Name: embryo microinjection and electroporation in the chordate ciona intestinalis
Uploaded: 2016-10-16T15:00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis at JoVE.com

This work was supported by the University of Innsbruck, Austria, and the Austrian Academy of Sciences (&#214;AW).

<ol>
	<li>Holland, P. W., Garcia-Fernandez, J., Williams, N. A., Sidow, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+duplications+and+the+origins+of+vertebrate+development.">Gene duplications and the origins of vertebrate development.</a> Dev Suppl. 120 (1), 125-133 (1994).</li><li>Simmen, M. W., Leitgeb, S., Clark, V. H., Jones, S. J., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+number+in+an+invertebrate+chordate,+Ciona+intestinalis.">Gene number in an invertebrate chordate, Ciona intestinalis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (8), 4437-4440 (1998).</li><li>Dehal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+draft+genome+of+Ciona+intestinalis:+insights+into+chordate+and+vertebrate+origins.">The draft genome of Ciona intestinalis: insights into chordate and vertebrate origins.</a> Science. 298 (5601), 2157-2167 (2002).</li><li>Satoh, N., Satou, Y., Davidson, B., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciona+intestinalis:+an+emerging+model+for+whole-genome+analyses.">Ciona intestinalis: an emerging model for whole-genome analyses.</a> Trends Genet. 19 (7), 376-381 (2003).</li><li>Delsuc, F., Brinkmann, H., Chourrout, D., Philippe, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunicates+and+not+cephalochordates+are+the+closest+living+relatives+of+vertebrates.">Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates.</a> Nature. 439 (7079), 965-968 (2006).</li><li>Lemaire, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unfolding+a+chordate+developmental+program,+one+cell+at+a+time:+invariant+cell+lineages,+short-range+inductions+and+evolutionary+plasticity+in+ascidians.">Unfolding a chordate developmental program, one cell at a time: invariant cell lineages, short-range inductions and evolutionary plasticity in ascidians.</a> Dev Biol. 332 (1), 48-60 (2009).</li><li>Hikosaka, A., Satoh, N., Makabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+spatial+expression+of+fusion+gene+constructs+with+the+5&#8242;+upstream+region+of+Halocynthia+roretzi+muscle+actin+gene+in+Ciona+savignyi+embryos.">Regulated spatial expression of fusion gene constructs with the 5&#8242; upstream region of Halocynthia roretzi muscle actin gene in Ciona savignyi embryos.</a> Roux's Arch Dev Biol. 203 (1-2), 104-112 (1993).</li><li>Corbo, J. C., Levine, M., Zeller, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+notochord-specific+enhancer+from+the+Brachyury+promoter+region+of+the+ascidian,+Ciona+intestinalis.">Characterization of a notochord-specific enhancer from the Brachyury promoter region of the ascidian, Ciona intestinalis.</a> Development. 124 (3), 589-602 (1997).</li><li>Zeller, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+use+of+transgenic+ascidian+embryos.">Generation and use of transgenic ascidian embryos.</a> Methods Cell Biol. 74 (74), 13-30 (2004).</li><li>Satou, Y., Imai, K. S., Satoh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+of+morpholinos+in+Ciona+embryos.">Action of morpholinos in Ciona embryos.</a> Genesis. 30 (3), 103-106 (2001).</li><li>Imai, K. S., Levine, M., Satoh, N., Satou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+blueprint+for+a+chordate+embryo.">Regulatory blueprint for a chordate embryo.</a> Science. 312 (5777), 1183-1187 (2006).</li><li>Tassy, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ANISEED+database:+digital+representation,+formalization,+and+elucidation+of+a+chordate+developmental+program.">The ANISEED database: digital representation, formalization, and elucidation of a chordate developmental program.</a> Genome Res. 20 (10), 1459-1468 (2010).</li><li>Brozovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANISEED+2015:+a+digital+framework+for+the+comparative+developmental+biology+of+ascidians.">ANISEED 2015: a digital framework for the comparative developmental biology of ascidians.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li><li>Kubo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+cis-regulatory+networks+in+the+early+Ciona+intestinalis+embryo.">Genomic cis-regulatory networks in the early Ciona intestinalis embryo.</a> Development. 137 (10), 1613-1623 (2010).</li><li>Rothb&#228;cher, U., Bertrand, V., Lamy, C., Lemaire, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinatorial+code+of+maternal+GATA,+Ets+and+&#946;-catenin-TCF+transcription+factors+specifies+and+patterns+the+early+ascidian+ectoderm.">A combinatorial code of maternal GATA, Ets and &#946;-catenin-TCF transcription factors specifies and patterns the early ascidian ectoderm.</a> Development. 134 (22), 4023-4032 (2007).</li><li>Segal, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+code+for+nucleosome+positioning.">A genomic code for nucleosome positioning.</a> Nature. 442 (7104), 772-778 (2006).</li><li>Khoueiry, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cis-regulatory+signature+in+ascidians+and+flies,+independent+of+transcription+factor+binding+sites.">A cis-regulatory signature in ascidians and flies, independent of transcription factor binding sites.</a> Curr Biol. 20 (9), 792-802 (2010).</li><li>Gilchrist, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pipeline+for+the+systematic+identification+of+non-redundant+full-ORF+cDNAs+for+polymorphic+and+evolutionary+divergent+genomes:+Application+to+the+ascidian+Ciona+intestinalis.">A pipeline for the systematic identification of non-redundant full-ORF cDNAs for polymorphic and evolutionary divergent genomes: Application to the ascidian Ciona intestinalis.</a> Dev Biol. 404 (2), 149-163 (2015).</li><li>Roure, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicassette+Gateway+vector+set+for+high+throughput+and+comparative+analyses+in+ciona+and+vertebrate+embryos.">A multicassette Gateway vector set for high throughput and comparative analyses in ciona and vertebrate embryos.</a> PLoS One. 2 (9), e916 (2007).</li><li>Kumano, G., Takatori, N., Negishi, T., Takada, T., Nishida, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+maternal+factor+unique+to+ascidians+silences+the+germline+via+binding+to+P-TEFb+and+RNAP+II+regulation.">A maternal factor unique to ascidians silences the germline via binding to P-TEFb and RNAP II regulation.</a> Curr Biol. 21 (15), 1308-1313 (2011).</li><li>Sasaki, H., Yoshida, K., Hozumi, A., Sasakura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+gene+knockout+in+the+ascidian+Ciona+intestinalis.">CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in the ascidian Ciona intestinalis.</a> Dev Growth Differ. 56 (7), 499-510 (2014).</li><li>Stolfi, A., Gandhi, S., Salek, F., Christiaen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+genome+editing+in+Ciona+embryos+by+CRISPR/Cas9.">Tissue-specific genome editing in Ciona embryos by CRISPR/Cas9.</a> Development. 141 (21), 4115-4120 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

ישנן שתי טכניקות גדולות כדי ליצור עבר Ciona מהונדסים: microinjection של רנ&quot;א או דנ&quot;א electroporation של ה- DNA. טכניקות אלו עבור הפרעות גנים העוברים Ciona שמשו ראשונות בשנת 1990 7,8 ומכאן ואילך שיפור ברציפות, ועכשיו מנוצלות Ciona (וסוגי ascidian אחרים) 20 ברחבי עולם. צעדים קריטיים בפרוטוקול Transgenesis המוצלח לתוך הגמטות Ciona שנאספים בקלות מחיות מבוגרות תלוי בכמה גורמים קריטיים. איכות הגמטות תלויה בעונת ההשרצה (בדרך כלל ממאי עד דצמבר באוקיינוס ​​האטלנטי הצפוני, משתנית עם טמפרטורת מי חמצון), על האיכות מי ים האקווריומים (ב מליחות נכונה, מבוגרים להישאר בריאים במשך 2-4 שבועות) , ולבסוף על טיפול נכון הגמטות על חילוץ מן המבוגרים, כמפורט להלן עבור השלבים השונים שלפרוטוקול. במהלך שלבים כנים, דוגרי טפטפות פסטרו עם מי ברז ימנע עוברים יידבקו מראש דגירה מי ים של בצלחות פטרי מצופה agarose יסיר חומרים רעילים שוחררו מן agarose. באופן כללי, מנות עשויות להיות מוכנים עד 2 שבועות לפני השימוש, לאחסן 4 ° C כדי למנוע התפתחות חיידקים ושטף טרי לפני השימוש. יום אחד זקן, מנות קטנות נראים הכי טובים עבור זריקות. יעילות ואורך dechorionation הוא צעד חיוני בפרוטוקול כטיפול ממושך של ביצים / עובר יפגע בפיתוח. הכנה קפדנית (לא רועד) ואחסון נכון (ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע) לשמור על איכות פתרון dechorionation. פרוטאזות בתמיסה לאבד יעילות אם אחד מעורב באלימות מדי הכנה או לאורך זמן, בעיקר אם כל הזמן בטמפרטורת החדר למשך שעות / ימים ארוכים יותר. יש לנו אופטימיזציה שלב קריטי זה באמצעות פתרון dechorionation טרי נוחשהוכן aliquots הקפוא של פתרון מניות 20x. טיפול נכון / עובר ביצי dechorionated שברירי חיוני גז או דקירה של עוברים תוך pipetting יהיה מזיק. כאשר pipetting, עובר נשמרים ככל האפשר בתרחיף (על ידי בעדינות &#39;נושב&#39; נוזל להתערבל אותם ואחריו pipetting החלקה אך מהירה), תוך כדי לחיצה על פיפטה זכוכית אנכית ולא במצב אופקי. טיפול כאמור חל על כל השלבים pipetting לשטיפה, resuspension והעברת ביצים / עוברים פנימה והחוצה של צינורות, cuvettes או צלחות, לפני ואחרי קיבוע. עם קיבעון, טיפול מיוחד צריך גם לקחת כדי בהתקן פיפטה נפרד חי מול עוברי קבוע כדי למנוע רעילות מ- שרידי fixatives. Microinjection הוא מסובך למדי Ciona ביצים / עוברים בשל גודלם הקטן ואת עמידותו של קרום vitelline ובביקורתיות תלוי בגודל טיפ אופטימיזציה שלמחט הזריקה, זווית מושלמת של הזרקה (תנועת מחט בשורה אחת, לאורך רדיוס הביצה) וכן שבירה, הוראות מכוונות היטב של קרום vitelline (על ידי שאיבה לפני שאיפה להזרקה). זו האחרונה הוא אפשרי רק אם בועות אוויר בוטלו לחלוטין מן צינורות ההזרקה המכיל שמן מינרלים להחלקת לחץ יניקה / הזרקה. בנוסף, את החלקים הקטנים ביותר של פסולת אבק או ביצה יסתמו את המחט, והם להימנע בקלות על ידי תנאי עבודה נקיים צעדי שטיפה לביצים לפני העברה על צלחת ההזרקה. הזרקת הודעה, העברת ביצים על מנות טריות תמנע השפעות רעילות מעובר מת שלא שרדו הליך ההזרקה. פתרון בעיות בעיות פוטנציאליות ההליך עשוי להיות מטופל על ידי הפתרונות הבאים. שיעורי הפריה נמוכים לנבוע הפעלת זרע מספיק, ניקיון ביצה נמוך או כרכי הפריה גדולים. השתמש freshly ונקווה ופחות בדילול הזרע. בדוק את התנועה זרע באקטיבציה. לשטוף את הביצים עם ASWH לפני הפריה כמתואר בשלב 4.2. הקטנת נפח המים ולהפחית את כמות ביצים לכל צלחת הפריה / טוב. עובר לאבד במהלך השלבים בהכנה יכול להימנע על ידי הוספת ירידה של פתרון dechorionation ומייעלים צנטריפוגות במורד הביצים / עובר undechorionated. Dechorionation זמן צריך להיות מותאם כמו ביצי dechorionated חלקית לא משקעים dechorionation הממושך הוא רעילים, בגרימה עובר להתפוצץ. פיתוח אסינכרוני לנבוע זרע שיורית שפורסם במהלך לנתיחה. שמור על יצוות הביצה הופרד בעלי חיים שונים כדי למנוע הפריה הדדית בלתי מבוקרת. התפתחות לא תקינה יכולה להיות סיבות שונות. בתחילה ובסוף העונה, לאחר השמירה על העובר מאנשים שונים המופרדים, הקבוצות הטובות ביותר ניתן לבחור. הימנע מביך את העוברים על10 דק &#39;כי אחרי הפריה כדי למנוע הפרעות הפרדה ooplasmic שלהם. ודא כי עוברי לא להתחיל חלוקת בזמן שהוא מועבר כמו pipetting המפריד בין בלסטומרים אחות ותוצאות בעוברים חלקית. שימוש בזרע פחות ביצים dechorionated להימנע polyspermy. השתמש מוכנים טרי אבל שטפו מנות agarose. ודא שהתקן pipetting הוא מקבע בחינם. שמור עוברת בקרה שלא dechorionated ולא electroporated לזהות בה צעד פיתוח שובש. להשלים את העוברים עם אנטיביוטיקה אם זיהום ופירוק מתרחשים. אם התקן הזריקה &#39;סתום&#39; פתיחת מחט הזריקה עלולה להיות מאומתת על ידי גירוש חלק מתכולת המוכתם שלה. חומר סתימה עלול להימחק מעל ידי גרירת קצה המחט בעיון את agarose. בועות אוויר בצינור ההזרקה ו / או שיש להסירו מחט. שנה את המחט לשליטה טובה יותר את עוצמת הזריקה כמו לביתטיפ DLE עלול לשבור או לסתום יחד ההזרקה. יש לשטוף את הביצים ומניחים אותם בצלחת הזרקה נקיה אם פסולת שהצטברה המנה. צנטריפוגה הפתרון הזריק לפני מילוי מחטים טריות כדי משקעים כל חלקיקים או גבישים קטנים. לעזר גם מתאמן הזרקה רק עם צבע חיוני. בדוק את טכניקת ההזרקה בדישון ביצים מוזרקות ולא מוזרקים. לבסוף, התייעצות עם עמית מנוסה יכול להיות מועיל כדי לשפר את טכניקת ההזרקה. כדי לשלוט על תופעות מחוץ היעד שני שאינם חופף MO והצל עם mRNA שונה שאינו מוכר על ידי MOS יכול לשלול נאמנו את השפעות פנוטיפי נוקב ב Ciona. Microinjection: משמעות ומגבלות Microinjection ב Ciona נוצל כדי ליצור לטיוטה הראשונה עבור רשת גנטית העובר כולו (GRN) בתוך chordate 11. עם זאת, למרות הרמ&quot;א כגוןהישג rkable, microinjection בעוברים Ciona יש מגבלות, בשל גודלו הקטן יחסית (0.14 מ&quot;מ קוטר) של ביצים Ciona. בהשוואה לאל של מיני chordate אחרים שבם דנ&quot;א זר / mRNA הוא הציג ידי microinjections, ביצי Ciona קשות יחסית להתמודד והשיעור העוברים Ciona מוזרק לכל ניסוי נותר נמוך (בממוצע 30 עד 50 עובר לכל ניסוי), פגיעת ניתוחים כמותיים. אף על פי כן, עבור גורמים אימהיים ומטרידים ב Ciona, microinjection של Mos היא השיטה של בחירה גם ללמוד מעורבותם הופעת zygotic התפתחות מן התא 16 עד 32 שלבי 15. בנוסף, זה אפשרי אם כי הרבה יותר קשה microinject בלסטומרים בודדים עד שלב התא 16-32. לבסוף, microinjection נשאר הטכניקה היעילה ביותר להפקת עוברים מהונדסים (על ידי ה- mRNA או הזרקת DNA) במיני ascidian מלבד Ciona, עבורו מלא OptimiZed פרוטוקולים electroporation אינם קיימים. Electroporation: משמעות ומגבלות כדי להתגבר על מספרים נמוכים ואילוצים אחרים של microinjection, רוב הקהילה Ciona השתמשה electroporation של DNA פלסמיד שכן הוא פותח ופורסם כמו פרוטוקול אופטימיזציה וסטנדרטי ידי זלר et al. בשנת 2004 9. ואכן, אלפי עוברים מהונדס Ciona יכול להיווצר בתוך שעה אחת עם עד 500 עוברים electroporated בו זמנית קובט אחד באמצעות הדופק יחיד 50 V של 16 מילי-שניות. הגישה של יצירת מספרים מסיביים של עוברים מהונדסים הוא עדיין ייחודית בין אורגניזמים מודל chordate. הידיעה הביאה Ciona שיכירו במהירות כמערכת מודל עוצמה לביצוע in vivo מנתח של אזורים רגולטורית ציס פוטנציאליים לוקליזציה הסלולר / subcellular, כפי שהודגם כאן. למרות electroporatiעל ב zygotes Ciona חוללה מהפכה באופן מהותי לתחום המחקר chordate GRN, הטכניקה בכל זאת כמה פרצופים גבולות. ראשית, פלסמידים מוצגים זמניות לעוברי Ciona ורוב עוברים בירושה כפי הנראה מערכי extrachromosomal, מה שהופך את היציבות של ה- DNA פלסמיד electroporated ספקולטיבי. יתר על כן, זה מאוד קשה, ואולי אף בלתי אפשרי, לשלוט על עותקים של פלסמידים electroporated כי יילקחו לכל הזיגוטה, ובכך וכתוצאה מכך תנודות פנוטיפי. בעיה נוספת מקשה לפרש תוצאות electroporation היא תופעה שאנו קוראים פסיפס. פלסמיד דנ&quot;א Electroporated ניתן לקחת עד בנקודות שונות של העובר בשלב אחד התא; המכרז קובע אילו וכיצד בחוגים רבים של הזיגוטה יקבלו פלסמיד הנורשים ידי בלסטומרים צאצא. וריאציות כאלה בבירור להפוך את הפרשנות להשפעות כמותיות יותר קשה. עם זאת, רוב הבעיות שמגיעות עם electroporaהשתנות tion נפתרות על ידי כמות מתאימה של דגימות ביולוגיות, עם ספירה וסטטיסטיקות של LacZ (או GFP) תאים חיוביים, אשר הוא בר השגה בקלות תצווה אחת. צדדי ואת הפוטנציאל של electroporation עבור הנדסה גנטית Electroporation בסופו של דבר מאפשר הקרנת אמצע תפוקה של אזורי רגולטורית ציס פוטנציאליים ניתוחים כמותיים של תפקוד גן המשובט פעם לתוך פלסמידים כתב או ביטוי. בשל הגנום Ciona הקומפקטי, זיהוי שיבוט של אזורי רגולטוריים פוטנציאל הוא פשוט למדי 3. אסטרטגיה באמצעות השפע של נתוני קהילה מודגמת באיור 2A. שיבוט של פלסמידים קידוד כתב גן הוא קל עוד יותר על ידי הדור של Ciona מותאם, סוויטות וקטור תואמות GATEWAY 19 ובאורך מלא תואם ספריית ORF 18. שני הכלים הם העומדים לרשות הקהילהלאפשר רקומבינציה אנזים ללא יעיל, הגבלה של נהגי רגולטוריות אזורי קידוד, כמתואר באיור 2B. בשנים האחרונות, electroporation הותאמה בהצלחה להשיג מניפולצית גן במיקוד רקמה עם פלסמידים מבטאי כלי עריכת גן כמו רכיבי CRISPR / Cas9 בשליטה נהגית רקמות ספציפיות 21,22. גישות כאלה תקדמנה ההבנה שלנו במהירות של הדינמיקה של GRNs ואת מנגנוני איתות נשמרים באופן פוטנציאלי, כוללים קודים גורמים שעתוק המעורבים ביצירת רקמות היציאה מתפשטת מן pluripotency. יתר על כן, loss- רקמות ספציפיות או לזכות של פונקציה גישות (על ידי CRISPR / Cas9 או על ידי ביטוי יתר) באמצעות electroporation יהיה אינסטרומנטלי ללמוד orthologs Ciona של גנים של מחלות הקשורות אדם. ואכן, קטלוגים עבור orthologs Ciona של גנים של מחלות האדם באורך מלא שלהם ORF קידוד שיבוטים הם בקלות available לניתוח ב Ciona 1 8. בשל הכפילויות הרחבות הגנום חוליות, רוב הגנים האנושיים להחזיק paralogs מיותר מבחינה תפקודית אשר מקשה על ניתוחים של גן פונקצית 1. Ciona להיות מערכת פשוטה עם הסדר רקמות chordate הטיפוס זחלים צריכים לחשוף תפקידים בסיסיים של כל כך חשובים, לעתים קרובות גנים נשמרים מבחינה תפקודית.

לאחרונה, רצף הגנום רפרטוארי גן עבדו הפכו נגישים מספר אורגניזמים מודל. קביעת קישורים תפקודיים גן, לעומת זאת, וכיצד הקשרים הללו נטועים ב- DNA כדי לבצע פעילות תעתיק לאורך זמן עוברי ומרחב, להישאר אתגר גדול, במיוחד בקרב בעלי חוליות. המורכבות של אינטראקציות רגולציה ואת המורכבות של הגנום 1,2, בעיקר בעלי חוליות, להאט ניתוחים פונקציונליים יעילים, בפרט ברמת ה- DNA in vivo. אכן, אין GRN מנותח כעת מן ההפריה לגמר, המדינה הבדיל סופני של האורגניזם המתפתח. ג ascidian intestinalis מייצג אורגניזם מודל שבו כגון מלאה GRN מנתח עשוי להיות אפשרי. יש לו הגנום ללא כפילות טיפוסית מחסרי עם יתירות גן קטנה. חולייתנים, בניגוד עברו שני סיבובים של כפילויות הגנום כי havאלקטרוני אשר נוצר משפחות גנים וגיוון פונקציונלי גדולות אלא גם יתיר בין paralogs. הרצפים הקומפקטיים ציס רגולטורית (יחידות הבקרה של GRNs) של ג intestinalis, וכן שושלת עוברית בלתי משתנית עם תאים כמה מזכירי ג elegans. יתר על כן, עמדת פילוגנטי הייחודית כקבוצת אחות חסרת חוליות לבעלי חוליות בתוך המיתרנים מאפשרת תצפית התפתחותית, ברזולוציה הסלולר, של תכנית גוף chordate להרכיב 3-6. סוגיית המפתח המבטיחה את ההצלחה העתידית עידן הגנומיקה באורגניזמים מודל היא הדור של מספר רב של עבר הפרעות כמותית in vivo. התפתחות הטכניקה microinjection בביצים Ciona 7, והאפשרות להשיג במהירות הרבה חיות טרנסגניות זמני על ידי electroporation ב vivo במאות Ciona zygotes 8,9 כבר פריצת דרך <em&gt; גנומיקה תפקודית Ciona. הנה, אנחנו ראשונים להציג את טכניקת microinjection המייגעת יותר למיקוד גנים בודדים כי נשארה שיטת הבחירה של morpholino (MO) מציאת גן בתיווך, בעיקר של תמלילים אימהיים. oligos MO בדרך כלל למקד היוזם ATG או אתרי השחבור של RNA ולהפריע תרגום חלבון. לאחר מכן, אנו מראים כיצד electroporation בביצים מופרות של Ciona מאפשר למספר גדול של עוברים כדי להיות מנותח באופן כמותי, ובכך פתח השדרות של ניתוח יעיל של משפרי in vivo ו גישות פונקציה רקמות ספציפיות gain- או הפסד של, עם אפשרות למניפולציות סימולטני וניתוחים. בנוסף, אנו מראים כיצד כלי קהילת Ciona מנוצלים עבור בחיזוי סיליקון של אזורי רגולטוריים שיבוט היעיל של מסגרות קריאה פתוחה מלאה (ORFs) וקטורי ביטוי. לבסוף, אנו מדגימים localizations subcellular ההפרש של fluorescently מתויגאו שכותרתו חלבונים על ביטוי יתר ידי electroporation.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="913">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Lab with constant temp. (~ 18&#176;C)&#160;</td>
			<td style="width:348px;"></td>
			<td style="width:83px;"></td>
			<td style="width:255px;">For embryo work</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:227px;">Ciona intestinalis adults</td>
			<td style="width:348px;">UPMC - Station Biologique, 
			Roscoff, France</td>
			<td style="width:83px;"></td>
			<td style="width:255px;">For collecting gametes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">NaCl</td>
			<td style="width:348px;">Roth</td>
			<td style="width:83px;">3957.1</td>
			<td style="width:255px;">For ASWH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">KCl</td>
			<td style="width:348px;">Roth</td>
			<td style="width:83px;">6781.1</td>
			<td style="width:255px;">For ASWH</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">CaCl2x2H2O</td>
			<td style="width:348px;">Roth</td>
			<td style="width:83px;">A119.1</td>
			<td style="width:255px;">For ASWH</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">MgCl2x6H2O</td>
			<td style="width:348px;">Roth</td>
			<td style="width:83px;">2189.1</td>
			<td style="width:255px;">For ASWH</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">MgS04x7H2O</td>
			<td style="width:348px;">Roth</td>
			<td style="width:83px;">P027.2</td>
			<td style="width:255px;">For ASWH</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:348px;">Roth</td>
			<td style="width:83px;">6885.1</td>
			<td style="width:255px;">For ASWH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Hepes&#160;</td>
			<td style="width:348px;">Roth</td>
			<td style="width:83px;">HN78.3</td>
			<td style="width:255px;">For ASWH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Sodium thioglycolate&#160;</td>
			<td style="width:348px;">Sigma</td>
			<td style="width:83px;">MZ-6</td>
			<td style="width:255px;">For Dechorionation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Pronase&#160;</td>
			<td style="width:348px;">Sigma</td>
			<td style="width:83px;">T0632-100G</td>
			<td style="width:255px;">For Dechorionation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">D-Mannitol&#160;</td>
			<td style="width:348px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:83px;">M9546-250G</td>
			<td style="width:255px;">For electroporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Plasmid DNA (prep &#62;1&#181;g/&#181;l)</td>
			<td style="width:348px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:83px;">740410.100</td>
			<td style="width:255px;">For electroporation or microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Agarose</td>
			<td style="width:348px;">any supplier</td>
			<td style="width:83px;"></td>
			<td style="width:255px;">For coating embryo culture dishes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Plastic petri dishes</td>
			<td style="width:348px;">VWR</td>
			<td style="width:83px;">612-2079</td>
			<td style="width:255px;">Coated with 1% Agarose in ASWH, covered with ASWH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Small scissors</td>
			<td style="width:348px;">any supplier</td>
			<td style="width:83px;"></td>
			<td style="width:255px;">For dissecting gametes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">NaOH&#160;</td>
			<td style="width:348px;">Roth</td>
			<td style="width:83px;">6771.1</td>
			<td style="width:255px;">For activating dechorionation solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Tris&#160;</td>
			<td style="width:348px;">Roth</td>
			<td style="width:83px;">5429.3</td>
			<td style="width:255px;">1M pH9.5, for sperm activation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Pasteur pipettes&#160;</td>
			<td style="width:348px;">VWR</td>
			<td style="width:83px;">612-1701</td>
			<td style="width:255px;">Treated by immersion in tap water for at least 12h</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Hand centrifuge</td>
			<td style="width:348px;">Hettich Zentrifugen</td>
			<td style="width:83px;">1011</td>
			<td style="width:255px;">Use glass centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">1.5ml Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:348px;">Sigma</td>
			<td style="width:83px;">T3406-250EA</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">2ml Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:348px;">Sigma</td>
			<td style="width:83px;">T3531-200EA</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Square electroporator</td>
			<td style="width:348px;">Bio Rad Gene Pulser Xcell</td>
			<td style="width:83px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Electroporation cuvettes 4 mm</td>
			<td style="width:348px;">Eurogentec</td>
			<td style="width:83px;">CE-0004-50</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Coverslips</td>
			<td style="width:348px;">Sto Premium</td>
			<td style="width:83px;">PR248212600</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Glass slides</td>
			<td style="width:348px;">VWR</td>
			<td style="width:83px;">ECN 613-1551</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:348px;">Sigma</td>
			<td style="width:83px;">G6257-10ML</td>
			<td style="width:255px;">For fixation in LacZ staining</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:348px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:83px;">P6148-500G</td>
			<td style="width:255px;">For fixation of fluorescent samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Vectashield</td>
			<td style="width:348px;">Vector</td>
			<td style="width:83px;">H-1000</td>
			<td style="width:255px;">For mounting of fluorescent samples</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl &#223;-D-Galactopyranoside)</td>
			<td style="width:348px;">Roth</td>
			<td style="width:83px;">2315.2</td>
			<td style="width:255px;">LacZ substrate; stock in 40mg/ml DMF (Dimethylformamide)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">K5Fe(CN)6</td>
			<td style="width:348px;">Merck</td>
			<td style="width:83px;">4984</td>
			<td style="width:255px;">For LacZ staining buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">K3Fe(CN)6</td>
			<td style="width:348px;">Merck</td>
			<td style="width:83px;">4973</td>
			<td style="width:255px;">For LacZ staining buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">Na22HPO4</td>
			<td style="width:348px;">Roth</td>
			<td style="width:83px;">4984.2</td>
			<td style="width:255px;">For PBT</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:348px;">Roth</td>
			<td style="width:83px;">3904.2</td>
			<td style="width:255px;">For PBT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Tween&#160;</td>
			<td style="width:348px;">Sigma</td>
			<td style="width:83px;">SLBJ5103V</td>
			<td style="width:255px;">For PBT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Mineral Oil</td>
			<td style="width:348px;">Sigma</td>
			<td style="width:83px;">M8410</td>
			<td style="width:255px;">Embryo culture tested</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Green Vital Dye</td>
			<td style="width:348px;">Fast Green Sigma&#160;</td>
			<td style="width:83px;">F7251</td>
			<td style="width:255px;">for microinjection; 10&#181;g/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Micropipette Puller (Flaming/Brown)</td>
			<td style="width:348px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:83px;">Model P-97</td>
			<td style="width:255px;">For pulling injection needles</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:227px;">Borosilicate glass capillaries GC100TF-10</td>
			<td style="width:348px;">Harvard Apparatus Ltd. UK</td>
			<td style="width:83px;">30-0038</td>
			<td style="width:255px;">1.0mm O.D. x0.78mm I.D., containing filament, for microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:348px;">Narishige</td>
			<td style="width:83px;">MWS-2</td>
			<td style="width:255px;">Three-axis Oil Hydraulic System; for 3D fine movement during injection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Injection holder</td>
			<td style="width:348px;">Narishige</td>
			<td style="width:83px;">1M-H1</td>
			<td style="width:255px;">For holding injection needles, entire system filled with mineral oil</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:227px;">All Glass Syringe</td>
			<td style="width:348px;">Walter Graf &#38; Co GmbH &#38; Co. KG&#160;</td>
			<td style="width:83px;">No. 95199.10427A4</td>
			<td style="width:255px;">10ml FortunaOptima; filled with mineral oil, for fine tuning of microinjection pressure&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Morpholinos&#160;</td>
			<td style="width:348px;">GeneTools LLC, Pilomath, OR, USA</td>
			<td style="width:83px;"></td>
			<td style="width:255px;">Injection at 0.25-0.5mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Capped mRNA</td>
			<td style="width:348px;">Ambion mMessage mMashine kit</td>
			<td style="width:83px;"></td>
			<td style="width:255px;">Injection at 0.05-0.5&#181;g/&#181;l&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid DNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Injection at 20 ng/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombination cloning kit</td>
			<td>Gateway BP Clonase Enzyme Mix Invitrogen</td>
			<td>11789-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombination cloning kit</td>
			<td>Gateway LR Clonase Enzyme mix Invitrogen</td>
			<td>11791-019</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

embryo microinjection and electroporation in the chordate ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Watch this Scientific Journal Video about Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis at JoVE.com

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

אנו מציגים transgenesis חולף מציאת גן ב intestinalis Ciona, קבוצת אחות chordate לבעלי חוליות, תוך שימוש בטכניקות microinjection ו electroporation. שיטות כאלה להקל גנומיקה תפקודית חסר חוליות הפשוטות הזה כולל מאפיינים בסיסיים של בעלי חוליות, כולל notochord ו epithelia ראש חושים ועל orthologs הרב של הגנים הקשורים למחלות אנושיות.

העובר Microinjection ו Electroporation ב chordate<em&gt; Ciona intestinalis</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Microbead השרשה בעובר דג הזברה

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

טכניקה לכוון Microinjection אל פיתוח<em&gt; Xenopus</em&gt; כליה

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

העברת גנים לתוך האיברים השמיעתיים עוף ידי<em&gt; ב אובו</em&gt; מיקרו electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

ב Electrooration Ovo ב המוח עוף שמיעה

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM ו Microrheology בתא חלמון עובר דג זברה

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout (Oncorhynchus Mykiss) and Brown Trout (Salmo Trutta Morpha fario)

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout Oncorhynchus Mykiss and Brown Trout Salmo Trutta Morpha fario

האפקטיביות של פירוק אוויר בדגים Salmonid שני, פורל הקשת (Oncorhynchus Mykiss) ופורל חום (Salmo Trutta מורפיום fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

העברת העובר פולשני המינימלי העובר ויטריפיקציה בשלב העובר אופטימלית במודל ארנב

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Microinjection-מערכת מבוססת עבור-Vivo השרשת Cardiomyocytes עובריים בתוך העובר העופות

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

בחוקת חוץ גופית דפוסי יצירת קשר מרחבי המרחב עם מבודדים העובר בלייסטומרים וחרוזי קלקר

In multicellular systems, individual cells are surrounded by the various physical and chemical cues coming from neighboring cells and the environment. ...