Name: continuous-wave thulium laser for heating cultured cells to investigate cellular thermal effects
Uploaded: 2017-06-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Continuous-wave Thulium Laser for Heating Cultured Cells to Investigate Cellular Thermal Effects at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af et forskningsbidrag fra det tyske føderale ministerium for uddannelse og forskning (BMBF) (tilskud nr. 13GW0043C) og og et europæisk kontor for luftfartsforskning og udvikling (EOARD, grant # FA9550-15-1-0443)

1. RPE-cellekultur <ol><li> Isolering af RPE-celler fra svine øjne <ol><li> Hent frisk enucleated svin øjne fra det lokale slagteri. Hold dem kølige (4 ° C) og i et mørkt miljø. </li><li> Fjern ekstracellulært væv med saks og blød øjnene i en antiseptisk opløsning i 5 min. </li><li> Anbring øjnene i steriliseret phosphatbufret saltvand uden calcium og magnesium (PBS (-)) indtil brug. </li><li> Brug en skalpel, trænge ind i sclera på ca. 5 mm bagved hornhinde limbus. Resekt hele den forre...

<ol>
	<li>Inagaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+efficacy+of+pure+yellow+(577-nm)+and+810-nm+subthreshold+micropulse+laser+photocoagulation+combined+with+yellow+(561-577-nm)+direct+photocoagulation+for+diabetic+macular+edema.">Comparative efficacy of pure yellow (577-nm) and 810-nm subthreshold micropulse laser photocoagulation combined with yellow (561-577-nm) direct photocoagulation for diabetic macular edema.</a> Jpn J Ophthalmol. 59 (1), 21-28 (2015).</li><li>Roider, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+retina+therapy+(SRT)+for+clinically+significant+diabetic+macular+edema.">Selective retina therapy (SRT) for clinically significant diabetic macular edema.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 248 (9), 1263-1272 (2010).</li><li>Brinkmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+temperature+determination+during+retinal+photocoagulation+on+patients.">Real-time temperature determination during retinal photocoagulation on patients.</a> J Biomed Opt. 17 (6), 061219 (2012).</li><li>Yoshimura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocoagulated+human+retinal+pigment+epithelial+cells+produce+an+inhibitor+of+vascular+endothelial+cell+proliferation.">Photocoagulated human retinal pigment epithelial cells produce an inhibitor of vascular endothelial cell proliferation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (8), 1686-1691 (1995).</li><li>Denton, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damage+Thresholds+for+Exposure+to+NIR+and+Blue+Lasers+in+an+In+Vitro+RPE+Cell+System.">Damage Thresholds for Exposure to NIR and Blue Lasers in an In Vitro RPE Cell System.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (7), 3065-3073 (2006).</li><li>Shrestha, R., Choi, T. Y., Chang, W., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-precision+micropipette+sensor+for+cellular-level+real-time+thermal+characterization.">A high-precision micropipette sensor for cellular-level real-time thermal characterization.</a> Sensors (Basel). 11 (9), 8826-8835 (2011).</li><li>Gao, F., Ye, Y., Zhang, Y., Yang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+bath+hyperthermia+reduces+stemness+of+colon+cancer+cells.">Water bath hyperthermia reduces stemness of colon cancer cells.</a> Clin Biochem. 46 (16-17), 1747-1750 (2013).</li><li>Jansen, E. D., van Leeuwen, T. G., Motamedi, M., Borst, C., Welch, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+dependence+of+the+absorption+coefficient+of+water+for+midinfrared+laser+radiation.">Temperature dependence of the absorption coefficient of water for midinfrared laser radiation.</a> Lasers Surg Med. 14 (3), 258-268 (1994).</li><li>Iwami, H., Pruessner, J., Shiraki, K., Brinkmann, R., Miura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+of+a+laser-induced+sub-lethal+temperature+rise+on+RPE+cells+from+oxidative+stress.">Protective effect of a laser-induced sub-lethal temperature rise on RPE cells from oxidative stress.</a> Exp Eye Res. 124, 37-47 (2014).</li><li>Denton, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+correlated+microthermography+maps+threshold+temperature+in+laser-induced+damage.">Spatially correlated microthermography maps threshold temperature in laser-induced damage.</a> J Biomed Optics. 16 (3), (2011).</li><li>Morgan, C. M., Schatz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrophic+creep+of+the+retinal+pigment+epithelium+after+focal+macular+photocoagulation.">Atrophic creep of the retinal pigment epithelium after focal macular photocoagulation.</a> Ophthalmology. 96 (1), 96-103 (1989).</li></ol>

Ved diskussion af temperaturrelaterede biologiske cellulære reaktioner er ikke kun temperaturen men også tidsvarigheden af ​​den forøgede temperatur vigtig, da de fleste biokemiske processer er tidsafhængige. Især inden for laser-induceret hypertermi i oftalmologi, på grund af den korte tidsperiode fra millisekunder til sekunder-det er svært at undersøge cellulære termiske effekter med præcis temperaturkontrol. Derfor er en laserbestrålingsopsætning egnet til cellekulturmodellen og med et operationssyste...

Forståelse af temperaturafhængige cellebiologiske reaktioner er af stor betydning for vellykkede hypertermi behandlinger. Retinal laserfotokoagulation med en termisk laser, der anvendes i oftalmologi, er en af ​​de mest etablerede laserbehandlinger i medicin. Synligt lys, hovedsagelig fra grøn til gul bølgelængder, bruges til retinal laserbehandling. Lyset absorberes stærkt af melaninet i retinale pigmentepiteliale (RPE) celler, der danner det yderste celle monolag af nethinden. Der har været nylig interesse blandt læger og forskere ved meget mild termisk bestråling (sub-synlig fotokoagulation) som en ny terapeutisk strategi for forskellige former for retinale sygdomme 1 , 2 . Som følge af denne tendens er vores interesse i RPE-celler med lette opvarmning under præcis temperaturregulering, en teknik kaldet temperaturstyret fototermisk terapi (TC-PTT). Seneste optoAkustisk teknologi fra vores institut har muliggjort realtidsmålingen af ​​temperaturstigninger på bestrålede steder i nethinden. Dette gør det muligt at styre temperaturforøgelsen under bestråling 3 . Eftersom sublethal hypertermi på retina, der er forårsaget af opvarmning af RPE-celler sublethalt, ikke er blevet betragtet tidligere på grund af umuligheden af ​​at måle og styre temperaturen, har de temperaturafhængige cellereaktioner af RPE-celler efter termisk laserbestråling imidlertid Blevet undersøgt meget lidt til dato. Desuden har temperaturforskellen ikke kun været diskuteret i detaljer, men også forskellen i cellernes adfærd hos de overlevende celler efter sublethal og dødelig bestråling. For at indsamle videnskabeligt bevis på TC-PTT-baserede behandlinger sigter vi derfor på at belyse de temperaturafhængige RPE-cellebiologiske reaktioner og deres mekanismer ved hjælp af in vitro eksperimentelle opsætninger. For tHans formål er det nødvendigt at etablere en celleopvarmning opsætning, der opfylder følgende betingelser: 1) en mulighed for hurtig temperaturstigning, 2) en præcist styret tid og temperatur og 3) et relativt højt antal undersøgte celler til biologiske eksperimenter . Med hensyn til opvarmningsmetoden er en klinisk laser, såsom en frekvensdobbelt Nd.YAG laser (532 nm), desværre uegnet til celledyrkning. Dette skyldes det stærkt reducerede antal melanosomer i dyrkede RPE-celler. Laserlysabsorptionen kan være inhomogen, og temperaturstigningen på cellulærniveau varierer mellem forsøg, selv når det bestråles med samme strålingseffekt. Flere tidligere undersøgelser har rapporteret brugen af ​​sortpapir under skålbunden under bestråling 4 eller anvendelsen af ​​yderligere melanosomer, der fagocytiseres af kulturcellerne før forsøgene 5 , 6 . Mange afDe in vitro biologiske undersøgelser til vurdering af hypertermi-inducerede celleresponser er blevet udført ved anvendelse af en varmplade, et vandbad eller en CO 2- inkubator med en temperaturindstilling 7 . Disse metoder kræver en lang varmetid, fordi det tager noget tid ( dvs. flere minutter) for at nå den ønskede temperatur. Derudover er det vanskeligt at opnå en detaljeret termisk historie ( dvs. temperatur multipliceret med tiden) på cellulært niveau ved hjælp af disse metoder. Desuden kan temperaturen mellem cellerne i forskellige positioner i en kulturskål være forskellig på grund af diffusion af variabel temperatur. I de fleste tilfælde er denne tidsmæssige og rumlige temperaturinformation under hypertermi ikke taget i betragtning til biologiske analyser, selvom biologisk cellerespons kan påvirkes kritisk af temperaturen og tidsvarigheden af ​​den forøgede temperatur. For at overvinde disse problemer, en kontiNuous-bølge thulium laser blev anvendt her til opvarmning af cellerne. Thulium laserstråling (λ = 1,94 μm) absorberes kraftigt af vand 8 , og cellerne i bunden af ​​dyrkningsskålen stimuleres termisk udelukkende gennem termisk diffusion. Laserfibre med en diameter på 365 μm er sat omkring 12 cm over dyrkningsskålen uden nogen optik imellem. Laserstrålediameteren afviger således, at den næsten svarer til den indre diameter af dyrkningsskålen (30 mm) ved dyrkningsmedlets overflade. Med en konsistent mængde dyrkningsmedium er det muligt at bestråle cellerne med temperaturforøgelsen Af høj repeterbarhed. Variable power settings gør det muligt at bestråle op til 20 W, og medietemperaturen på mobilniveau kan øges op til ΔT ≈ 26 ° C om 10 s. Ved at ændre bestrålingsbetingelserne er det også muligt at ændre laserstråleprofilen for at variere temperaturfordelingenPå i en kultur skål. For eksempel er det muligt at undersøge med en Gauss-lignende temperaturfordeling som i den aktuelle undersøgelse eller med en homogen temperaturfordeling. Sidstnævnte kan være fordelagtigt til undersøgelse af virkningerne af temperaturafhængige celleresponser mere specifikt for sublethal temperaturstigninger, men ikke for celledødspænding eller sårhelingsresponser. Samlet set kan thulium-laserbestråling muliggøre undersøgelse af forskellige slags biologiske faktorer, såsom gen / proteinekspression, celledødskinetik, celleproliferation og udvikling af cellefunktionalitet efter forskellige termiske eksponeringer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796-500ML</td>
			<td>Add (2)-(4) before use. Warm in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100&#215;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955-100ML</td>
			<td>Containing 10000 units penicillin, 10 mg streptomycin and 25 &#956;g Amphotericin B in 1ml. Add 5.5 ml in 500 ml medium bottle (1) before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636-100ML</td>
			<td>Add 5.5 ml in 500 ml medium bottle (1) before use (final concentration: 1 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12736C-500ML</td>
			<td>Add 50 ml in 500 ml medium bottole (1) before use (final: 10%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from porcine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4799-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ED-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human VEGF Quantikine ELISA Kit</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>DVE00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxiselect Total Glutathione Assay Kit</td>
			<td>Cell Biolabs, Inc</td>
			<td>STA-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apoptotic/Necrotic/Healthy Cells Detection Kit</td>
			<td>PromoKine</td>
			<td>PK-CA707-30018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thulium laser</td>
			<td>Starmedtec GmbH</td>
			<td>Prototype</td>
			<td>0-20 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>365 mm core diameter fiber</td>
			<td>LASER COMPONENTS Germany</td>
			<td>CF01493-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocouple</td>
			<td>Omega Engineering Inc</td>
			<td>HYP-0- 33-1-T-G-60-SMPW-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate</td>
			<td>MEDAX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (spectrofluorometer)</td>
			<td>Molecular Device</td>
			<td>Spectramax M4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell homogenizer</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>TissueLyser LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mathematical software program</td>
			<td>The Mathworks. Inc</td>
			<td>MATLAB Release 2015b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>system-design platform</td>
			<td>National Instrument</td>
			<td>Labview</td>
			<td>Laboratory Virtual Instrument Engineering Workbench</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

continuous-wave thulium laser for heating cultured cells to investigate cellular thermal effects

En oprindelig metode til opvarmning af dyrkede celler ved anvendelse af en 1,94 μm kontinuerlig bølge-thuliumlaser til biologisk vurdering indføres her. Thulium laserstråling absorberes kraftigt af vand, og cellerne i bunden af ​​dyrkningsskålen opvarmes ved termisk diffusion. En laserfiber med en diameter på 365 μm er sat omkring 12 cm over dyrkningsskålen uden nogen optik, således at laserstrålediameteren er næsten ækvivalent med den indre diameter af dyrkningsskålen (30 mm). Ved at holde en konsistent mængde kulturmedium i hvert forsøg er det muligt at bestråle cellerne med en høj reproducerbar temperaturforøgelse. For at kalibrere temperaturforøgelsen og dens fordeling i en cellekulturskål for hver effektindstilling måles temperaturen i løbet af 10 s af bestråling i forskellige positioner og på cellulærniveau. Temperaturfordelingen blev repræsenteret ved hjælp af en matematisk grafiksoftwareProgram, og dets mønster på tværs af kulturskålen var i gaussisk form. Efter laserbestråling kunne forskellige biologiske eksperimenter udføres for at vurdere temperaturafhængige celleresponser. I dette manuskript introduceres levedygtighedsfarvning ( dvs. at skelne levende, apoptotiske og døde celler) for at hjælpe med at bestemme tærskelværdierne for celleapoptose og død efter forskellige tidspunkter. Fordelene ved denne metode er præcisionen af ​​temperaturen og tidspunktet for opvarmning såvel som dens høje effektivitet i opvarmningsceller i en hel cellekulturskål. Desuden giver det mulighed for at studere med en lang række temperaturer og tidsvarigheder, som kan styres godt af et edb-operativsystem.

Temperaturfordeling efter forskellige strømindstillinger Alle temperaturudviklinger for hver enkelt bestråling blev overvåget ved temperaturkalibrering. Ud fra disse data blev den maksimale temperatur ved det målte punkt opnået og defineret som T max (° C). Som vist i figur 3A blev programmet udført på tidspunktet, hvor kulturskålen blev anbragt på varmepladen. Efter 140 s &quot;...

Watch this Scientific Journal Video about Continuous-wave Thulium Laser for Heating Cultured Cells to Investigate Cellular Thermal Effects at JoVE.com

Continuous-wave Thulium Laser for Heating Cultured Cells to Investigate Cellular Thermal Effects

Der introduceres en original eksperimentel opsætning til opvarmning af celler i en kulturskål ved brug af 1,94 μm kontinuerlig bølge laserstråling. Ved anvendelse af denne metode kan de biologiske reaktioner af retinale pigmentepiteliale (RPE) celler efter forskellige termiske eksponeringer undersøges.

Kontinuerlig-bølge-thuliumlaser til opvarmning af dyrkede celler for at undersøge cellulære termiske virkninger

An original method to heat cultured cells using a 1.94 &#181;m continuous-wave thulium laser for biological assessment is introduced here. Thulium laser ...

Research

JoVE Journal

Biology

Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Oprettelse af Definerede Gasformige Miljøer at studere effekten af ​​hypoxi på<em&gt; C. elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Kromosom Forberedelse Fra dyrkede celler

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

siRNA Screening at identificere Ubiquitin og ubiquitinlignende System Regulators Biologisk Pathways i dyrkede pattedyrceller

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

Massively Parallel Reporter Analyser i dyrkede pattedyrceller

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Kvantificering af endotelcelle Klæbeevne<em&gt; In vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nephrotoxin Mikroinjektion i zebrafisk til model akut nyreskade

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Brug mikrofluidenheder til måling Levetid og cellefænotyper i Single Spirende gærceller

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Et grafisk brugergrænseflade til softwareassisteret sporing af proteinkoncentration i dynamiske cellulære protrusioner

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...