при 4 ° С в течение до 2 -х недель. </li><li> Тщательно подготовленные транспортировать покровные, буфер активации и стеклянные пипетки к средству визуализации. Примечание: Широкий поле, конфокальной, вращающийся диск или легкий лист микроскоп может быть использован. Мы рекомендуем использовать инвертированный микроскоп. Наши репрезентативные результаты были получены с помощью конфокальной микроскопии. </li><li> Цель подходит для работы с изображениями всего зрелую яйцеклетку следует выбирать (здесь: 20X 0,7 NA). </li><li> Установите первый подготовленный покровное на столике микроскопа. Будьте осторожны, чтобы не сломать покровные на сцене. </li><li> Качественно выбрать поле зрения со зрелой яйцевой камеры для активации. Не изображение проколот яичные камеры или те, с блеббинга в мембране. Примечание: шаги 4.6 - 4.7, программные команды будет меняться в зависимости от микроскопа и производителя. </li><li> Набор изображений пунктметров для стандартного GFP возбуждения (488 нм) и испускания (500 - 580 нм). Также настроен вид ярко-поле для того, чтобы визуализировать и ориентированность зрелую яйцеклетку и смещенный масло. </li><li> Выберите самый низкий Z-плоскость, где зрелые яйца видимы и установить полный Z-стек, которые необходимо принять в течение 40 мкм приблизительно 2 мкм на шаг. Установите параметры таким образом, нет никакой задержки между приобретением Z-стека. Установите временные ряды, чтобы захватить в течение примерно 30 мин. </li></ol> 5. визуализации Ex Vivo Яйцо активации <ol><li> Запустить захват изображения. </li><li> Подождите 1 - 2 полных Z-стеки должны быть приобретены. Это показывает зрелую яйцеклетку до активации. </li><li> Вывод примерно 300 мкл буфера активации в стеклянную пипетку. </li><li> Позиционирование кончик стеклянной пипетки, содержащей буфер активации под углом 45 ° над покровное, медленно переместите пипетку на траекторию луча, пока он не находится непосредственно над зрелое яйцо изображаемого. Стеклянная пипетка должнабыть 1 - 2 см выше масла. </li><li> Добавьте 1 - 2 капли буфера активации менее чем за 5 секунд от стеклянной пипетки. Это должно вытеснять масло. Избегайте добавления избытка буфера активации или прикосновением яйцо со стеклянной пипеткой, как это может привести к смещению зрелого яйца. Будьте осторожны, не прикасайтесь к покровное с пипеткой, так как это может привести к изменению в фокальной плоскости или пузырьков воздуха с образованием в иммерсионного масла между объективом и покровное. </li><li> В то время как добавление буфера активации во время получения изображения, проверьте канал светлого поля, чтобы гарантировать, что масло было перемещено буфером активации. Примечание: Это будет сначала появляются как тень из-за пипетку нарушения на пути луча, но также приведет к появлению мелких капель масла. Некоторые капли масла могут оставаться связанным со зрелой яйцеклетки, которые будут влиять на экспериментальные результаты и качество изображения. </li><li> Если масло не смещается из первоначального добавления активирующего буфера повторите шаги 5.4 - 5.6. </li><li> После того, как масло успешно смещаются, позволяют временные ряды не работать до завершения. Примечание: Из-за отека ооцитов при активации, некоторые яичные камеры резко съехать из фокальной плоскости или поля зрения при добавлении буфера активации. В этой ситуации остановить приобретение и смонтировать следующий покровное. </li><li> После того, как последовательность изображений завершила приобретение, сохранение данных. </li></ol> 6. после приобретения Обработка изображений <ol><li> Откройте набор данных, используя Фиджи (http://fiji.sc/Downloads#Fiji~~HEAD=dobj) или эквивалентное программное обеспечение для обработки изображений, а затем выберите соответствующие файлы для анализа. </li><li> Чтобы построить проекцию полученных данных выберите: Image&gt; Стеки&gt; Z-проект. </li><li> Выберите начальную Z-среза и Z-срез стоп, как правило, весь раздел. Выберите тип проекции, как правило, установлен в &quot;Max Intensity&quot;. Проверьте окошки &quot;Все временные рамки&quot;, чтобы применить выбранные настройки ко всей серии. </li><li> Еслиболее чем один флуоресцентный канал был, изображаемый с помощью инструмента Каналы для того, чтобы движение между цветами, сделать составной, или сделать изображение в оттенках серого. Выберите Image&gt; Цвета&gt; Каналы инструмент. </li><li> Для регулировки яркости и контрастности изображения выберите изображение&gt; Adjust&gt; Brightness / Contrast. </li><li> Чтобы экспортировать одно изображение, переместите ползунок временной шкалы к соответствующей рамке и выберите File&gt; Save As&gt; Jpeg или любой нужный формат. </li><li> Выберите местоположение и название для экспортируемого файла, а затем сохранить. Примечание Частота кадров с помощью программного обеспечения визуализации потребуется, чтобы дать временную метку на изображении. </li><li> Для экспорта временной ряд как фильм выберите: File&gt; Save As&gt; AVI, а затем выбрать частоту кадров (~ 7 кадров в секунду). </li><li> Выберите местоположение и название для экспортируемого файла, а затем сохранить. </li><li> Для того, чтобы сохранить измененное файл в формате Фиджи, выберите Файл&gt; Сохранить. </li></ol>

<ol>
	<li>Stricker, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+biology+of+calcium+signaling+during+fertilization+and+egg+activation+in+animals.">Comparative biology of calcium signaling during fertilization and egg activation in animals.</a> Dev Biol. 211 (2), 157-176 (1999).</li><li>Horner, V. L., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transitioning+from+egg+to+embryo:+triggers+and+mechanisms+of+egg+activation.">Transitioning from egg to embryo: triggers and mechanisms of egg activation.</a> Dev Dyn. 237 (3), 527-544 (2008).</li><li>Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+free+calcium+wave+traverses+the+activating+egg+of+the+medaka,+Oryzias+latipes.">A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes.</a> J Chem Biol. 76 (2), 448-466 (1978).</li><li>Fujiwara, T., Nakada, K., Shirakawa, H., Miyazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+inositol+trisphosphate-induced+calcium+release+mechanism+during+maturation+of+hamster+oocytes.">Development of inositol trisphosphate-induced calcium release mechanism during maturation of hamster oocytes.</a> Dev Biol. 156 (1), 69-79 (1993).</li><li>Hafner, M., Petzelt, C., Nobiling, R., Pawley, J. B., Kramp, D., Schatten, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wave+of+free+calcium+at+fertilization+in+the+sea+urchin+egg+visualized+with+fura-2.">Wave of free calcium at fertilization in the sea urchin egg visualized with fura-2.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 9 (3), 271-277 (1988).</li><li>Fontanilla, R. A., Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+sperm-induced+calcium+wave+in+Xenopus+eggs+using+confocal+microscopy.">Characterization of the sperm-induced calcium wave in Xenopus eggs using confocal microscopy.</a> Biophys J. 75 (4), 2079-2087 (1998).</li><li>Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+Ca2++indicators:+using+genetics+and+molecular+design+to+understand+complex+physiology.">Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology.</a> J Physiol. 578, 55-67 (2007).</li><li>Douglass, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> New Techniques in Systems Neuroscience. , (2015).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging.">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li><li>Chen, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Wang, J., Wong, A., Flores, J., Vosshall, L., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain.">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112 (2), 271-282 (2003).</li><li>Kaneuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+waves+occur+as+Drosophila+oocytes+activate.">Calcium waves occur as Drosophila oocytes activate.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 791-796 (2015).</li><li>York-Andersen, A. H., Parton, R. M., Bi, C. J., Bromley, C. L., Davis, I., Weil, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+and+rapid+calcium+wave+at+egg+activation+in+Drosophila.">A single and rapid calcium wave at egg activation in Drosophila.</a> Biol Open. 4 (4), 553-560 (2015).</li><li>Mahowald, A. P., Goralski, T. J., Caulton, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+activation+of+Drosophila+eggs.">In vitro activation of Drosophila eggs.</a> Dev Biol. 98 (2), 437-445 (1983).</li><li>Page, A. W., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+meiotic+divisions+in+Drosophila+oocytes.">Activation of the meiotic divisions in Drosophila oocytes.</a> Dev Biol. 183 (2), 195-207 (1997).</li><li>Horner, V. L., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stimulation+by+osmotic+and+hydrostatic+pressure+activates+Drosophila+oocytes+in+vitro+in+a+calcium-dependent+manner.">Mechanical stimulation by osmotic and hydrostatic pressure activates Drosophila oocytes in vitro in a calcium-dependent manner.</a> Dev Biol. 316 (1), 100-109 (2008).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging.">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> J Vis Exp. (60), (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essentials+of+Biology+1:+yeast,+Drosophila+and+C.+elegans.+Drosophila+Maintenance.">Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila Maintenance.</a> JoVE Science Education Database. , (2016).</li><li>Melom, J. E., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+a+NCKX+Eliminates+Glial+Microdomain+Calcium+Oscillations+and+Enhances+Seizure+Susceptibility.">Mutation of a NCKX Eliminates Glial Microdomain Calcium Oscillations and Enhances Seizure Susceptibility.</a> J Neurosci. 33 (3), 1169-1178 (2013).</li><li>Munro, E., Nance, J., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+flows+powered+by+asymmetrical+contraction+transport+PAR+proteins+to+establish+and+maintain+anterior-posterior+polarity+in+the+early+C.+elegans+embryo.">Cortical flows powered by asymmetrical contraction transport PAR proteins to establish and maintain anterior-posterior polarity in the early C. elegans embryo.</a> Dev Cell. 7 (3), 413-424 (2004).</li><li>Maruyama, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGG-3+regulates+cell-surface+and+cortex+rearrangements+during+egg+activation+in+Caenorhabditis+elegans.">EGG-3 regulates cell-surface and cortex rearrangements during egg activation in Caenorhabditis elegans.</a> Curr Biol. 17 (18), 1555-1560 (2007).</li><li>Wong, G. K., Woods, M. A., Szymczak, R. K., Gavlik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+normal+actin+cytoskeletal+reorganization+affects+cell+cycle+time+in+fertilized+sea+urchin+eggs.">Disruption of normal actin cytoskeletal reorganization affects cell cycle time in fertilized sea urchin eggs.</a> Mol Biol Cell. 15, 23 (2004).</li><li>Horner, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+calcipressin+sarah+is+required+for+several+aspects+of+egg+activation.">The Drosophila calcipressin sarah is required for several aspects of egg activation.</a> Curr Biol. 16 (14), 1441-1446 (2006).</li></ol>

Авторы не имеют ничего раскрывать.

The first critical step in this protocol is isolating the mature eggs without damage. This can be achieved by gentile maneuvering of the eggs with the dissecting probe. Practice will enable this manipulation to be executed without damage to the eggs. A second crucial step is avoiding the loss of the sample when activation buffer is applied to the mature egg in oil. Application of the activation buffer should be done slowly and without contact with the coverslip. This step can be challenging if the microscope set-up does not allow for an easy access to the sample. Moving axillary parts of the microscope, such as a temperature incubator, is advisable. 
Modifications to this protocol can be made in order to visualize other fluorescently tagged factors, instead of Ca2+ at egg activation. More generally, different stages of Drosophila development or the results of adding a different buffer could be analyzed using this protocol. 
Troubleshooting may be required if the settings on the microscope are not optimal for visualizing the signal from the sample. This can be achieved by increasing or decreasing the laser power, altering capture range and adjusting the Z-stack parameters. Another issue might be eggs consistently moving out of the field of view upon the addition of activation buffer. If this happens regularly, allow the mature eggs to settle on the coverslips for a longer period of time, 15 to 20 minutes. Beware that using a higher viscosity oil will alter the displacement of the oil by activation buffer. 
This technique presented here is limited by the working distance of the objective, dehydration of the mature eggs and the ability to dissect the mature eggs without damage. However, when compared to in vivo imaging methods where the mature oocyte passes through the adult female and is deposited 13, our method enables more spatial resolution, the option to physically manipulate the mature egg before activation and the ability to test the role of egg activation without fertilization. 
There are many potential future applications of this technique, including testing reporter constructs for cellular components at egg activation and visualizing the Ca2+ wave in mutant backgrounds 14,24. Together with experimental and genetic tools, the ex vivo egg activation assay presented here enables the study of the trigger, propagation and downstream effects of the universally conserved Ca2+ wave.

Изменение внутриклеточного Са 2+ концентрации в яйце (ооцитов) активации является сохраняющимся компонентом всех изученных организмов 1,2. Это событие инициирует широкий спектр Ca 2+ -зависимые процессов, в том числе возобновление клеточного цикла и трансляции сохраненных мРНК. В связи с этим требованием , Ca 2+, визуализируя переходные изменения внутриклеточной концентрации Са 2+ является ключевой интерес. Исторически сложилось так, модельные организмы были отобраны для исследования по активации яиц на основе размера и доступности их яиц. Различные подходы к визуализации были использованы , чтобы следовать и количественной оценки изменений во внутриклеточной концентрации Са 2+ в этих системах, в том числе: Фотобелок акворина в Оризии рыбы 3; Ca 2+ чувствительные флуоресцентные красители , такие как Fura-2 в морских ежей и хомяка 4,5; и кальций - зеленый-1-декстрана в Xenopus 6. Генерация и улучшение генетически кодируемых показателей кальция (GECIs) превратило способность визуализировать динамику Ca 2+ в естественных условиях 7. Эти генетические конструкции выражаются в конкретных тканях и ограничить потребность в препаратах инвазивного ткани 8. GCaMPs являются зеленый флуоресцентный белок (GFP) , класс , основанный на GECIs , которые были очень эффективны в связи с их высоким сродством Ca 2+, отношение сигнал-шум и способность быть настроены 9-11. В присутствии ионов Са 2+, комплекс GCaMP претерпевает ряд конформационных изменений, начиная с связывание Са 2+ с кальмодулин, что приводит к увеличению флуоресцентной интенсивности GFP компонента 9. GCaMPs широко используются в исследованиях Drosophila нейронов визуализировать изменения внутриклеточного кальция 12. Недавние Applicatiпо технологии GCaMP визуализации Ca 2+ в зрелых яиц дрозофилы показал одну переходную Ca 2+ волну при активации яйца 13,14. Волны Ca 2+ могут быть визуализированы при малом увеличении во время овуляции в естественных условиях 13 или при большем увеличении с использованием ех естественных условиях анализа активации 13,14. В естественных условиях экс анализа, отдельные зрелые ооциты выделяют из яичников и активируют с использованием гипотонического раствора, именуемых активации буфера, которое было показано , чтобы резюмировать события активации 15-17 в естественных условиях. Этот анализ ех естественных условиях позволяет легко визуализировать с высоким разрешением Са 2+ волны при различных экспериментальных условиях , включая фармакологическую нарушения, физических манипуляций и генетических мутантов. Эта статья демонстрирует получение зрелых яиц дрозофилы для активации экс естественных условиях и гое последующая микроскопия используется для визуализации волны Ca 2+ с помощью GCaMP. Такой подход может быть использован для тестирования инициации и контроля волны Ca 2+ и зондировать вниз по течению результатов.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="999">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dry active yeast</td>
			<td style="width:373px;">Fleischman&#8217;s</td>
			<td style="width:243px;">#2192</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>Various will work</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lamp</td>
			<td>Mircotec Fibre optic</td>
			<td>MF0-90</td>
			<td>Various will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Medical wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Corporation</td>
			<td>KLEW3020&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Marker pen</td>
			<td>Stabilo</td>
			<td>841/46</td>
			<td>OHPen universal, black - available in most stationary shops. Superfine Width 0.4mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CO2 pad</td>
			<td>&#160;Genesee Scientific</td>
			<td>59-114 (789060 Dutscher)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slip No. 1.5, 22 x 50mm</td>
			<td>International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm</td>
			<td>Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" rowspan="2" style="height:40px;">Halocarbon oil, series 95</td>
			<td rowspan="2">Halocarbon Products Corp.</td>
			<td>Distributor in Europe:</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Solvadis (GMBH)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oil 10 S</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td align="right">24627.188</td>
			<td>Can be used instead of Halocarbon oil, series 95</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>Whilst these tool should be clean, use of an autoclave is not necessary, ethanol would be sufficient.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Probe</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10140-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass pipette</td>
			<td>Fisherbrand,</td>
			<td>FB50251</td>
			<td>Pasteur Pipettes, glass, unplugged, 150mm length&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vial</td>
			<td style="width:373px;">Regina Industries</td>
			<td style="width:243px;">P1014</td>
			<td>GPPS&#160; 80mm x 25mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging calcium in drosophila at egg activation

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a 'Ca2+ wave'. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.

Вот мы продемонстрировали , как подготовить зрелые яйца дрозофилы для активации экс естественных условиях. Яйца , выражающие Geci включить визуализацию Ca 2+ динамика при активации яйца и начало эмбрионального развития (рисунок 1). Следует отметить , что в зависимости от GCaMP используется, в частности , наличие миристоил группы, результаты могут иметь небольшие качественные отличия 13 14. Кроме того, мы продемонстрировали роль функциональной актина во время активации яиц путем добавления ингибитора полимеризации актина, цитохалазином D, в буфер активации (рисунок 2) 14. Требование к цитоскелета при активации яиц сохраняется. В С. Элеганс, после оплодотворения, цитоскелета компоненты реорганизованы для подготовки эмбриона одноклеточных для первого асимметричного деления 21,22. В морских ежей, нарушение cytoskeleTal реорганизации после активации было показано , что влияет на клеточный цикл путем предотвращения образования цикла сократительную 23. Роль актина в опосредовании волну Са 2+ и ее вниз по течению функцию при активации яиц у дрозофилы остается полностью выяснены. У Drosophila, со-визуализация Са 2+ волн и цитоскелета может быть достигнуто с помощью этого анализа , исключая виво активации. Временные ряды нескольких каналов могут быть приобретены и динамика внутриклеточного Ca 2+ могут быть сопоставлены с изменениями в организации актина в ооцитах (рисунок 3). <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig1.jpg" /> Рисунок 1:. Единый Ca 2+ волна в серии Drosophila Яйцо Время активации экс естественных условиях зрелых Drosophila яйца , выражающую UASt- myrGCaMP5 следуя аddition буфера активации (АГ). Повышение цитоплазматического Са 2+ берет свое начало в заднем полюсе (B) , а затем распространяет (BF) со средней скоростью около 1,5 мкм / с. Инициирование волны, как правило, наблюдается в течение 3 мин после добавления буфера активации. После активации внутриклеточных уровней кальция зрелого яйца возвращается к предварительной активации уровней (G, H). См дополнительный фильм 1 (общее время 33 мин). Шкала бар = 50 мкм. Максимальная проекция = 40 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig1large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig1large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="фигура 2" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig2.jpg" /> Рисунок 2: Добавление Цитохалазин D к активации буфера возмущает Ca2+ Распространение волн. Временных рядов экс виво зрелых Drosophila яйцеклетку , выражающую UASt- myrGCaMP5 после добавления активации буфера , содержащего 10 мкг / мл цитохалазином D конечной концентрации (AH). В то время как 2+ волна Са инициируется на заднем полюсе (а), она скомпрометирована и не доходит переднюю часть яйца (F) (белые головки стрелок обозначают фронт волны). Никаких дополнительных не наблюдалось изменения Са 2+ в течение 30 мин). См дополнительный фильм 2 (общее время 30 мин). Шкала бар = 50 мкм. Максимальная проекция = 40 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig2large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig2large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig3.jpg" /> Рисунок 3: Co-визуализация актин и Са 2+ при ЕАктивация в GG серии дрозофилы. Время экс естественных условиях зрелых Drosophila яйца , выражающую UASt- myrGCaMP5 (Cyan) и UASP -F-Tractin.tdTomato (Magenta) после добавления буфера активации (AH). Са 2+ волна инициирует от заднего полюса и восстанавливается как показано на рисунке 1. Актина , похоже, меняется с течением времени, белые наконечники стрел (А против Н). Отсутствие Ca 2+ детектирования сигнала в центре зрелого яйца из - за перемещения образца во время захвата изображения. Шкала бар = 50 мкм. Максимальная проекция = 40 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig3large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig3large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation at JoVE.com

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

В данной статье описывается адаптируемый экс виво протокол для визуализации Ca 2+ во время активации яйца у дрозофилы.

Визуализации кальция в<em&gt; Drosophila</em&gt; При активации Egg

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-визуализация<em&gt; Drosophila</em&gt; Куколки глаз

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Вертикальный Визуализация<em&gt; Drosophila</em&gt; Яйцо палат

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Отслеживание клеток в GFP-трансгенной данио рерио Использование системы Photoconvertible PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Методы Изучить лимфа железой и гемоцитах в<em&gt; Drosophila</em&gt; личинки

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

В естественных условиях Imaging мышц сухожилие морфогенеза в куколки дрозофилы

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Анализ динамики actomyosin на местных сотовых и тканевых весов использованием покадровой фильмы культурных Дрозофила яйцо камер

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging и анализ мышечных сокращений в дрозофилы эмбриона

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Размораживание, культивирования и Cryopreserving дрозофила клеточных линий

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Флуоресцентные изображения кальция и последующей на месте гибридизации для нейрональной характеристики прекурсоров в Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Изображение Внутриядерных Actin Роды в Live Heat подчеркнул Drosophila эмбрионов

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...