Name: embryo microinjection and electroporation in the chordate ciona intestinalis
Uploaded: 2016-10-16T15:00:00
Duration: 9 min 38 s
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This work was supported by the University of Innsbruck, Austria, and the Austrian Academy of Sciences (&#214;AW).

1. Preparativos para la microinyección y electroporación en Ciona Huevos y cigotos <ol><li> Preparar 10 L de agua de mar artificial con HEPES (ASWH) para el cultivo de embriones. Disolver mM NaCl 420, 9 mM KCl, 10 mM de CaCl2 · 2H 2 O, mM MgCl 24,5 2 · 6H 2 O, 25,5 mM de MgSO4 · 7H 2 O y 2,15 mM de NaHCO3 en agua doblemente destilada (ddH2O) por agitación durante la noche. Añadir 5 mM HEPES pH 8,0, y verificar / ajustar el pH a 8,0. Almacenar el ASWH a 4 ° C. Deje que se caliente a 18 ° C y filtrar con papel de filtro antes de su uso. </li><li> Preparar 20x solución dechorionation inactivada: 20% tioglicolato de sodio, 1% en pronasa ASWH. Almacenar 500 ml de alícuotas a -20 ° C, y se diluye hasta un volumen final de 10 ml ASWH antes de su uso. </li><li> Preparar 15 a 20 placas de cultivo de los huevos / embriones. Verter fundida de agarosa al 1% en ASWH en 3,5, 5, 9 ó 15 cm de petri platos, recubrimiento con una capa delgada de 1-2 mm.Deje que la agarosa solidifique y cubrir las placas con ASWH. Existencias de las mismas a 4 ° C durante 1-2 semanas como máximo. Vuelva a colocar la ASWH antes de su uso. </li><li> Preparar platos especiales de inyección. <ol><li> Verter una capa gruesa de 5-7 mm de fundido 1% de agarosa en una placa de Petri de 5 cm, y colocar un molde en la agarosa (tal como un cierre de bloqueo de cremallera, pegada a una hoja de la cubierta de plástico) para producir una muesca a la solidificación de la agarosa que pueden contener los huevos. Preparar 4 a 5 platos de inyección y cubrir con ASWH. Almacenar a 4 ° C y reemplazar con ASWH fresca antes de su uso. Utilice únicamente placas nuevas para inyección (máximo un día de edad). </li></ol></li><li> Preparar β-galactosidasa (LacZ) tampón de tinción: mM MgCl 1 2 · 6H 2 O, 3 mM de K 4 [Fe (CN) 6] · 3H 2 O, 3 mM K 3 [Fe (CN) 6] en tampón fosfato- de solución salina (PBS) con Tween (PBT) (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, 0,05% de Tween). i tiendan la oscuridad a 4 ° C. Preparar sustrato LacZ ß-D-galactopiranósido 5-Bromo-4-cloro-3-indolilo (X-gal, 10 U / ml) en alícuotas de 40 mg / ml en dimetilformamida (DMF) y las existencias almacenar a -20 ° C hasta utilizar. </li><li> Remojar pipetas Pasteur de grifo agua durante la noche para evitar que los embriones se peguen. </li><li> Preparar agujas de inyección. <ol><li> Configurar un extractor de micropipeta en condiciones tales como calor 425, tire 75, la velocidad y la hora 75 200 (a partir de un ensayo de la rampa de filamento de 415). </li><li> Tire de 4 a 5 capilares de vidrio que contiene filamentos para producir 8 a 10 agujas largas y finas normalmente cerrados en la punta. Almacenar las agujas en la caja de aguja libre de polvo, que se adjunta para doblar la cinta adhesiva sobre un soporte elevado, para evitar romper las puntas y que es conveniente para el llenado de la aguja. NOTA: Prueba de las agujas obtenidos mediante la inyección de un par de huevos con colorante vital verde (como se describe en la sección 6) y ajustar la aguja tirando de las condiciones para obtener una forma de punta que permite afinado y repetitive inyección como se describe en 6.6. </li></ol></li><li> Preparar la solución de inyección. Preparar 4 l de solución de inyección, por ejemplo, compuesto de 1 l de MO 2 mM, 2 l de 10 mg / l colorante vital verde y 1 l ddH2O Añadir una concentración final de 0,05 a 0,5 g / l capsulado mRNA o 20 ng / l de ADN plásmido de acuerdo con la pregunta experimental. Mezclar bien. Mantener en hielo si la solución contiene ARNm. </li></ol> 2. Recolección de gametos <ol><li> Dissect Ciona adultos en un 18 ° C enfriaron habitación embrión. Utilice pequeñas tijeras y empezar desde el extremo que se opone a los sifones en el lado de la exhalación (más corto) de sifón según el cual el oviducto y el tramo de conducto de esperma. </li><li> Exponer el oviducto y delicadamente hacer una incisión en el oviducto usando la punta de las tijeras. Caída de los huevos que fluye hacia fuera directamente en una placa de 6 pocillos que contiene ASWH presionando suavemente el oviducto con las tijeras cerradas despojándose de la p.ej.gs. La transferencia de los huevos restantes con una pipeta Pasteur pre-aclaró con ASWH. </li><li> Depositar los huevos de diferentes animales en diferentes pozos. Observe la calidad de los huevos bajo el microscopio de disección. NOTA: los huevos bien desarrollados son redondos y de color rosa con un color ligeramente amarillento. Están rodeados por una capa vitelina no celular, el corion que se forma un espacio perivitelino bien definido alrededor del huevo. El corion se asocia con células de prueba en sus células del folículo dentro y en forma de estrella en su exterior. Huevos de baja calidad a menudo carecen del espacio perivitelino o las células del folículo. Aparecen menos redonda, más granular o de diferente color. ovocitos inmaduros son más pequeños y tienen un color blanco plateado. </li><li> Cortar el conducto de espermatozoides con las tijeras y recoger esperma concentrado en un tubo de 1,5 ml usando una pipeta Pasteur separada. En común el esperma de diferentes animales (al menos dos) en el mismo tubo. espermatozoides se almacenan a 4 ° C durante varios días. </li></ol> 3.Fertilización <ol><li> Recoger esperma y los huevos a 18 ° C como se describe en el paso 2. </li><li> Activar el esperma. <ol><li> Preparar 1 ml ASWH en un tubo de 1,5 ml y se mezcla con 50 l de 1 M Tris pH 9,5. A continuación, añadir 20 l de esperma concentrado y mezclar suavemente invirtiendo el tubo. </li><li> Verificar la activación de espermatozoides en una gota de esperma se coloca sobre una cubierta de una pequeña placa de Petri o un portaobjetos de vidrio y observar bajo el microscopio de disección. Los espermatozoides deben nadar frenéticamente. </li></ol></li><li> Añadir 100 a 200 l de la solución de esperma activado a cada pocillo de huevos (que contienen entre 100 y 1.000 huevos), se mezclan bien pipeteando arriba y abajo, por lo que los huevos están flotando en el medio. Esperar durante 10 minutos sin mover los embriones. </li></ol> 4. dechorionation de huevos y embriones <ol><li> Diluir una alícuota de 500 l de solución de dechorionation 20x a 10 ml en ASWH. Activar la solución dechorionation mediante la adición gota a gota 200 l de 2.M NaOH 5 a la solución dechorionation 10 ml 1x. se forma un precipitado lechoso. mezclar suavemente invirtiendo el tubo. </li><li> Recoger los huevos o zigotos (después de la 10 min esperar en el paso 3.3) en tubos de vidrio usando una pipeta Pasteur. Agrupar los huevos de 2 a 3 animales en un tubo (alrededor de 1.000-5.000 huevos / tubo). Los sedimentos con una centrífuga mano haciendo girar a alta velocidad (1.200 xg) durante aproximadamente 20 segundos para formar un pellet de embriones en la parte inferior del tubo. suspenderlo en forma gradual la centrífuga y retire la ASWH con una pipeta Pasteur. </li><li> Añadir 4 ml de solución dechorionation activado para los huevos / cigotos sedimentadas en cada tubo. Suspender los huevos / cigotos pipeteando suavemente arriba y abajo con una pipeta Pasteur del grifo tratada con agua rematado con una pequeña pera de goma. La solución debe girar amarillento después de 1-3 min. </li><li> Siga el dechorionation mediante la eliminación de una pequeña alícuota de la suspensión de huevos dechorionating / cigoto con la pipeta Pasteur. Depositar una gota en un portaobjetos y observar bajo la s diseccióncapa pluvial. Mantenga el pipeteado de huevos / cigotos arriba y abajo y comprobar cada 20-30 segundos. NOTA: Las primeras células del folículo se desprenden, a continuación, el corion se vuelve amarillo y opaco, y, finalmente, que se separe de los zigotos. Pink dechorionated huevos / cigotos se hundirán hasta el fondo del tubo de vidrio. El dechorionation no debería tomar más de máx. 5 minutos. </li><li> Llenar el tubo con ASWH vez el 50% de los huevos / cigotos se dechorionated. NOTA: Muy suavemente centrífuga (8 x g) durante aproximadamente 10-15 segundos correspondiente a una velocidad muy baja lo suficiente para sedimentar los huevos / embriones dechorionated. detener lentamente la centrífuga como para no perturbar el pelet de huevos / cigotos en la parte inferior del tubo. </li><li> Retirar casi todo el líquido desde el tubo de vidrio que incluye el material flotante con huevos / cigotos incompletamente dechorionated y reemplazar con ASWH. Lentamente pipetear arriba y abajo para lavar y centrifugar suavemente de nuevo como en el paso 4.2. Como alternativa, espere cigotos que se establecen por la gravedad. Lavar una vez más hasta que no haya residuos corion es lEFT. </li><li> Huevos / cigotos de transferencia a placas de cultivo utilizando una pipeta Pasteur recién enjuagarse. Mantenga los cigotos (no huevos) a baja densidad (alrededor de 200 embriones por placa de 10 cm) para evitar que se peguen entre sí. La cultura de los embriones a la etapa deseada a temperaturas entre 13 y 20 ° C. Alternativamente, electroporate los cigotos (paso 5) o inyectar los huevos no fecundados (Paso 6). </li></ol> 5. La electroporación <ol><li> Fertilizar los huevos y dechorionate los cigotos a 18 ° C como en las secciones 3 y 4. Proporcionan entre 50 y 400 huevos por muestra electroporación. </li><li> Preparar 50 l de ADN plásmido en un tubo de 1,5 ml (máx. 100 g de ADN plásmido en 50 l de ddH2O) y añadir 200 l 0,95 M manitol. Mezclar bien con un vórtex. </li><li> Despacho y la gravedad sedimentan los cigotos dechorionated en siliconados tubos de 1,5 ml. Retire el ASWH hasta la marca de 100 l en el tubo. </li><li> Procederá, de forma consecutiva, para cada tubo cigoto de la siguiente manera: añadirsolución de ADN / manitol usando una pipeta Pasteur. Mezclar suavemente con los cigotos y de inmediato tomar el manitol suspensión cigoto ADN / / y la transferencia a una cubeta de electroporación de 4 mm. </li><li> Colocar la cubeta inmediatamente en el soporte de la electroporación y dar un único pulso de 16 ms a 50 V. </li><li> Retire los cigotos de la cubeta utilizando la misma pipeta Pasteur y los extendió sobre una placa de cultivo que contiene ASWH fresca y filtrada. Pipetear los cigotos antes de empezar a escindir alrededor de 1 hora después de la fecundación (HPF) a 18 ° C. </li><li> Enjuague la pipeta entre las muestras en un vaso de precipitados de ASWH. </li><li> Cultura los cigotos a 15-20 ° C a baja densidad suficiente de alrededor de 200 embriones por placa de 10 cm para evitar que se peguen entre sí. </li></ol> 6. La microinyección <ol><li> Preparar dechorionated huevos para la inyección. <ol><li> Dechorionate los huevos por separado, a partir de 2-4 animales, tal como se describe en la sección 4. Mantener el no fertilizado y dechorionated correoGGS en placas de cultivo recubiertas de agarosa pequeña separados. Lavar los huevos varias veces en los platos para remover los escombros. </li><li> Prueba de fertilizar pequeños lotes de los huevos dechorionated (alrededor de 50) de cada individuo. Use un plato separado 5 cm para cada lote y aplicar 2 l de esperma activado (paso 3.2). Mezclar bien por agitación los platos y hacia fuera los huevos en el plato moviendo los platos de lado. Mantener el esperma y los huevos juntos durante unos 10 minutos sin moverse. </li><li> Eliminar a un máximo de esperma de la siguiente manera: transferir los huevos fertilizados de una placa de cultivo fresco o enjuagar dos veces con ASWH fresco. Deje los embriones de escisión no perturbadas hasta la fase de 32 células (a 18 ° C durante aproximadamente 3 horas después de la fecundación). Elija los huevos de la mejor desarrollo de lotes (mejor porcentaje de la fecundación y la mayor división patrón regular) para la microinyección. </li></ol></li><li> Configurar las agujas de inyección. <ol><li> Rellene 4 agujas de inyección en una posición vertical para permitir la gravedad flow a lo largo del filamento. Depósito de 0,5 l solución inyectable (paso 1.8) que contiene colorante vital verde en la parte de atrás de las agujas que se colocan punta abajo aguja. Esperar a que el líquido para llenar la punta de la aguja en la parte inferior. </li><li> Volver a colocar las agujas en horizontal y rellenar con aceite mineral utilizando un metal fino y largo o puntas de pipeta de plástico. superponer lentamente la solución de inyección con aceite mineral expulsando todas las burbujas de aire mientras se llena la aguja. </li></ol></li><li> Configuración del Micromanipulador en un 18 ° C refrigerado por habitación. <ol><li> Conectar el tubo de plástico del soporte de la aguja a una jeringa de vidrio de 10 ml lleno de aceite mineral. Rellene el tubo y el soporte de la aguja con aceite y expulsar cualquier burbuja de aire. </li><li> Insertar la aguja en el soporte de la aguja y la posición del soporte en el micromanipulador. </li><li> Ajustar el movimiento de soporte de la aguja a lo largo de una línea recta en un ángulo de 45 ° respecto a la superficie. </li></ol></li><li> Orientar la dechorionahuevos TED a lo largo de la muesca de agarosa del plato de inyección de modo que los huevos se pueden inyectar uno a uno bajo el microscopio de disección. </li><li> Romper la punta de la aguja, si es necesario, empujando suavemente la aguja contra la agarosa o en contra de un pedazo de hoja de la cubierta de vidrio colocado en la agarosa. presionar ligeramente el mando de la jeringa para comprobar que la punta de la aguja está abierta (contenidos de agujas verdes expulsarán). </li><li> Inyectar el huevos no fecundados de uno en uno mediante la introducción primero la aguja en el huevo y ligeramente aspiración para romper la membrana del huevo seguido de la inyección. Inyectar solución de inyección verde en medio del huevo a un máximo de 1/3 del diámetro de la célula. (Esto corresponde a aproximadamente 30 pl para un diámetro de los huevos de 140 micras). </li><li> La transferencia de los huevos no fertilizados inyectados a una placa de cultivo fresco y incubarlos a 15-18 ° C hasta el momento de la fecundación. </li><li> Fertilizar los óvulos inyectados con espermatozoides recién activado como en las fertilizaciones de prueba (paso 6.1.2). Eliminatea máximo de los espermatozoides mediante la transferencia de los cigotos a una placa de cultivo fresco. Extender los embriones y no perturbar ellos durante las etapas de escisión (hasta la fase de 32 células). </li><li> Cultura los embriones a la etapa deseada a una temperatura comprendida entre 13 y 20 ° C. </li><li> Recoger los embriones de remolinos de ellos en el centro de la placa y transferir los mismos en siliconados tubos de 1,5 ml. Corregir o mancha, o monte (Pasos 7 y 8). </li><li> Comparar los fenotipos obtenidos para los embriones de control inyectado. NOTA: Se inyecta un segundo que no se solapan MO, que se dirige a la misma transcripción para obtener fenotipos idénticos. Rescatar el fenotipo MO específica (s) con un ARNm modificado que codifica su proteína de interés, pero que no es reconocido por el OM. MO inyectar un control que no da ningún fenotipo. </li></ol> 7. LacZ tinción <ol><li> Recoger los embriones en una etapa deseada en siliconados tubos de 1,5 ml y fijarlos en glutaraldehído al 0,2% en 1 ml de 15 ASWHa 30 min como máximo. </li><li> Lavar 2x 10 min con 1 ml de 1x PBT. </li><li> Enjuagar una vez en 500 l de tampón de tinción de LacZ. Reemplazar con sustrato X-Gal complementado tampón de tinción 1 ml (utilizar 10 l / ml de 40 mg / ml de solución madre de X-Gal). La transferencia de los embriones en una placa de 12 pocillos para una mejor observación de la tinción. </li><li> Incubar en la oscuridad. Variar la incubación de 0,5 hr a durante la noche a 4 ° C, a temperatura ambiente o a 37 ° C dependiendo de la fuerza del conductor que expresa LacZ. </li><li> Lavar los embriones hasta 4 veces en 1 ml de 1X PBT para eliminar tampón de tinción. </li><li> Después de la corrección durante 10 minutos a temperatura ambiente con 2% de paraformaldehído (PFA) en 1 ml de 1x PBT o glutaraldehído al 0,2% en 1 ml 1x PBT para la interpretación y visualización de los embriones teñidos. </li></ol> 8. Montaje de manera fluorescente etiquetadas Wmbryos <ol><li> Fijar los embriones de una etapa de desarrollo deseada durante 20 min en un 2% PFA en 1 ml ASWH. </li><li> Lavar los embriones 2x en 1 ml 1x PBT. Evitar cualquier exposiciones de luzUre al mantener los embriones en condiciones de oscuridad. </li><li> Transferir hasta 50 embriones a una diapositiva. Retirar un máximo de PBT en primer lugar con una pipeta y cuidadosamente con una toalla de papel. </li><li> Añadir 20-25 l de medio de montaje. </li><li> Añadir un cubreobjetos posicionándolo en un ángulo (de un lado primero) y baje lentamente con un objeto punzante (agujas, pinzas, puntas de pipeta) evitando las burbujas hasta que la muestra se cubre. Fijar el portaobjetos en sus bordes utilizando puntos de un esmalte de uñas transparente. </li><li> Sellar todo el cubreobjetos con un esmalte de uñas después del secado. Almacenar en la oscuridad a -20 ° C. </li></ol>

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	<li>Holland, P. W., Garcia-Fernandez, J., Williams, N. A., Sidow, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+duplications+and+the+origins+of+vertebrate+development.">Gene duplications and the origins of vertebrate development.</a> Dev Suppl. 120 (1), 125-133 (1994).</li><li>Simmen, M. W., Leitgeb, S., Clark, V. H., Jones, S. J., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+number+in+an+invertebrate+chordate,+Ciona+intestinalis.">Gene number in an invertebrate chordate, Ciona intestinalis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (8), 4437-4440 (1998).</li><li>Dehal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+draft+genome+of+Ciona+intestinalis:+insights+into+chordate+and+vertebrate+origins.">The draft genome of Ciona intestinalis: insights into chordate and vertebrate origins.</a> Science. 298 (5601), 2157-2167 (2002).</li><li>Satoh, N., Satou, Y., Davidson, B., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciona+intestinalis:+an+emerging+model+for+whole-genome+analyses.">Ciona intestinalis: an emerging model for whole-genome analyses.</a> Trends Genet. 19 (7), 376-381 (2003).</li><li>Delsuc, F., Brinkmann, H., Chourrout, D., Philippe, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunicates+and+not+cephalochordates+are+the+closest+living+relatives+of+vertebrates.">Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates.</a> Nature. 439 (7079), 965-968 (2006).</li><li>Lemaire, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unfolding+a+chordate+developmental+program,+one+cell+at+a+time:+invariant+cell+lineages,+short-range+inductions+and+evolutionary+plasticity+in+ascidians.">Unfolding a chordate developmental program, one cell at a time: invariant cell lineages, short-range inductions and evolutionary plasticity in ascidians.</a> Dev Biol. 332 (1), 48-60 (2009).</li><li>Hikosaka, A., Satoh, N., Makabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+spatial+expression+of+fusion+gene+constructs+with+the+5&#8242;+upstream+region+of+Halocynthia+roretzi+muscle+actin+gene+in+Ciona+savignyi+embryos.">Regulated spatial expression of fusion gene constructs with the 5&#8242; upstream region of Halocynthia roretzi muscle actin gene in Ciona savignyi embryos.</a> Roux's Arch Dev Biol. 203 (1-2), 104-112 (1993).</li><li>Corbo, J. C., Levine, M., Zeller, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+notochord-specific+enhancer+from+the+Brachyury+promoter+region+of+the+ascidian,+Ciona+intestinalis.">Characterization of a notochord-specific enhancer from the Brachyury promoter region of the ascidian, Ciona intestinalis.</a> Development. 124 (3), 589-602 (1997).</li><li>Zeller, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+use+of+transgenic+ascidian+embryos.">Generation and use of transgenic ascidian embryos.</a> Methods Cell Biol. 74 (74), 13-30 (2004).</li><li>Satou, Y., Imai, K. S., Satoh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+of+morpholinos+in+Ciona+embryos.">Action of morpholinos in Ciona embryos.</a> Genesis. 30 (3), 103-106 (2001).</li><li>Imai, K. S., Levine, M., Satoh, N., Satou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+blueprint+for+a+chordate+embryo.">Regulatory blueprint for a chordate embryo.</a> Science. 312 (5777), 1183-1187 (2006).</li><li>Tassy, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ANISEED+database:+digital+representation,+formalization,+and+elucidation+of+a+chordate+developmental+program.">The ANISEED database: digital representation, formalization, and elucidation of a chordate developmental program.</a> Genome Res. 20 (10), 1459-1468 (2010).</li><li>Brozovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANISEED+2015:+a+digital+framework+for+the+comparative+developmental+biology+of+ascidians.">ANISEED 2015: a digital framework for the comparative developmental biology of ascidians.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li><li>Kubo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+cis-regulatory+networks+in+the+early+Ciona+intestinalis+embryo.">Genomic cis-regulatory networks in the early Ciona intestinalis embryo.</a> Development. 137 (10), 1613-1623 (2010).</li><li>Rothb&#228;cher, U., Bertrand, V., Lamy, C., Lemaire, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinatorial+code+of+maternal+GATA,+Ets+and+&#946;-catenin-TCF+transcription+factors+specifies+and+patterns+the+early+ascidian+ectoderm.">A combinatorial code of maternal GATA, Ets and &#946;-catenin-TCF transcription factors specifies and patterns the early ascidian ectoderm.</a> Development. 134 (22), 4023-4032 (2007).</li><li>Segal, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+code+for+nucleosome+positioning.">A genomic code for nucleosome positioning.</a> Nature. 442 (7104), 772-778 (2006).</li><li>Khoueiry, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cis-regulatory+signature+in+ascidians+and+flies,+independent+of+transcription+factor+binding+sites.">A cis-regulatory signature in ascidians and flies, independent of transcription factor binding sites.</a> Curr Biol. 20 (9), 792-802 (2010).</li><li>Gilchrist, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pipeline+for+the+systematic+identification+of+non-redundant+full-ORF+cDNAs+for+polymorphic+and+evolutionary+divergent+genomes:+Application+to+the+ascidian+Ciona+intestinalis.">A pipeline for the systematic identification of non-redundant full-ORF cDNAs for polymorphic and evolutionary divergent genomes: Application to the ascidian Ciona intestinalis.</a> Dev Biol. 404 (2), 149-163 (2015).</li><li>Roure, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicassette+Gateway+vector+set+for+high+throughput+and+comparative+analyses+in+ciona+and+vertebrate+embryos.">A multicassette Gateway vector set for high throughput and comparative analyses in ciona and vertebrate embryos.</a> PLoS One. 2 (9), e916 (2007).</li><li>Kumano, G., Takatori, N., Negishi, T., Takada, T., Nishida, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+maternal+factor+unique+to+ascidians+silences+the+germline+via+binding+to+P-TEFb+and+RNAP+II+regulation.">A maternal factor unique to ascidians silences the germline via binding to P-TEFb and RNAP II regulation.</a> Curr Biol. 21 (15), 1308-1313 (2011).</li><li>Sasaki, H., Yoshida, K., Hozumi, A., Sasakura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+gene+knockout+in+the+ascidian+Ciona+intestinalis.">CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in the ascidian Ciona intestinalis.</a> Dev Growth Differ. 56 (7), 499-510 (2014).</li><li>Stolfi, A., Gandhi, S., Salek, F., Christiaen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+genome+editing+in+Ciona+embryos+by+CRISPR/Cas9.">Tissue-specific genome editing in Ciona embryos by CRISPR/Cas9.</a> Development. 141 (21), 4115-4120 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Hay dos técnicas principales para generar embriones transgénicos Ciona: microinyección de ARN o ADN y la electroporación de ADN. Estas técnicas para la perturbación de genes en embriones Ciona se utilizaron por primera vez en la década de 1990 y 7,8 a partir de entonces mejoraron sucesivamente, y ahora utilizan en Ciona (y otros géneros ascidia) 20 en todo el mundo. Los pasos críticos en el protocolo Transgénesis éxito en gametos Ciona que se recogen fácilmente de animales adultos depende de una serie de factores críticos. La calidad de los gametos depende de la época de desove (en general, de mayo a diciembre en el Atlántico Norte, que cambia con la temperatura del agua y la oxigenación), sobre la calidad del agua de mar en los acuarios (en la salinidad correcta, adultos sanos durante 2-4 semanas) y, finalmente, en la correcta manipulación de los gametos sobre la extracción de los adultos, como se detalla a continuación para los diversos pasos en elprotocolo. Durante las etapas de preparación, la incubación de pipetas Pasteur con agua del grifo evitará que los embriones se peguen y agua de mar pre-incubación de placas de Petri de agarosa recubiertas de eliminará sustancias tóxicas liberadas de la agarosa. En general, los platos se pueden preparar hasta 2 semanas antes de su uso, almacenados a 4 ° C para evitar el crecimiento bacteriano y se aclararon justo antes de su uso. Un día de edad, pequeños platos parece mejor para inyecciones. La eficiencia y la longitud de dechorionation es un paso crucial en el protocolo como el tratamiento prolongado de huevos / embriones dañará el desarrollo. La preparación cuidadosa (sin agitación) y el almacenamiento correcto (a 4 ° C durante un máximo de una semana) preservan la calidad de la solución dechorionation. Proteasas en la solución pierden eficacia si, ya sea mezclado con demasiada violencia en la preparación o el paso del tiempo, sobre todo si se mantiene a temperatura ambiente durante largos horas / días. Hemos optimizado este paso crítico mediante el uso de una solución fresca convenientemente dechorionationpreparado a partir de alícuotas congeladas de 20x solución madre. La correcta manipulación de los frágiles huevos / embriones dechorionated es esencial y cizallamiento o punzante de los embriones durante el pipeteado será perjudicial. Cuando pipeteado, los embriones se mantienen lo más posible en suspensión (por suavemente &#39;soplado&#39; líquido a girar hacia arriba seguido de suave pero rápido de pipeteo), mientras sostiene la pipeta de vidrio en vertical en lugar de horizontal. Tal cuidado aplica a todos los pasos de pipeteado para el lavado, resuspensión y transferencia de huevos / embriones dentro y fuera de los tubos, cubetas o placas, antes y después de la fijación. Tras la fijación, cuidados especiales también se debe tomar para pipetas separadas para los embriones vivos versus sujetos para evitar la toxicidad de los restos de fijadores. La microinyección es bastante complicado en Ciona huevos / embriones debido a su pequeño tamaño y la resistencia de la membrana vitelina y críticamente depende de un tamaño de la boquilla optimizada dela aguja de inyección, un ángulo perfecto de la inyección (movimiento de la aguja en una línea, a lo largo del radio de huevo) y un afinado, rotura manual de la membrana vitelina (por succión antes de la aspiración por inyección). Esta última sólo es posible si las burbujas de aire están completamente eliminados de la tubería de inyección que contiene aceite mineral para suavizar la presión de succión / inyección. Además, las piezas más pequeñas de polvo o restos de huevos va a obstruir la aguja, y son fácilmente evitado por las condiciones de trabajo limpio y pasos de lavado de los huevos antes de su transferencia en el plato de la inyección. después de la inyección, la transferencia de huevos en platos frescos evitará los efectos tóxicos de los embriones muertos no haber sobrevivido al procedimiento de inyección. Solución de problemas Los problemas potenciales en el procedimiento pueden ser abordadas por las siguientes soluciones. Las bajas tasas de fertilización pueden surgir de la activación de los espermatozoides insuficiente, baja la limpieza de huevo o de volúmenes grandes de fertilización. utilice freshly agruparon y menos diluyó esperma. Verificar el movimiento de los espermatozoides después de la activación. Lavar los huevos con ASWH antes de la fertilización como se describe en el paso 4.2. Reducir el volumen de agua y reducir la cantidad de huevos por plato fertilización / pocillo. La pérdida de embriones durante las etapas de preparación se pueden evitar mediante la adición de una gota de solución dechorionation para centrifugar de manera más eficiente hacia abajo los huevos / embriones undechorionated. Dechorionation tiempo debe ser optimizado como los huevos parcialmente dechorionated será no sedimentos y dechorionation prolongada es tóxico, causando los embriones para explotar. desarrollo asincrónico puede surgir de esperma residual liberado durante la disección. Mantener los lotes de huevos separados de diferentes animales para evitar incontrolada fertilización cruzada. El desarrollo anormal puede tener varias causas. Al principio y al final de la temporada, después de mantener el embrión de diferentes individuos separados, se pueden seleccionar los mejores lotes. Debe evitar las interrupciones de los embriones para la10 minutos que siguen a la fertilización para evitar la interferencia con su segregación ooplasmic. Asegúrese de que los embriones no comenzaron dividiendo mientras se transfiere en forma de pipeteado separa los blastómeros hermanas y los resultados en embriones parciales. Use menos espermatozoides para los huevos para evitar dechorionated polyspermy. Utilice platos recién preparados de agarosa, pero se aclararon. Asegúrese de que el dispositivo de pipeta es libre de fijador. Mantener control de los embriones que no fueron dechorionated y no a electroporación para detectar por lo cual el desarrollo paso fue interrumpido. Complementar los embriones con antibióticos si se produce contaminación y descomposición. Si el dispositivo de inyección ha &#39;tapado&#39;, la abertura de la aguja de inyección puede ser verificada mediante la expulsión de algunos de sus contenidos manchado. material de obstrucción puede ser borrado arrastrando con cuidado la punta de la aguja a través de la agarosa. Las burbujas de aire en el tubo de inyección y / o la aguja debe ser eliminado. Cambie la aguja para un mejor control del volumen de inyección como el neepunta dle puede romper o atascar a lo largo de la inyección. Lavar los huevos y colocarlos en una placa de inyección estéril si los desechos se han acumulado en el plato. Centrifugar la solución de inyección antes de llenar agujas frescas con el fin de sedimentar las partículas pequeñas o cristales. También es útil la inyección está practicando solamente con colorante vital. Verificar la técnica de inyección mediante la fertilización de los huevos inyectados y no inyectados. Por último, el consultar con un colega con experiencia puede ser útil para mejorar la técnica de inyección. Para controlar los efectos fuera de la meta un segundo que no se solapan MO y rescate con un ARNm modificado que no es reconocido por los OM puede descartar fielmente efectos fenotípicos inespecíficos en Ciona. Microinyección: significado y limitaciones La microinyección en Ciona se utilizó para generar el primero modelo para una red de regulación de genes embrión conjunto (GRN) en un cordado 11. Sin embargo, a pesar de una rema taleslogro rkable, microinyección en embriones de Ciona tiene limitaciones, debido al tamaño relativamente pequeño (0,14 mm de diámetro) de los huevos de Ciona. En comparación con los de otras especies de cordados, donde ADN extraño / ARNm se introduce mediante microinyecciones, huevos Ciona son relativamente difíciles de manejar y la tasa de embriones Ciona inyectados por experimento sigue siendo baja (una media de 30 a 50 embriones por experimento), impidiendo análisis cuantitativos. Sin embargo, para factores maternos perturbadores en Ciona, la microinyección de las OM es el método de elección también para estudiar su implicación en la aparición cigóticos de desarrollo de la célula de 16 a 32 etapas 15. Además, es posible aunque mucho más difícil de microinyectar blastómeros individuales hasta la etapa de 16 a 32 células. Por último, la microinyección sigue siendo la técnica más eficiente para la producción de embriones transgénicos (por mRNA o la inyección de ADN) en especies distintas de ascidia Ciona, para lo cual totalmente optimino existen protocolos de electroporación Zed. La electroporación: significado y limitaciones Para superar los números bajos y otras condiciones de la microinyección, la mayor parte de la comunidad Ciona ha utilizado la electroporación de ADN plásmido desde que fue desarrollado y publicado como un protocolo optimizado y estandarizado por Zeller et al. En 2004 9. De hecho, miles de embriones Ciona transgénicos puede ser generada dentro de una hora con hasta 500 embriones electroporadas simultáneamente en una cubeta usando una sola 50 V de pulso de 16 mseg. El enfoque de generar un número masivo de embriones transgénicos sigue siendo único entre los organismos modelo cordados. Esto ha llevado a Ciona ser rápidamente reconocido como un poderoso sistema modelo para la realización de los análisis in vivo de potenciales regiones cis-regulador y localización celular / subcelular, como se ejemplifica aquí. Aunque electroporatien cigotos en Ciona ha revolucionado el campo de investigación fundamentalmente cordado GRN, la técnica, sin embargo, se enfrenta a algunos límites. En primer lugar, los plásmidos se introducen de forma transitoria en embriones de Ciona y es más probable heredan como extracromosómicos arrays, por lo que la estabilidad del plásmido de ADN a electroporación especulativo. Por otra parte, es muy difícil, incluso imposible, controlar las copias de plásmidos electroporación que serán absorbidos por cigoto, lo que resulta en fluctuaciones fenotípicas. Un problema adicional que hace que sea difícil de interpretar los resultados de electroporación es un fenómeno que llamamos mosaicismo. ADN plásmido electroporación puede ser tomado en diferentes posiciones de la etapa de embrión de una célula; que determina cuáles y cuántos cuartos del cigoto recibirán plásmido para ser heredado por los descendientes blastómeras. Tales variaciones claramente hacen que la interpretación de los efectos cuantitativos más difícil. Sin embargo, la mayoría de los problemas que vienen con electroporavariabilidad ción son resueltos por una cantidad apropiada de muestras biológicas, con el conteo y estadísticas de LacZ (o GFP) células positivas, que es fácil de obtener en un solo lote. La versatilidad y el potencial de electroporación para la ingeniería genética Electroporación, finalmente, permite la detección de mitad de rendimiento de las posibles regiones cis-regulador y análisis cuantitativos de la función de genes clonados en vez de actas o de plásmidos de expresión. Debido al genoma Ciona compacto, la identificación y clonación de posibles regiones reguladoras es bastante sencillo 3. Una estrategia para el uso de la gran cantidad de datos de la comunidad se demuestra en la Figura 2A. La clonación de genes informadores y plásmidos que codifican se facilita aún más la generación de Ciona adaptado, Gateway Suites vector compatible 19 y una longitud total compatibles biblioteca ORF 18. Ambas herramientas están disponibles para la comunidad ypermitir la restricción de la recombinación eficiente, libre de enzimas de los conductores reguladoras y regiones de codificación, como se muestra en la Figura 2B. En los últimos años, la electroporación fue adaptado con éxito para lograr la manipulación dirigida de genes de tejidos con plásmidos que expresan las herramientas de edición de genes como los componentes CRISPR / Cas9 bajo el control de controladores específicos de tejido 21,22. Tales enfoques avanzarán rápidamente nuestra comprensión de la dinámica de GRNs y los mecanismos de señalización potencialmente conservadas, incluyendo códigos de factor de transcripción implicados en la formación de tejidos y la salida escalonada de pluripotencia. Por otra parte, deficitaria de tejidos específicos o enfoques de ganancia de función (por CRISPR / Cas9 o por la sobreexpresión) mediante electroporación serán fundamentales para el estudio de los genes ortólogos Ciona asociadas a la enfermedad humana. De hecho, los catálogos de ortólogos de Ciona genes de enfermedades humanas y su longitud ORF clones de codificación son fácilmente disponLe para el análisis en Ciona 1 8. Debido a la amplia duplicaciones del genoma en los vertebrados, la mayoría de los genes humanos poseen parálogos funcionalmente redundantes que complican los análisis de la función del gen 1. Ciona ser un sistema más simple con la disposición típica tejido cordado en larvas debe descubrir papeles fundamentales de tales genes importantes, a menudo conservadas funcionalmente.

Recientemente, la secuencia del genoma y repertorios de genes transcritos se han hecho accesibles en una serie de organismos modelo. Determinar enlaces funcionales de genes, sin embargo, y cómo estas conexiones están cableados en el ADN para ejecutar la actividad transcripcional a través del tiempo y el espacio embrionario, siendo un reto importante, especialmente en los vertebrados. La complejidad de las interacciones reguladoras y la complejidad de los genomas de 1,2, en particular en los vertebrados, ralentizan análisis funcionales eficientes, en particular a nivel del ADN in vivo. De hecho, ningún GRN se analiza la actualidad desde la fertilización hasta el estado final, diferenciación terminal del organismo en desarrollo. La ascidia C. intestinalis representa un organismo modelo en el que tan completa GRN analiza puede ser posible. Tiene un genoma no duplicado típico de invertebrados con poca redundancia génica. Vertebrados, por el contrario han sido objeto de dos rondas de duplicaciones del genoma que have genera grandes familias de genes y la diversificación funcional, sino también la redundancia entre parálogos. Las secuencias cis-regulador compactas (las unidades de control de GRNs) de C. intestinalis, y un linaje embrionario invariable con pocas células son una reminiscencia de C. elegans. Por otra parte, su posición filogenética única como un grupo hermano de invertebrados a los vertebrados dentro de los cordados permite la observación del desarrollo, con una resolución celular, del plan corporal cordado formando 3-6. La cuestión clave que garantiza el éxito futuro de la genómica funcional en organismos modelo es la generación de un gran número de embriones para cuantitativos en vivo perturbaciones. El desarrollo de la técnica de microinyección en huevos Ciona 7, y la posibilidad de obtener rápidamente muchos animales transgénicos transitoriamente por electroporación in vivo en cientos de Ciona cigotos 8,9 ha sido un gran avance en <em&gt; Genómica funcional Ciona. Aquí, primero presentamos la técnica de microinyección más laborioso para la orientación genes individuales que sigue siendo el método de elección para morfolino (MO) desmontables gen mediada, en particular de los transcritos maternos. oligos MO suelen centrarse en el iniciador ATG o los sitios de empalme de ARN e interfieren con la traducción de proteínas. A continuación, muestran cómo la electroporación en huevos fertilizados de Ciona permite un gran número de embriones para ser analizados de una manera cuantitativa, abriendo así las vías de análisis eficiente de los potenciadores in vivo y de ganancia-específica de tejido o pérdida de función de los enfoques, con el posibilidad de manipulaciones y análisis simultáneos. Además, demuestran cómo se utilizan las herramientas de la comunidad Ciona para la predicción in silico de las regiones reguladoras y la clonación eficiente de los marcos de lectura abierta (ORFs) completos en vectores de expresión. Por último, demostrar diferenciales localizaciones subcelulares de fluorescencia etiquetadoso proteínas a la sobreexpresión marcada por electroporación.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="913">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Lab with constant temp. (~ 18&#176;C)&#160;</td>
			<td style="width:348px;"></td>
			<td style="width:83px;"></td>
			<td style="width:255px;">For embryo work</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:227px;">Ciona intestinalis adults</td>
			<td style="width:348px;">UPMC - Station Biologique, 
			Roscoff, France</td>
			<td style="width:83px;"></td>
			<td style="width:255px;">For collecting gametes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">NaCl</td>
			<td style="width:348px;">Roth</td>
			<td style="width:83px;">3957.1</td>
			<td style="width:255px;">For ASWH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">KCl</td>
			<td style="width:348px;">Roth</td>
			<td style="width:83px;">6781.1</td>
			<td style="width:255px;">For ASWH</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">CaCl2x2H2O</td>
			<td style="width:348px;">Roth</td>
			<td style="width:83px;">A119.1</td>
			<td style="width:255px;">For ASWH</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">MgCl2x6H2O</td>
			<td style="width:348px;">Roth</td>
			<td style="width:83px;">2189.1</td>
			<td style="width:255px;">For ASWH</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">MgS04x7H2O</td>
			<td style="width:348px;">Roth</td>
			<td style="width:83px;">P027.2</td>
			<td style="width:255px;">For ASWH</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:348px;">Roth</td>
			<td style="width:83px;">6885.1</td>
			<td style="width:255px;">For ASWH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Hepes&#160;</td>
			<td style="width:348px;">Roth</td>
			<td style="width:83px;">HN78.3</td>
			<td style="width:255px;">For ASWH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Sodium thioglycolate&#160;</td>
			<td style="width:348px;">Sigma</td>
			<td style="width:83px;">MZ-6</td>
			<td style="width:255px;">For Dechorionation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Pronase&#160;</td>
			<td style="width:348px;">Sigma</td>
			<td style="width:83px;">T0632-100G</td>
			<td style="width:255px;">For Dechorionation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">D-Mannitol&#160;</td>
			<td style="width:348px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:83px;">M9546-250G</td>
			<td style="width:255px;">For electroporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Plasmid DNA (prep &#62;1&#181;g/&#181;l)</td>
			<td style="width:348px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:83px;">740410.100</td>
			<td style="width:255px;">For electroporation or microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Agarose</td>
			<td style="width:348px;">any supplier</td>
			<td style="width:83px;"></td>
			<td style="width:255px;">For coating embryo culture dishes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Plastic petri dishes</td>
			<td style="width:348px;">VWR</td>
			<td style="width:83px;">612-2079</td>
			<td style="width:255px;">Coated with 1% Agarose in ASWH, covered with ASWH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Small scissors</td>
			<td style="width:348px;">any supplier</td>
			<td style="width:83px;"></td>
			<td style="width:255px;">For dissecting gametes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">NaOH&#160;</td>
			<td style="width:348px;">Roth</td>
			<td style="width:83px;">6771.1</td>
			<td style="width:255px;">For activating dechorionation solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Tris&#160;</td>
			<td style="width:348px;">Roth</td>
			<td style="width:83px;">5429.3</td>
			<td style="width:255px;">1M pH9.5, for sperm activation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Pasteur pipettes&#160;</td>
			<td style="width:348px;">VWR</td>
			<td style="width:83px;">612-1701</td>
			<td style="width:255px;">Treated by immersion in tap water for at least 12h</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Hand centrifuge</td>
			<td style="width:348px;">Hettich Zentrifugen</td>
			<td style="width:83px;">1011</td>
			<td style="width:255px;">Use glass centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">1.5ml Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:348px;">Sigma</td>
			<td style="width:83px;">T3406-250EA</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">2ml Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:348px;">Sigma</td>
			<td style="width:83px;">T3531-200EA</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Square electroporator</td>
			<td style="width:348px;">Bio Rad Gene Pulser Xcell</td>
			<td style="width:83px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Electroporation cuvettes 4 mm</td>
			<td style="width:348px;">Eurogentec</td>
			<td style="width:83px;">CE-0004-50</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Coverslips</td>
			<td style="width:348px;">Sto Premium</td>
			<td style="width:83px;">PR248212600</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Glass slides</td>
			<td style="width:348px;">VWR</td>
			<td style="width:83px;">ECN 613-1551</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:348px;">Sigma</td>
			<td style="width:83px;">G6257-10ML</td>
			<td style="width:255px;">For fixation in LacZ staining</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:348px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:83px;">P6148-500G</td>
			<td style="width:255px;">For fixation of fluorescent samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Vectashield</td>
			<td style="width:348px;">Vector</td>
			<td style="width:83px;">H-1000</td>
			<td style="width:255px;">For mounting of fluorescent samples</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl &#223;-D-Galactopyranoside)</td>
			<td style="width:348px;">Roth</td>
			<td style="width:83px;">2315.2</td>
			<td style="width:255px;">LacZ substrate; stock in 40mg/ml DMF (Dimethylformamide)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">K5Fe(CN)6</td>
			<td style="width:348px;">Merck</td>
			<td style="width:83px;">4984</td>
			<td style="width:255px;">For LacZ staining buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">K3Fe(CN)6</td>
			<td style="width:348px;">Merck</td>
			<td style="width:83px;">4973</td>
			<td style="width:255px;">For LacZ staining buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">Na22HPO4</td>
			<td style="width:348px;">Roth</td>
			<td style="width:83px;">4984.2</td>
			<td style="width:255px;">For PBT</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:348px;">Roth</td>
			<td style="width:83px;">3904.2</td>
			<td style="width:255px;">For PBT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Tween&#160;</td>
			<td style="width:348px;">Sigma</td>
			<td style="width:83px;">SLBJ5103V</td>
			<td style="width:255px;">For PBT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Mineral Oil</td>
			<td style="width:348px;">Sigma</td>
			<td style="width:83px;">M8410</td>
			<td style="width:255px;">Embryo culture tested</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Green Vital Dye</td>
			<td style="width:348px;">Fast Green Sigma&#160;</td>
			<td style="width:83px;">F7251</td>
			<td style="width:255px;">for microinjection; 10&#181;g/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Micropipette Puller (Flaming/Brown)</td>
			<td style="width:348px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:83px;">Model P-97</td>
			<td style="width:255px;">For pulling injection needles</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:227px;">Borosilicate glass capillaries GC100TF-10</td>
			<td style="width:348px;">Harvard Apparatus Ltd. UK</td>
			<td style="width:83px;">30-0038</td>
			<td style="width:255px;">1.0mm O.D. x0.78mm I.D., containing filament, for microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:348px;">Narishige</td>
			<td style="width:83px;">MWS-2</td>
			<td style="width:255px;">Three-axis Oil Hydraulic System; for 3D fine movement during injection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Injection holder</td>
			<td style="width:348px;">Narishige</td>
			<td style="width:83px;">1M-H1</td>
			<td style="width:255px;">For holding injection needles, entire system filled with mineral oil</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:227px;">All Glass Syringe</td>
			<td style="width:348px;">Walter Graf &#38; Co GmbH &#38; Co. KG&#160;</td>
			<td style="width:83px;">No. 95199.10427A4</td>
			<td style="width:255px;">10ml FortunaOptima; filled with mineral oil, for fine tuning of microinjection pressure&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Morpholinos&#160;</td>
			<td style="width:348px;">GeneTools LLC, Pilomath, OR, USA</td>
			<td style="width:83px;"></td>
			<td style="width:255px;">Injection at 0.25-0.5mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Capped mRNA</td>
			<td style="width:348px;">Ambion mMessage mMashine kit</td>
			<td style="width:83px;"></td>
			<td style="width:255px;">Injection at 0.05-0.5&#181;g/&#181;l&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid DNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Injection at 20 ng/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombination cloning kit</td>
			<td>Gateway BP Clonase Enzyme Mix Invitrogen</td>
			<td>11789-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombination cloning kit</td>
			<td>Gateway LR Clonase Enzyme mix Invitrogen</td>
			<td>11791-019</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

embryo microinjection and electroporation in the chordate ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

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Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Presentamos la transgénesis y transitoria gen desmontables en Ciona intestinalis, un grupo hermano cordado a los vertebrados, utilizando técnicas de microinyección y electroporación. Tales métodos facilitan la genómica funcional en este sencillo de invertebrados que cuenta con características rudimentarias de vertebrados, incluyendo notocorda y epitelios sensoriales cabeza, y muchos ortólogos de genes de enfermedades humanas asociadas.

La microinyección de embriones y la electroporación en el Chordate<em&gt; Ciona intestinalis</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Microbead Implantación en el embrión de pez cebra

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

La formación de imágenes estructuras subcelulares en el embrión vivo de pez cebra

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Técnica de microinyección a Target a los países en desarrollo<em&gt; Xenopus</em&gt; riñón

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

La transferencia de genes en el pollo auditiva de órgano de<em&gt; En Ovo</em&gt; Micro-electroporación

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

En Ovo electroporación en el tronco encefálico auditivo del pollo

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM y Microrheology en la celda de yema de embrión de pez cebra

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout (Oncorhynchus Mykiss) and Brown Trout (Salmo Trutta Morpha fario)

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout Oncorhynchus Mykiss and Brown Trout Salmo Trutta Morpha fario

Eficacia de la extracción de aire en dos peces salmónidos, trucha arco iris (Oncorhynchus Mykiss) y trucha (Salmo Trutta Morpha fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Transferencia de embriones mínimamente invasiva y vitrificación de embriones en la etapa óptima del embrión en el modelo Rabbit

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Sistema basado en la microinyección en Vivo implantación de cardiomiocitos embrionarios en el embrión aviar

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

Reconstitución in Vitro de patrones de contacto de células espaciales con Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres aislados y perlas de poliestireno adhesivo

In multicellular systems, individual cells are surrounded by the various physical and chemical cues coming from neighboring cells and the environment. ...