Name: imaging calcium in drosophila at egg activation
Uploaded: 2016-08-06T14:00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation at JoVE.com

Biz bu yazının hazırlanması sırasında yardım için Laura Bampton, Alex Davidson, Richard Parton, Arita Acharya&#39;sına minnettarız; Yumurta aktivasyonu üzerine tartışmalar Mariana Wolfner; Görüntüleme destek Mat Wayland; ve Nan Hu laboratuvarda genel destek için. Bu çalışma TTW Cambridge, ISSF Üniversitesi [hibe sayısı 097.814] tarafından desteklenmiştir.

Not: Aksi belirtilmedikçe oda sıcaklığında tüm adımları uygulayın. 1. Diseksiyon için hazırlanıyor Not: Burada anlatılan adımlar E. Gavis, Princeton Üniversitesi&#39;nden &amp; Weil et ile uyumludur. ark. 18. görüntüleme önce aşağıdaki adımları iki gün uygulayın. <ol><li> Katı gıda yaklaşık 10 ml ihtiva eden bir uçucu şişeye alın ve bir köşede kurutularak maya küçük bir miktar eklemek, 1 g yeterlidir. Not: sinek şişeleri ya da gıda hakkında bilgi &#39;Drosophila Bakım&#39; 19 için bkz. </li><li> maya hidrat 3 damla su - 1 eklenir. </li><li> 45 ° açıyla kenara flakon ayarlayın ve 3 izin - su almak için maya için 5 dk. </li><li> Maya su emici olsa da, (en son ortaya çıkmıştır ki (GCaMP5 olarak da adlandırılır), bir myristoy küvet-VP16GAL4 tahrik UASt- MYR GCaMP5 20 eksprese eden sineklerin bir şişe seçinGCaMP5 arasında yonunun formu) yumurta membrana Geci cepheye ile gürültü oranı yüksek bir sinyal sağlamak için seçilmiştir. </li><li> CO 2 gazı ile şişe içinde sinekler Anesteziyoloji. Islak gıda sinekler kaybetmek olmayacak şekilde ters şişe tutmak için emin olun. </li><li> CO 2 ped üzerine anestezi sinekler İpucu ve sıralama 10-15 kadın ve bir mikroskop altında bir fırça kullanarak 5 erkek. Not: diseksiyon için sağlıklı kadın temin etmek erkekleri kapsayacak şekilde standarttır. </li><li> Adım 1.3 şişe hazır olduğunda, flakon seçilen sinekler ekleyin. sinekler aktif hale gelene kadar şişe yatay tutmak için özen gösterin. </li><li> Yaklaşık 36 saat boyunca 25 ° C&#39;de şişe yerleştirin. </li><li> Şişe veya ıskarta CO 2 pad kalan sinekler dönün. </li></ol> 2. Diseksiyon Drosophila Ovaryumlar Not: Burada tarif edilen adımlar, Weil ve diğerleri ile uyumludur. ark. <s&gt; 18 kadar. <ol><li> 36 saat sonra, CO 2 ile mayalı flakonundan sinekler uyuşturan. </li><li> Flakon içindeki sinekler CO 2 ped üzerine bunları İpucu anestezi sonra bir mikroskop altında bir boya fırçası ile sıralanacak. </li><li> Bir kadın seçin. </li><li> kadın iki yumurtalıklar izole edin. Tam detaylı protokol için Weil bakınız. ark. 18. Özetle: <ol><li> No. 1.5, 22 x 40 mm örtücü kısım üzerine oksijenli halokarbon bir yağ (Seri 95) küçük bir damla koyun. </li><li> Karın anterior forseps ile dişi kavrayın. </li><li> Diseksiyon mikroskobu altında kadın tutarak, yavaşça dişinin posterior kaldırmak için forseps ikinci seti kullanın. </li><li> İkinci forseps posterior doku siliniz. </li><li> Karın posterior anterior ikinci forseps ile karın boşluğuna sıkın. İki opak yumurtalıkların zaman FEMA dışında forseps ayrılmamak gerekirle. </li><li> yağın içine yumurtalıklar dokunun. </li><li> forseps kapalı silerek forseps herhangi bir doku çıkarın. </li><li> bir sinek, üç lamelleri elde etmek için her içeren yumurtalık - Bu adımları (2.4.7 2.4.1) tekrarlayın. </li></ol></li></ol> 3. Ayırma Bireysel Olgun Yumurta <ol><li> Adım 2.4 ilk lamel, 4X ayarlanmış büyütme ile standart bir mikroskop altında, yumurtalık yırtarak iki yumurtalık ayırın. </li><li> herhangi bir yumurta odaları delinme özen tek yumurtalık merkezi haline kapalı forseps bir çift tanıtmak. </li><li> Bir sonraki kapalı forseps yumurtalık merkezine standart bir diseksiyon probu yerleştirin. </li><li> Yavaşça olgun yumurta (evre 14 yumurta odaları) bulunduğu arka kutup, doğru yumurtalık yoluyla diseksiyon prob sürükleyin. </li><li> Tekrar 3.1 adımları - 3,4 2-5 kat yumurtalık ve yumurta sayısı boyutuna bağlı olarak değişir. Not: CO2 ilavesi </sub&gt; tipik önceden yatırılan yumurtalardan daha yükseltilmiş dorsal uzantıları ile büyük görünecek tek bir yumurta birikimi neden olur. Zaten kadın içinde aktif beri Bu yumurta görüntüleme için atılmalıdır. Not: Olgun yumurta yumurtalık bağ dokusu kolayca ayırmak için muhtemeldir. </li><li> Hiçbir olgun yumurta yumurtalık dışında görünür durumdaysa, diseksiyon prob ile alay yavaşça devam ediyor. </li><li> lamel merkezinde bir çizgi 5 - olgun yumurta yumurtalık dışında lamel görünür olduğunda, 3 manevra. Not: En iyi sonucu elde etmek için, yumurta kenarı boyunca yavaşça prob çalıştırın. Not: Bu yumurtayı zarar verebileceği dorsal uzantıları çekerek kaçının. Not: Gelecekteki görüntüleme set-up bağlı olarak maksimum görüntüleme alanı için lamel dik yaklaşık 200 mikron ayrı yumurta hizalayın. </li><li> hizalanmış sonra, f kullanılarak hizalanmış yumurta uzağa sürükleyerek yumurtalık dokusunun geri kalanını kaldırmakorceps. </li><li> Tıbbi silme köşesinde ile dabbing fazla yağı çıkartın. Tıbbi kaybolur temas gibi olgun yumurta silin olgun yumurta dokunmamaya özen gösterin. </li><li> mikroskop altında örnek bulma basitleştirmek için bir işaretleyici ile lamel bir crosshair çizin. </li><li> güvenli bir yerde lamel ayarlayın ve 5 için dinlenmek için lamel hazırlanan yumurta odaları bırakın - 10 dakika. Yumurta yağda yerleşmek için bu izin verir. Numuneler 1 saat sonrası diseksiyonu kadar kullanılabilmektedir. </li><li> onlara yumurtalıkların ile lamelleri geri kalanı için 3.11 - Tekrar 3.1 adımları. </li></ol> 4. Görüntüleme için hazırlanıyor <ol><li> Oda sıcaklığına hazırlanan aktivasyon tamponu 15 getirin. Not: aktivasyon tamponu hipotonik tampon maddesi olup: 3.3 mM NaH 2 PO 4, 16.6 mM KH 2 PO 4, 10 mM NaCI, 50 mM KCI, bir 1 ile pH 6.4&#39;e getirildi, 5% polietilen glikol 8000, 2 mM CaCl2,: NaOH 5 oranı: KOH.Daha fazla bilgi için Mahowald, 1983 15. Aktivasyon tamponu alikoları en fazla 2 hafta içinde C ay boyunca 4 ° C&#39;de -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> Dikkatle görüntüleme tesisine hazırlanan lamelleri, aktivasyon tampon ve cam pipetler taşıyın. Not: Bir geniş alan, konfokal, eğirme disk veya hafif levha mikroskop kullanılabilir. Biz ters bir mikroskop kullanılarak öneririz. Bizim Örnek sonuçlar konfokal mikroskop kullanılarak elde edilmiştir. </li><li> tüm olgun yumurta görüntüleme için uygun bir hedef (burada: 20X 0.7 NA) seçilmelidir. </li><li> Mikroskop sahneye ilk hazır lamel monte edin. Sahnede lamelleri kırmamaya özen gösterin. </li><li> Kalitatif aktivasyon için olgun bir yumurta haznesi ile bir görüş alanı seçin. Görüntü delinmiş yumurta odaları veya zarında blebbing olanlar etmeyin. Not: adımlar 4.6 için - 4.7, yazılım komutları mikroskop ve üreticiye bağlı olarak değişir. </li><li> Set görüntüleme para(- 580 ila 500 nm) standart GFP uyarılma (488 nm) ve emisyon metre. Ayrıca olgun yumurta ve yerinden yağ görselleştirmek ve yönlendirmek amacıyla bir aydınlık alan görünümü kurdu. </li><li> Tam Z-yığını olgun yumurta görünür düşük Z-düzlemini seçin ve ayarlayın adım başı 40 mikron yaklaşık 2 mikron için alınacak. Z-yığını edinimi arasında hiçbir gecikme yok yani parametreleri ayarlayın. Yaklaşık 30 dakika boyunca yakalamak için zaman serisi ayarlayın. </li></ol> 5. Görüntüleme Ex Vivo Yumurta Aktivasyon <ol><li> görüntü yakalama başlatın. </li><li> 2 tam Z-yığınlar elde edilecek - 1 bekleyin. Bu aktivasyon öncesinde olgun yumurta gösterir. </li><li> Bir cam pipet içine aktivasyon tampon yaklaşık 300 ul çekin. </li><li> olgun yumurta görüntülü doğrudan yukarıda kadar lamel üzerinde 45 ° &#39;lik açıyla aktivasyon tampon içeren cam pipet ucu konumlandırma, yavaş yavaş ışın yoluna pipet hareket ettirin. Cam pipet gerekirBu yağ, 2 cm - 1 olabilir. </li><li> cam pipet en fazla 5 saniye içinde aktivasyon tamponu 2 damla - 1 eklenir. Bu yağ yerinden gerekir. aşırı aktivasyon tampon ekleyerek veya olgun yumurta değiştirmesine neden olabilir cam pipet ile yumurta dokunmaktan kaçının. Bu amaç ve lamel arasındaki immersiyon oluşturmak için odak düzlemi veya hava kabarcıkları bir değişiklik neden olabilir pipet ile lamel dokunmamaya özen gösterin. </li><li> görüntü alımı sırasında aktivasyon tampon ekleyerek iken, yağ aktivasyon tampon yerinden edilmiş olmasını sağlamak için parlak alan kanalı kontrol. Not: Bu ilk nedeni ışın yolu kırma pipet bir gölge olarak görünür ama aynı zamanda küçük yağ damlacıkları görünümünü neden olacaktır. Bazı yağ damlacıkları deneysel sonuçları ve görüntü kalitesini etkiler olgun yumurta ile ilişkili kalabilir. </li><li> 5 - Yağ aktivasyon tampon tekrar ilk ilavesiyle yerinden değilse 5.4 adımları0,6. </li><li> Yağ başarıyla yerinden sonra, zaman serisi tamamlanana kadar çalışmasına izin verin. Not: aktivasyonu oosit şişlik, bazı yumurta odaları aktivasyon tampon ilavesi üzerine odak düzlemi veya görüş alanının dışında önemli ölçüde hareket edecektir nedeniyle. Bu durumda, satın durdurmak ve bir sonraki lamel monte edin. </li><li> görüntü sırası alımını tamamlandıktan sonra, verileri kaydetmek. </li></ol> 6. Post-satın alma Görüntü İşleme <ol><li> Fiji (http://fiji.sc/Downloads#Fiji) veya eşdeğer görüntü işleme yazılımı kullanarak veri seti açın ve analiz için ilgili dosyaları seçin. </li><li> elde edilen verilerin bir projeksiyon oluşturmak için seçin: Image&gt; Yığınlar&gt; Z proje. </li><li> Bir başlangıç ​​Z-dilim ve bir stop Z-dilim, genellikle bütün bölümünü seçin. tipik &#39;Maksimum Şiddeti&#39; olarak ayarlanmış bir projeksiyon türü seçin. dizi için seçilen ayarları uygulamak için onay kutusu &#39;Tüm Zamanların Çerçeveler&#39; kontrol edin. </li><li> EğerBirden fazla floresan kanal kompozit yapmak, renkler arasındaki hareketi sağlamak için Kanallar aracını kullanın ya da görüntü gri tonlama yapmak, görüntülenmiştir edilmiştir. Resim Seç&gt; Renkler&gt; Kanallar aracı. </li><li> Görüntü parlaklığını ayarlamak basıp Görüntü kontrast&gt;&gt; Parlaklık / Kontrast ayarlama için. </li><li> tek bir görüntü vermek için, ilgili çerçeve ve Dosya&gt; Farklı Kaydet&gt; JPEG, ya da herhangi bir tercih edilen biçimine zaman ölçeği kaydırıcıyı hareket ettirin. </li><li> Verilen dosya için bir konum ve başlık seçin, ardından kaydedin. görüntüleme yazılımından kare hızını Not resmin üzerine bir zaman damgası vermek için gerekli olacaktır. </li><li> bir film olarak zaman serisini vermek için seçin: Dosya&gt; Farklı Kaydet&gt; AVI, sonra (~ saniyede 7 kare) kare hızını seçin. </li><li> Verilen dosya için bir konum ve başlık seçin, ardından kaydedin. </li><li> Fiji formatında düzeltilmiş dosyayı kaydetmek için, Dosya&gt; Kaydet. </li></ol>

<ol>
	<li>Stricker, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+biology+of+calcium+signaling+during+fertilization+and+egg+activation+in+animals.">Comparative biology of calcium signaling during fertilization and egg activation in animals.</a> Dev Biol. 211 (2), 157-176 (1999).</li><li>Horner, V. L., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transitioning+from+egg+to+embryo:+triggers+and+mechanisms+of+egg+activation.">Transitioning from egg to embryo: triggers and mechanisms of egg activation.</a> Dev Dyn. 237 (3), 527-544 (2008).</li><li>Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+free+calcium+wave+traverses+the+activating+egg+of+the+medaka,+Oryzias+latipes.">A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes.</a> J Chem Biol. 76 (2), 448-466 (1978).</li><li>Fujiwara, T., Nakada, K., Shirakawa, H., Miyazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+inositol+trisphosphate-induced+calcium+release+mechanism+during+maturation+of+hamster+oocytes.">Development of inositol trisphosphate-induced calcium release mechanism during maturation of hamster oocytes.</a> Dev Biol. 156 (1), 69-79 (1993).</li><li>Hafner, M., Petzelt, C., Nobiling, R., Pawley, J. B., Kramp, D., Schatten, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wave+of+free+calcium+at+fertilization+in+the+sea+urchin+egg+visualized+with+fura-2.">Wave of free calcium at fertilization in the sea urchin egg visualized with fura-2.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 9 (3), 271-277 (1988).</li><li>Fontanilla, R. A., Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+sperm-induced+calcium+wave+in+Xenopus+eggs+using+confocal+microscopy.">Characterization of the sperm-induced calcium wave in Xenopus eggs using confocal microscopy.</a> Biophys J. 75 (4), 2079-2087 (1998).</li><li>Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+Ca2++indicators:+using+genetics+and+molecular+design+to+understand+complex+physiology.">Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology.</a> J Physiol. 578, 55-67 (2007).</li><li>Douglass, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> New Techniques in Systems Neuroscience. , (2015).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging.">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li><li>Chen, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Wang, J., Wong, A., Flores, J., Vosshall, L., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain.">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112 (2), 271-282 (2003).</li><li>Kaneuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+waves+occur+as+Drosophila+oocytes+activate.">Calcium waves occur as Drosophila oocytes activate.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 791-796 (2015).</li><li>York-Andersen, A. H., Parton, R. M., Bi, C. J., Bromley, C. L., Davis, I., Weil, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+and+rapid+calcium+wave+at+egg+activation+in+Drosophila.">A single and rapid calcium wave at egg activation in Drosophila.</a> Biol Open. 4 (4), 553-560 (2015).</li><li>Mahowald, A. P., Goralski, T. J., Caulton, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+activation+of+Drosophila+eggs.">In vitro activation of Drosophila eggs.</a> Dev Biol. 98 (2), 437-445 (1983).</li><li>Page, A. W., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+meiotic+divisions+in+Drosophila+oocytes.">Activation of the meiotic divisions in Drosophila oocytes.</a> Dev Biol. 183 (2), 195-207 (1997).</li><li>Horner, V. L., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stimulation+by+osmotic+and+hydrostatic+pressure+activates+Drosophila+oocytes+in+vitro+in+a+calcium-dependent+manner.">Mechanical stimulation by osmotic and hydrostatic pressure activates Drosophila oocytes in vitro in a calcium-dependent manner.</a> Dev Biol. 316 (1), 100-109 (2008).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging.">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> J Vis Exp. (60), (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essentials+of+Biology+1:+yeast,+Drosophila+and+C.+elegans.+Drosophila+Maintenance.">Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila Maintenance.</a> JoVE Science Education Database. , (2016).</li><li>Melom, J. E., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+a+NCKX+Eliminates+Glial+Microdomain+Calcium+Oscillations+and+Enhances+Seizure+Susceptibility.">Mutation of a NCKX Eliminates Glial Microdomain Calcium Oscillations and Enhances Seizure Susceptibility.</a> J Neurosci. 33 (3), 1169-1178 (2013).</li><li>Munro, E., Nance, J., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+flows+powered+by+asymmetrical+contraction+transport+PAR+proteins+to+establish+and+maintain+anterior-posterior+polarity+in+the+early+C.+elegans+embryo.">Cortical flows powered by asymmetrical contraction transport PAR proteins to establish and maintain anterior-posterior polarity in the early C. elegans embryo.</a> Dev Cell. 7 (3), 413-424 (2004).</li><li>Maruyama, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGG-3+regulates+cell-surface+and+cortex+rearrangements+during+egg+activation+in+Caenorhabditis+elegans.">EGG-3 regulates cell-surface and cortex rearrangements during egg activation in Caenorhabditis elegans.</a> Curr Biol. 17 (18), 1555-1560 (2007).</li><li>Wong, G. K., Woods, M. A., Szymczak, R. K., Gavlik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+normal+actin+cytoskeletal+reorganization+affects+cell+cycle+time+in+fertilized+sea+urchin+eggs.">Disruption of normal actin cytoskeletal reorganization affects cell cycle time in fertilized sea urchin eggs.</a> Mol Biol Cell. 15, 23 (2004).</li><li>Horner, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+calcipressin+sarah+is+required+for+several+aspects+of+egg+activation.">The Drosophila calcipressin sarah is required for several aspects of egg activation.</a> Curr Biol. 16 (14), 1441-1446 (2006).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

The first critical step in this protocol is isolating the mature eggs without damage. This can be achieved by gentile maneuvering of the eggs with the dissecting probe. Practice will enable this manipulation to be executed without damage to the eggs. A second crucial step is avoiding the loss of the sample when activation buffer is applied to the mature egg in oil. Application of the activation buffer should be done slowly and without contact with the coverslip. This step can be challenging if the microscope set-up does not allow for an easy access to the sample. Moving axillary parts of the microscope, such as a temperature incubator, is advisable. 
Modifications to this protocol can be made in order to visualize other fluorescently tagged factors, instead of Ca2+ at egg activation. More generally, different stages of Drosophila development or the results of adding a different buffer could be analyzed using this protocol. 
Troubleshooting may be required if the settings on the microscope are not optimal for visualizing the signal from the sample. This can be achieved by increasing or decreasing the laser power, altering capture range and adjusting the Z-stack parameters. Another issue might be eggs consistently moving out of the field of view upon the addition of activation buffer. If this happens regularly, allow the mature eggs to settle on the coverslips for a longer period of time, 15 to 20 minutes. Beware that using a higher viscosity oil will alter the displacement of the oil by activation buffer. 
This technique presented here is limited by the working distance of the objective, dehydration of the mature eggs and the ability to dissect the mature eggs without damage. However, when compared to in vivo imaging methods where the mature oocyte passes through the adult female and is deposited 13, our method enables more spatial resolution, the option to physically manipulate the mature egg before activation and the ability to test the role of egg activation without fertilization. 
There are many potential future applications of this technique, including testing reporter constructs for cellular components at egg activation and visualizing the Ca2+ wave in mutant backgrounds 14,24. Together with experimental and genetic tools, the ex vivo egg activation assay presented here enables the study of the trigger, propagation and downstream effects of the universally conserved Ca2+ wave.

Yumurta (oosit) aktivasyonu A hücre içi Ca değişim 2+ konsantrasyon tüm çalışılan organizmaların 1,2 korunmuş bir bileşenidir. Bu olay, hücre döngüsü yeniden başlatılması ve depolanan mRNA çevirisi de dahil olmak üzere, Ca 2 + -bağımlı süreçler, geniş bir yelpazede başlatır. Nedeniyle hücre içi Ca 2 + konsantrasyonlarda geçici değişiklikler görselleştirme Ca 2+ için bu şartı, anahtar ilgi olmuştur. Tarihsel olarak, Model canlılar kendi yumurta büyüklüğüne ve durumuna bağlı olarak yumurta aktivasyonu üzerinde çalışmalar için seçildi. Çeşitli görselleştirme yaklaşımlar da dahil olmak üzere, bu sistemlerde 2 + konsantrasyonları takip ve hücre içi Ca değişiklikleri ölçmek için kullanılmıştır: Medaka balık 3 photoprotein aequorin; Böyle Fura-2 deniz kestanesi ve hamster 4,5 gibi ca 2+ duyarlı floresan boyalar; ve kalsiyum-yeşil 1-dekstran Xenopus 6. Üretim ve genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (Geçiş) iyileştirilmesi vivo 7 Ca 2 + dinamiklerini görselleştirmek için yeteneği dönüştürdü. Bu genetik yapılar belirli dokularda ifade ve invaziv doku hazırlıkları 8 ihtiyacını sınırlamak vardır. GCaMPs nedeniyle yüksek Ca 2 + afinite çok etkili olmuştur Geçiş yeşil flüoresan proteini (GFP) merkezli sınıf, sinyal-gürültü oranı ve kapasite 9-11 özelleştirilmesi için. Ca + 2 varlığında, GCaMP kompleksi, kalmodulin Ca 2+ bağlanması ile başlayan yapısal bir dizi değişiklik maruz GFP bileşen 9 artmış floresan yoğunluğu ile sonuçlanır. GCaMPs yoğun hücre içi Kalsiyum 12 değişiklikleri görselleştirmek için Drosophila nöronlar üzerindeki araştırmalarda kullanılmıştır. son UygOlgun Drosophila yumurta 2+ Ca görselleştirmek için GCaMP teknoloji yumurta aktivasyonu 13,14 tek bir geçici Ca 2 + dalga ortaya koymuştur. Ca 2 + dalga bir ex vivo aktivasyon tahlil 13,14 kullanarak in vivo 13 yumurtlama sırasında ya da daha yüksek büyütmede düşük büyütme görülebilir. Ex vivo deneyde, tek tek, olgun oosit överlerden izole edildi ve hipotonik bir solüsyon kullanılarak çalıştırılır, in vivo aktive 15-17 olaylarını özetlemek gösterilmiştir aktivasyon tamponu olarak anılacaktır. Bu ex vivo deney farmakolojik bozulma, fiziksel manipülasyonlar ve genetik mutantlar dahil olmak üzere farklı deneysel koşullar altında Ca 2 + dalganın kolay yüksek çözünürlüklü görselleştirme sağlar. Bu makale ex vivo aktivasyonu ve th için olgun Drosophila yumurta hazırlanmasını göstermektedirGCaMP kullanarak Ca 2 + dalga görselleştirmek için kullanılan e sonraki mikroskopi. Bu yaklaşım Ca 2 + dalganın başlaması ve kontrolünü test etmek ve alt sonuçlarını araştırmak için kullanılabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="999">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dry active yeast</td>
			<td style="width:373px;">Fleischman&#8217;s</td>
			<td style="width:243px;">#2192</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>Various will work</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lamp</td>
			<td>Mircotec Fibre optic</td>
			<td>MF0-90</td>
			<td>Various will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Medical wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Corporation</td>
			<td>KLEW3020&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Marker pen</td>
			<td>Stabilo</td>
			<td>841/46</td>
			<td>OHPen universal, black - available in most stationary shops. Superfine Width 0.4mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CO2 pad</td>
			<td>&#160;Genesee Scientific</td>
			<td>59-114 (789060 Dutscher)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slip No. 1.5, 22 x 50mm</td>
			<td>International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm</td>
			<td>Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" rowspan="2" style="height:40px;">Halocarbon oil, series 95</td>
			<td rowspan="2">Halocarbon Products Corp.</td>
			<td>Distributor in Europe:</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Solvadis (GMBH)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oil 10 S</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td align="right">24627.188</td>
			<td>Can be used instead of Halocarbon oil, series 95</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>Whilst these tool should be clean, use of an autoclave is not necessary, ethanol would be sufficient.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Probe</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10140-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass pipette</td>
			<td>Fisherbrand,</td>
			<td>FB50251</td>
			<td>Pasteur Pipettes, glass, unplugged, 150mm length&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vial</td>
			<td style="width:373px;">Regina Industries</td>
			<td style="width:243px;">P1014</td>
			<td>GPPS&#160; 80mm x 25mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging calcium in drosophila at egg activation

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a 'Ca2+ wave'. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.

Burada ex vivo aktivasyonu için olgun Drosophila yumurta nasıl hazırlanacağını göstermiştir. 2+ dinamikleri yumurta aktivasyonu Ca bir GECI sağlayacak görüntüleme ve embriyonik gelişim başlangıcı (Şekil 1) ifade yumurta. GCaMP bağlı özellikle miristoil grubunun varlığı sonuçları hafif niteliksel farklılıklar 13 14 sahip olabilir, kullanılan not edilmelidir. Ayrıca aktin polimerizasyon inhibitörünün eklenmesiyle yumurta aktivasyonu sırasında fonksiyonel aktin rol göstermiştir, cytochalasin D, aktivasyon tampon (Şekil 2) 14. Yumurta aktivasyonu hücre iskeletinin için bir gereklilik korunur. C. elegans, gübreleme sonrasında iskelet parçaları ilk asimetrik bölünme 21,22 için tek hücreli embriyo hazırlamak için yeniden düzenlenir. cytoskele deniz kestanesi olarak, bozulmaaktivasyon aşağıdaki tal yeniden organizasyon kasılma halka oluşumunu 23 önleyerek hücre döngüsünü etkilediği gösterilmiştir. Ca 2 + dalga ve Drosophila yumurta aktivasyonu onun aşağı fonksiyonunu aracılık aktin rolü tam olarak aydınlatılamamıştır gerekmektedir. Drosophila olarak, Ca2 + ve dalga aktin hücre iskeletinin co-görselleştirme bu ex vivo aktivasyon tahlili kullanılarak elde edilebilir. Birden fazla kanal Zaman serisi elde edilebilir ve hücre içi Ca 2+ dinamikleri oosit (Şekil 3) aktin organizasyonu değişiklikleri ile uyumlu olabilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig1.jpg" /> Şekil 1:. Ex vivo Drosophila Yumurta Aktivasyon Süresi serisinde Tek Ca 2+ Dalga a aşağıdaki UASt- myrGCaMP5 ifade Drosophila yumurta olgunaktivasyon tamponu (AH) ve Ayrıca bu yöntem. Sitoplazmik Ca + 2 artış yaklaşık 1.5 mm / sn arasında bir ortalama hız ile arka kutup (B) ve düzende (BF) de kaynaklanır. dalga başlatılması tipik olarak aktivasyon tamponu ilave 3 dakika içinde görülmektedir. Aktivasyondan sonra, olgun yumurta hücre içi kalsiyum seviyeleri seviyeleri (G, H) etkinleştirme öncesi geri döner. tamamlayıcı filmi 1 (toplam süresi 33 dk) bakınız. Ölçek çubukları 50 mikron =. Maksimum projeksiyon 40 mikron =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig2.jpg" /> Şekil 2: Aktivasyon Tampon bozan Ca Sitokalasin D ilavesi2+ dalga yayılımı. Ex vivo zaman serileri 10 ug / ml sitokalasin D nihai konsantrasyon (AH) ihtiva eden aktivasyon tamponu ilave edildikten sonra UASt- myrGCaMP5 ifade Drosophila yumurta olgunlaşması. Ca 2 + dalga arka kutup (A) başlatılır iken, o tehlikeye ve yumurta (F) anterior bulmuyor (beyaz ok başları dalga ön göstermek). Daha başka Ca 2+ değişiklikleri), 30 dakika boyunca gözlenmiştir. tamamlayıcı filmi 2 (toplam süresi 30 dk) bakınız. Ölçek çubukları 50 mikron =. Maksimum projeksiyon 40 mikron =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54311/54311fig3.jpg" /> Şekil 3: E&#39;de Aktin ve Ca 2+ Co-görselleştirmeex vivo Drosophila. Zaman serisinde gg Aktivasyon UASt- myrGCaMP5 (Mavi) ve UASP -F-Tractin.tdTomato (Eflatun) aktivasyon tamponu aşağıdaki ek (AH) ifade Drosophila yumurta olgun. Ca 2 + dalga arka kutup başlatır ve Şekil olarak kurtarır 1. Aktin, beyaz ok ucu (H vs A) zamanla değişiyor gibi görünüyor. Olgun yumurta merkezinde Ca 2 + sinyal tespiti olmaması görüntü yakalama sırasında numunenin hareketine bağlıdır. Ölçek çubukları 50 mikron =. Maksimum projeksiyon 40 mikron =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation at JoVE.com

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Bu makalede, Drosophila yumurta aktivasyonu sırasında 2+ Ca görselleştirmek için uyarlanabilir ex vivo protokolü açıklanır.

Görüntüleme Kalsiyum<em&gt; Drosophila</em&gt; Yumurta Aktifleştirme de

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Canlı-görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Göz

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Dik Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Yumurta Odaları

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Photoconvertible PSmOrange Sistemi kullanılarak GFP transgenik zebrafish hücreleri izleme

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Yöntemler Lenf Bezi ve Hemocytes içinde incelemek için<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Vivo Kas-tendon morfogenez Drosophila pupa içinde görüntüleme

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Kültür Drosophila Egg Chambers Time-Lapse filmler kullanarak yerel hücresel ve doku ölçeklerde Actomyosin dinamikleri Analizi

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Canlı görüntüleme ve Drosophila embryo kas kasılmaları Analizi

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Çözdürme, kültür ve Drosophila hücre hatları Cryopreserving

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Xenopus laevis'te Nöronal Öncül Karakterizasyonu için Floresan Kalsiyum Görüntüleme ve Daha Sonra Yerinde Hibridizasyon

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Canlı Isı Stresli Drosophila Embriyolarında İntranükleer Akin Çubuklarının Görüntülenmesi

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...