Name: continuous-wave thulium laser for heating cultured cells to investigate cellular thermal effects
Uploaded: 2017-06-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Continuous-wave Thulium Laser for Heating Cultured Cells to Investigate Cellular Thermal Effects at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av et forskningsbidrag fra det tyske føderale departementet for utdanning og forskning (stipend nr. 13GW0043C) og og et europeisk kontor for luftfartsforskning og utvikling (EOARD, gi # FA9550-15-1-0443)

1. RPE-cellekultur <ol><li> Isolering av RPE-celler fra svine øyne <ol><li> Hent ferske enucleated svin øyne fra det lokale slakteriet. Hold dem kule (4 ° C) og i et mørkt miljø. </li><li> Fjern ekstracellulært vev med saks og suge øynene i en antiseptisk oppløsning i 5 minutter. </li><li> Plasser øynene i sterilisert fosfatbuffert saltløsning uten kalsium og magnesium (PBS (-)) til bruk. </li><li> Ved hjelp av en skalpell, tråkk sclera på ca 5 mm bakre til hornhinnen limbus. Reseks hele f...

<ol>
	<li>Inagaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+efficacy+of+pure+yellow+(577-nm)+and+810-nm+subthreshold+micropulse+laser+photocoagulation+combined+with+yellow+(561-577-nm)+direct+photocoagulation+for+diabetic+macular+edema.">Comparative efficacy of pure yellow (577-nm) and 810-nm subthreshold micropulse laser photocoagulation combined with yellow (561-577-nm) direct photocoagulation for diabetic macular edema.</a> Jpn J Ophthalmol. 59 (1), 21-28 (2015).</li><li>Roider, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+retina+therapy+(SRT)+for+clinically+significant+diabetic+macular+edema.">Selective retina therapy (SRT) for clinically significant diabetic macular edema.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 248 (9), 1263-1272 (2010).</li><li>Brinkmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+temperature+determination+during+retinal+photocoagulation+on+patients.">Real-time temperature determination during retinal photocoagulation on patients.</a> J Biomed Opt. 17 (6), 061219 (2012).</li><li>Yoshimura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocoagulated+human+retinal+pigment+epithelial+cells+produce+an+inhibitor+of+vascular+endothelial+cell+proliferation.">Photocoagulated human retinal pigment epithelial cells produce an inhibitor of vascular endothelial cell proliferation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (8), 1686-1691 (1995).</li><li>Denton, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damage+Thresholds+for+Exposure+to+NIR+and+Blue+Lasers+in+an+In+Vitro+RPE+Cell+System.">Damage Thresholds for Exposure to NIR and Blue Lasers in an In Vitro RPE Cell System.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (7), 3065-3073 (2006).</li><li>Shrestha, R., Choi, T. Y., Chang, W., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-precision+micropipette+sensor+for+cellular-level+real-time+thermal+characterization.">A high-precision micropipette sensor for cellular-level real-time thermal characterization.</a> Sensors (Basel). 11 (9), 8826-8835 (2011).</li><li>Gao, F., Ye, Y., Zhang, Y., Yang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+bath+hyperthermia+reduces+stemness+of+colon+cancer+cells.">Water bath hyperthermia reduces stemness of colon cancer cells.</a> Clin Biochem. 46 (16-17), 1747-1750 (2013).</li><li>Jansen, E. D., van Leeuwen, T. G., Motamedi, M., Borst, C., Welch, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+dependence+of+the+absorption+coefficient+of+water+for+midinfrared+laser+radiation.">Temperature dependence of the absorption coefficient of water for midinfrared laser radiation.</a> Lasers Surg Med. 14 (3), 258-268 (1994).</li><li>Iwami, H., Pruessner, J., Shiraki, K., Brinkmann, R., Miura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+of+a+laser-induced+sub-lethal+temperature+rise+on+RPE+cells+from+oxidative+stress.">Protective effect of a laser-induced sub-lethal temperature rise on RPE cells from oxidative stress.</a> Exp Eye Res. 124, 37-47 (2014).</li><li>Denton, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+correlated+microthermography+maps+threshold+temperature+in+laser-induced+damage.">Spatially correlated microthermography maps threshold temperature in laser-induced damage.</a> J Biomed Optics. 16 (3), (2011).</li><li>Morgan, C. M., Schatz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrophic+creep+of+the+retinal+pigment+epithelium+after+focal+macular+photocoagulation.">Atrophic creep of the retinal pigment epithelium after focal macular photocoagulation.</a> Ophthalmology. 96 (1), 96-103 (1989).</li></ol>

Ved å diskutere temperaturrelaterte biologiske cellulære responser, er ikke bare temperaturen, men også varigheten av den økte temperaturen av betydning, da de fleste biokjemiske prosesser er tidsavhengige. Spesielt innen laser-indusert hypertermi i oftalmologi, på grunn av det korte tidsområdet, fra millisekunder til sekunder, er det vanskelig å undersøke cellulære termiske effekter med presis temperaturkontroll. Derfor er det ønskelig med en laserbestrålingsoppsett som passer for cellekulturmodellen og med ...

Forståelse av temperaturavhengige cellebiologiske responser er av stor betydning for vellykkede hypertermi-behandlinger. Retinal laser fotokoagulasjon med en termisk laser, brukt i oftalmologi, er en av de mest etablerte laserbehandlinger i medisin. Synlig lys, hovedsakelig fra grønn til gul bølgelengder, brukes i retinal laserbehandling. Lyset absorberes sterkt av melaninet i retinale pigmentepiteliale (RPE) celler, som danner det ytre cellemonolaget av netthinnen. Det har vært ny interesse blant leger og forskere ved svært mild termisk bestråling (sub-synlig fotokoagulering) som en ny terapeutisk strategi for ulike typer retinal lidelser 1 , 2 . Etter denne trenden, er vår interesse i RPE-celler med lette oppvarming under presis temperaturkontroll, en teknikk som kalles temperaturstyrt fototermisk terapi (TC-PTT). Nylig optoAkustisk teknologi fra vårt institutt har gitt mulighet for sanntidsmåling av temperaturøkninger på bestrålede steder i netthinnen. Dette muliggjør kontroll over temperaturøkningen under bestråling 3 . Siden sublethal hyperthermia på retina, forårsaket av oppvarming av RPE-celler sublethalt, ikke er blitt vurdert tidligere på grunn av umuligheten av å måle og kontrollere temperaturen, har de temperaturavhengige celleresponsene av RPE-celler etter termisk laserbestråling Blitt studert svært lite til dags dato. Dessuten har ikke bare temperaturforskjellen blitt diskutert i detalj, men også differansen i celledriftene til de overlevende celler etter sublodal og dødelig bestråling. Derfor, for å samle vitenskapelig bevis på TC-PTT-baserte behandlinger, tar vi sikte på å belyse de temperaturavhengige RPE-cellens biologiske responser og deres mekanismer ved hjelp av in vitro eksperimentelle oppsett. For tHans formål er det nødvendig å etablere en celleoppvarming oppsett som oppfyller følgende betingelser: 1) muligheten for rask temperatur øker, 2) en nøyaktig kontrollert tid og temperatur og 3) et relativt høyt antall undersøkte celler for biologiske eksperimenter . Når det gjelder oppvarmingsmetoden, er en klinisk laser, som en frekvensdoblet Nd.YAG-laser (532 nm), dessverre uegnet til oppsamling av cellekultur. Dette skyldes sterkt redusert antall melanosomer i dyrkede RPE-celler. Lasertallabsorpsjonen kan være inhomogen, og temperaturøkningen på cellulær nivå varierer mellom eksperimenter, selv når det bestråles med samme strålingskraft. Flere tidligere studier har rapportert bruken av svart papir under oppvaskbunnen under bestråling 4 eller bruk av ytterligere melanosomer som fagocytiseres av kulturcellene før forsøkene 5 , 6 . Mange avIn vitro biologiske studier for å vurdere hypertermi-induserte celleresponser har blitt utført ved bruk av en kokeplate, et vannbad eller en CO 2- inkubator med en temperaturinnstilling 7 . Disse metodene krever en lang varmetid fordi det tar litt tid ( dvs. flere minutter) for å nå ønsket temperatur. Videre er det vanskelig å oppnå en detaljert termisk historie ( dvs. temperatur multiplisert med tiden) på mobilnivå ved hjelp av disse metodene. Dessuten kan temperaturen mellom cellene ved forskjellige stillinger i en kulturrett skille fra variabel temperaturdiffusjon. I de fleste tilfeller er denne temperatur- og romtemperaturinformasjonen under hypertermi ikke tatt i betraktning for biologiske analyser, selv om biologisk cellerespons kan bli kritisk påvirket av temperaturen og tidsvarigheten av den økte temperaturen. For å overvinne disse problemene, en fortsettelseNuous-wave thulium laser ble brukt her for å varme opp cellene. Thulium laserstråling (λ = 1,94 μm) absorberes sterkt av vann 8 , og cellene på bunnen av kultiveringsskålen blir termisk stimulert utelukkende gjennom termisk diffusjon. Laserfibre med en diameter på 365 μm er satt ca. 12 cm over dyrkningsskålen, uten optikk i mellom. Laserstrålediameteren divergerer slik at den nesten er ekvivalent med den indre diameteren av kulturretten (30 mm) på overflaten av dyrkningsmediet. Med en konsistent mengde dyrkningsmedium er det mulig å bestråle cellene med temperaturøkningen Av høy repeterbarhet. Variabel effektinnstilling muliggjør bestråling med opptil 20 W, og medietemperaturen på mobilnivå kan økes opp til ΔT ≈ 26 ° C på 10 s. Ved å endre bestrålingsbetingelsene er det også mulig å endre laserstråleprofilen for å variere temperaturfordelingenPå i en kulturrett. For eksempel er det mulig å undersøke med en Gauss-lignende temperaturfordeling, som i den nåværende studien, eller med en homogen temperaturfordeling. Sistnevnte kan være fordelaktig for å undersøke virkningene av temperaturavhengige celleresponser mer spesifikt for sub-dødelig temperaturøkning, men ikke for celledødspenning eller sårhelingrespons. Samlet sett kan thulium-laserbestråling muliggjøre undersøkelse av forskjellige typer biologiske faktorer, som gen / proteinuttrykk, celledødskinetikk, celleproliferasjon og utvikling av cellefunksjonalitet etter forskjellige termiske eksponeringer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796-500ML</td>
			<td>Add (2)-(4) before use. Warm in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100&#215;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955-100ML</td>
			<td>Containing 10000 units penicillin, 10 mg streptomycin and 25 &#956;g Amphotericin B in 1ml. Add 5.5 ml in 500 ml medium bottle (1) before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636-100ML</td>
			<td>Add 5.5 ml in 500 ml medium bottle (1) before use (final concentration: 1 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12736C-500ML</td>
			<td>Add 50 ml in 500 ml medium bottole (1) before use (final: 10%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from porcine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4799-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ED-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human VEGF Quantikine ELISA Kit</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>DVE00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxiselect Total Glutathione Assay Kit</td>
			<td>Cell Biolabs, Inc</td>
			<td>STA-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apoptotic/Necrotic/Healthy Cells Detection Kit</td>
			<td>PromoKine</td>
			<td>PK-CA707-30018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thulium laser</td>
			<td>Starmedtec GmbH</td>
			<td>Prototype</td>
			<td>0-20 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>365 mm core diameter fiber</td>
			<td>LASER COMPONENTS Germany</td>
			<td>CF01493-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocouple</td>
			<td>Omega Engineering Inc</td>
			<td>HYP-0- 33-1-T-G-60-SMPW-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate</td>
			<td>MEDAX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (spectrofluorometer)</td>
			<td>Molecular Device</td>
			<td>Spectramax M4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell homogenizer</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>TissueLyser LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mathematical software program</td>
			<td>The Mathworks. Inc</td>
			<td>MATLAB Release 2015b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>system-design platform</td>
			<td>National Instrument</td>
			<td>Labview</td>
			<td>Laboratory Virtual Instrument Engineering Workbench</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

continuous-wave thulium laser for heating cultured cells to investigate cellular thermal effects

En opprinnelig metode for oppvarming av dyrkede celler ved bruk av en 1,94 μm kontinuerlig-bølge-thuliumlaser for biologisk vurdering er introdusert her. Thulium laserstråling absorberes sterkt av vann, og cellene på bunnen av kulturretten oppvarmes gjennom termisk diffusjon. En laserfiber med en diameter på 365 um er satt ca. 12 cm over dyrkningsskålen, uten noen optikk, slik at laserstrålediameteren er nesten ekvivalent med den indre diameteren av dyrkningsretten (30 mm). Ved å holde en konsekvent mengde kulturmedium i hvert eksperiment, er det mulig å bestråle cellene med en høyt reproducerbar temperaturøkning. For å kalibrere temperaturøkningen og dens fordeling i en cellekulturskål for hver effektinnstilling, ble temperaturen målt i løpet av 10 s med bestråling i forskjellige stillinger og på mobilnivå. Temperaturfordelingen ble representert ved hjelp av en matematisk grafikkprogramvareProgrammet, og mønsteret på tvers av kulturretten var i gaussisk form. Etter laserbestråling kan forskjellige biologiske eksperimenter utføres for å vurdere temperaturavhengige celleresponser. I dette manuskriptet presenteres levedyktighetsfarging ( dvs. å skille mellom levende, apoptotiske og døde celler) for å bestemme terskeltemperaturene for celleapoptose og død etter forskjellige tidspunkter. Fordelene ved denne metoden er presisjonen av temperaturen og tidspunktet for oppvarming, samt dens høye effektivitet i oppvarmingsceller i en hel cellekulturskål. Videre tillater det å studere med et stort utvalg av temperaturer og tidsvarigheter, som kan styres godt av et datastyrt operativsystem.

Temperaturfordeling etter ulike strøminnstillinger Alle temperaturutviklinger for hver enkelt bestråling ble overvåket ved temperaturkalibrering. Fra disse dataene ble den maksimale temperaturen ved det målte punkt oppnådd og definert som T max (° C). Som vist i figur 3A , ble programmet utført på tidspunktet da kulturretten ble plassert på varmeplaten. Etter 140 s &quot;forvarmin...

Watch this Scientific Journal Video about Continuous-wave Thulium Laser for Heating Cultured Cells to Investigate Cellular Thermal Effects at JoVE.com

Continuous-wave Thulium Laser for Heating Cultured Cells to Investigate Cellular Thermal Effects

Et originalt eksperimentelt oppsett for oppvarming av celler i en kulturrett med bruk av 1,94 μm kontinuerlig-bølgende laserstråling er introdusert her. Ved hjelp av denne metoden kan de biologiske responsene av retinale pigmentepiteliale (RPE) celler etter ulike termiske eksponeringer undersøkes.

Kontinuerlig-bølge-thuliumlaser for oppvarming av dyrkede celler for å undersøke cellulære termiske effekter

An original method to heat cultured cells using a 1.94 &#181;m continuous-wave thulium laser for biological assessment is introduced here. Thulium laser ...

Research

JoVE Journal

Biology

Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Opprette Definerte Gassformige Miljøer å studere effekter av hypoksi på<em&gt; C. elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Kromosom Forberedelse Fra dyrkede celler

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

siRNA Screening for å identifisere Ubiquitin og Ubiquitin-lignende system regulatorer av biologiske mekanismer i dyrkede pattedyrceller

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

Massivt Parallelle Reporter Analyser i dyrkede pattedyrceller

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Kvantifisering av endotelcelle klebrighet<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nyreskade Mikroinjeksjon i Sebrafisk til Model Akutt nyreskade

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Ved hjelp av mikrofluid enheter for å måle levetid og Cellular fenotyper i enkelt spirende gjærceller

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Et grafisk brukergrensesnitt for programvareassistert sporing av proteinkonsentrasjon i dynamiske cellulære protrusjoner

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...