Name: continuous-wave thulium laser for heating cultured cells to investigate cellular thermal effects
Uploaded: 2017-06-30T13:00:00
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この研究は、ドイツ連邦教育研究省（BMBF）（助成金＃13GW0043C）と欧州航空宇宙研究開発局（EOARD、助成金＃FA9550-15-1-0443）

1.RPE細胞培養<ol><li> ブタの眼からのRPE細胞の単離 <ol><li>地元の屠殺場から新しく除核されたブタの目を入手する。冷暗所に保管してください（4℃）。 </li><li>はさみで細胞外組織を除去し、5分間消毒液に目を浸します。 </li><li>使用するまでカルシウムとマグネシウムを含まない滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS（ - ））に眼を入れます。 </li><li>メスを使用して、角膜輪部の約5mm?...

<ol>
	<li>Inagaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+efficacy+of+pure+yellow+(577-nm)+and+810-nm+subthreshold+micropulse+laser+photocoagulation+combined+with+yellow+(561-577-nm)+direct+photocoagulation+for+diabetic+macular+edema.">Comparative efficacy of pure yellow (577-nm) and 810-nm subthreshold micropulse laser photocoagulation combined with yellow (561-577-nm) direct photocoagulation for diabetic macular edema.</a> Jpn J Ophthalmol. 59 (1), 21-28 (2015).</li><li>Roider, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+retina+therapy+(SRT)+for+clinically+significant+diabetic+macular+edema.">Selective retina therapy (SRT) for clinically significant diabetic macular edema.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 248 (9), 1263-1272 (2010).</li><li>Brinkmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+temperature+determination+during+retinal+photocoagulation+on+patients.">Real-time temperature determination during retinal photocoagulation on patients.</a> J Biomed Opt. 17 (6), 061219 (2012).</li><li>Yoshimura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocoagulated+human+retinal+pigment+epithelial+cells+produce+an+inhibitor+of+vascular+endothelial+cell+proliferation.">Photocoagulated human retinal pigment epithelial cells produce an inhibitor of vascular endothelial cell proliferation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (8), 1686-1691 (1995).</li><li>Denton, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damage+Thresholds+for+Exposure+to+NIR+and+Blue+Lasers+in+an+In+Vitro+RPE+Cell+System.">Damage Thresholds for Exposure to NIR and Blue Lasers in an In Vitro RPE Cell System.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (7), 3065-3073 (2006).</li><li>Shrestha, R., Choi, T. Y., Chang, W., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-precision+micropipette+sensor+for+cellular-level+real-time+thermal+characterization.">A high-precision micropipette sensor for cellular-level real-time thermal characterization.</a> Sensors (Basel). 11 (9), 8826-8835 (2011).</li><li>Gao, F., Ye, Y., Zhang, Y., Yang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+bath+hyperthermia+reduces+stemness+of+colon+cancer+cells.">Water bath hyperthermia reduces stemness of colon cancer cells.</a> Clin Biochem. 46 (16-17), 1747-1750 (2013).</li><li>Jansen, E. D., van Leeuwen, T. G., Motamedi, M., Borst, C., Welch, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+dependence+of+the+absorption+coefficient+of+water+for+midinfrared+laser+radiation.">Temperature dependence of the absorption coefficient of water for midinfrared laser radiation.</a> Lasers Surg Med. 14 (3), 258-268 (1994).</li><li>Iwami, H., Pruessner, J., Shiraki, K., Brinkmann, R., Miura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+of+a+laser-induced+sub-lethal+temperature+rise+on+RPE+cells+from+oxidative+stress.">Protective effect of a laser-induced sub-lethal temperature rise on RPE cells from oxidative stress.</a> Exp Eye Res. 124, 37-47 (2014).</li><li>Denton, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+correlated+microthermography+maps+threshold+temperature+in+laser-induced+damage.">Spatially correlated microthermography maps threshold temperature in laser-induced damage.</a> J Biomed Optics. 16 (3), (2011).</li><li>Morgan, C. M., Schatz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrophic+creep+of+the+retinal+pigment+epithelium+after+focal+macular+photocoagulation.">Atrophic creep of the retinal pigment epithelium after focal macular photocoagulation.</a> Ophthalmology. 96 (1), 96-103 (1989).</li></ol>

温度に関連する生物学的細胞応答を議論する際には、ほとんどの生化学的過程が時間依存的であるので、温度だけでなく、温度の上昇時間も重要である。特に、眼科におけるレーザー誘発高熱症の分野では、ミリ秒から秒までの短い時間範囲のため、正確な温度制御による細胞熱作用を調べることは困難である。したがって、厳密な温度および時間制御を可能にする操作システムを有する細?...

温度依存性の細胞生物学的応答を理解することは、温熱治療を成功させるために非常に重要である。眼科で使用される熱レーザーによる網膜レーザー光凝固は、医学において最も確立されたレーザー治療の1つである。主に緑色から黄色の波長の可視光線が、網膜レーザー治療に使用されます。光は、網膜の最も外側の細胞単層を形成する網膜色素上皮（RPE）細胞のメラニンによって高度に吸収される。様々な種類の網膜障害に対する新しい治療戦略として、非常に軽度の熱照射（目に見える光凝固）の医師および研究者の間で最近の関心があった1,2 。この傾向に続いて、私たちの関心は、温度制御型光熱治療（TC-PTT）と呼ばれる技術である正確な温度制御下でRPE細胞を致死的に加熱することにあります。 最近のオプト我々の研究所の音響技術は、網膜の照射部位における温度上昇のリアルタイム測定を可能にしている。これにより、照射中の温度上昇を制御することができます3 。しかし、網膜上の致死量以下の温熱療法は、温度を測定し制御することが不可能であることから以前は考慮されていなかったため、熱レーザー照射後のRPE細胞の温度依存性細胞応答は、今日までほとんど研究されていない。さらに、温度差は詳細に議論されていないだけでなく、致死量以下の照射後の生き残った細胞の細胞挙動の差異も有する。したがって、TC-PTTに基づく治療法に関する科学的証拠を収集するために、温度依存性RPE細胞の生物学的応答およびそれらのメカニズムをin vitro実験装置を用いて解明することを目的とする。 t彼の目的は、1）迅速な温度上昇の可能性、2）正確に制御された時間および温度、および3）生物学的実験のための検査細胞の比較的高い数の条件を満たす細胞加熱装置を確立することが必要である。加熱方法に関しては、周波数が倍増されたNd.YAGレーザー（532nm）のような臨床レーザーは、残念なことに、細胞培養加熱には不適当である。これは、培養されたRPE細胞におけるメラノソームの数が著しく減少したためである。レーザ光の吸収は不均質であり、細胞レベルでの温度上昇は、同じ放射能を照射した場合であっても、実験の間に可変である。いくつかの以前の研究では、照射4の間の皿の底の下の黒い紙の使用、または実験5,6の前に培養細胞によって貪食された追加のメラノソームの使用が報告されている。たくさんの温熱プレート、水浴、または温度設定7の CO 2インキュベーターを使用して、温熱療法によって誘発された細胞応答を評価するためのin vitro生物学的研究を行った。これらの方法は、所望の温度に到達するまでにある時間（ すなわち、数分）を要するため、長い加熱期間を必要とする。さらに、これらの方法を使用すると、細胞レベルでの詳細な熱履歴（ すなわち、時間を掛けた温度）を得ることは困難である。さらに、1つの培養ディッシュ内の異なる位置にある細胞間の温度は、可変温度拡散によって異なる場合がある。大部分の場合、生物学的細胞応答は、温度の上昇および温度の持続時間によって致命的な影響を受ける可能性があるが、温熱療法中のこの時間的および空間的温度情報は、生物学的分析のため考慮されていない。 これらの問題を克服するために、contiここでは、セルを加熱するために裸波ツリウムレーザーを使用した。ツリウムレーザー放射（λ=1.94μm）は水8に強く吸収され、培養皿の底の細胞は熱拡散のみによって熱刺激される。直径365μmのレーザーファイバーは培養皿の約12cm上に置かれ、その間に光学機器はありません。レーザービームの直径は、培地の表面で培養ディッシュ（30mm）の内径とほぼ等しくなるように発散する。一定量の培養培地を用いて、温度上昇を細胞に照射することが可能である高い再現性があります。可変出力設定では最大20Wの照射が可能で、細胞レベルでの媒体温度は10秒でΔT≈26℃まで上昇する可能性があります。 照射条件を変更することにより、レーザビームプロファイルを変更して温度分布を変化させることも可能である文化皿で。例えば、現在の研究のように、ガウス様の温度分布で、または均一な温度分布で調べることが可能である。後者は、温度依存性細胞応答の影響を、より具体的には致死量以下の温度上昇について調べるのに有利であり得るが、細胞死ストレスまたは創傷治癒応答についてはそうではない。 総合的には、ツリウムレーザー照射は、異なる熱曝露の後に、遺伝子/タンパク質発現、細胞死速度論、細胞増殖、および細胞機能発現などの異なる種類の生物学的因子の調査を可能にすることができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796-500ML</td>
			<td>Add (2)-(4) before use. Warm in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100&#215;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955-100ML</td>
			<td>Containing 10000 units penicillin, 10 mg streptomycin and 25 &#956;g Amphotericin B in 1ml. Add 5.5 ml in 500 ml medium bottle (1) before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636-100ML</td>
			<td>Add 5.5 ml in 500 ml medium bottle (1) before use (final concentration: 1 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12736C-500ML</td>
			<td>Add 50 ml in 500 ml medium bottole (1) before use (final: 10%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from porcine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4799-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ED-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human VEGF Quantikine ELISA Kit</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>DVE00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxiselect Total Glutathione Assay Kit</td>
			<td>Cell Biolabs, Inc</td>
			<td>STA-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apoptotic/Necrotic/Healthy Cells Detection Kit</td>
			<td>PromoKine</td>
			<td>PK-CA707-30018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thulium laser</td>
			<td>Starmedtec GmbH</td>
			<td>Prototype</td>
			<td>0-20 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>365 mm core diameter fiber</td>
			<td>LASER COMPONENTS Germany</td>
			<td>CF01493-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocouple</td>
			<td>Omega Engineering Inc</td>
			<td>HYP-0- 33-1-T-G-60-SMPW-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate</td>
			<td>MEDAX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (spectrofluorometer)</td>
			<td>Molecular Device</td>
			<td>Spectramax M4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell homogenizer</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>TissueLyser LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mathematical software program</td>
			<td>The Mathworks. Inc</td>
			<td>MATLAB Release 2015b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>system-design platform</td>
			<td>National Instrument</td>
			<td>Labview</td>
			<td>Laboratory Virtual Instrument Engineering Workbench</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

continuous-wave thulium laser for heating cultured cells to investigate cellular thermal effects

生物学的評価のために1.94μmの連続波ツリウムレーザーを用いて培養細胞を加熱する独自の方法をここに導入する。ツリウムレーザー放射は水に強く吸収され、培養皿の底の細胞は熱拡散によって加熱される。直径365μmのレーザーファイバーは培養ディッシュの約12cm上に置かれ、レーザービーム直径は培養ディッシュの内径（30mm）とほぼ等しくなるように光学的には設定されていない。各実験において培地の量を一定に保つことにより、再現性の高い温度上昇を細胞に照射することが可能である。 1つの細胞培養皿中の各パワー設定についての温度上昇およびその分布を較正するために、異なる位置および細胞レベルで10秒の照射中に温度を測定した。温度分布は、数学的グラフィックスソフトウェアプログラムであり、文化皿全体のパターンはガウス型であった。レーザー照射後、異なる生物学的実験を行って、温度依存性細胞応答を評価することができた。この原稿では、異なる時点後の細胞アポトーシスおよび死亡の閾値温度を決定するのを助けるために、生存率染色（ すなわち 、生存細胞、アポトーシス細胞および死細胞の区別）を導入する。 この方法の利点は、温度および加熱時間の正確さ、ならびに細胞培養皿全体における加熱細胞におけるその高い効率である。さらに、コンピュータ化されたオペレーティングシステムによって十分に制御され得る、多種多様な温度および時間間隔での学習が可能になる。

異なる電源設定後の温度分布温度較正では、各単一照射のすべての温度の変化を監視した。このデータから、測定された点における最大温度が得られ、T max （℃）として定義された。 図3Aに示すように、培養皿を加熱プレート上に置いた時点でプログラムを実行した。安定した培地温度を37℃?...

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Continuous-wave Thulium Laser for Heating Cultured Cells to Investigate Cellular Thermal Effects

1.94μmの連続波レーザー放射を用いた培養皿内の細胞を加熱するための元の実験装置をここに導入する。この方法を用いて、異なる熱暴露後の網膜色素上皮（RPE）細胞の生物学的応答を調べることができる。

培養細胞を加熱して細胞の熱作用を調べるための連続波型ツリウムレーザー

An original method to heat cultured cells using a 1.94 &#181;m continuous-wave thulium laser for biological assessment is introduced here. Thulium laser ...

Research

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