Name: continuous-wave thulium laser for heating cultured cells to investigate cellular thermal effects
Uploaded: 2017-06-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Continuous-wave Thulium Laser for Heating Cultured Cells to Investigate Cellular Thermal Effects at JoVE.com

Detta arbete stöddes av ett forskningsbidrag från det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (BMBF) (bidrag nr 13GW0043C) och och ett europeiskt kontor för rymdforskning och utveckling (EOARD, bevilja # FA9550-15-1-0443)

1. RPE-cellkultur <ol><li> Isolering av RPE-celler från svinögon <ol><li> Hämta fräscha enukleerade svinögon från det lokala slakteriet. Håll dem svala (4 ° C) och i en mörk miljö. </li><li> Ta bort extracellulära vävnader med sax och blöt i ögonen i en antiseptisk lösning i 5 minuter. </li><li> Placera ögonen i steriliserad fosfatbuffrad saltlösning utan kalcium och magnesium (PBS (-)) tills användning. </li><li> Använd en skalpell, tränga in i sclera på ca 5 mm bakom hornhinnets...

<ol>
	<li>Inagaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+efficacy+of+pure+yellow+(577-nm)+and+810-nm+subthreshold+micropulse+laser+photocoagulation+combined+with+yellow+(561-577-nm)+direct+photocoagulation+for+diabetic+macular+edema.">Comparative efficacy of pure yellow (577-nm) and 810-nm subthreshold micropulse laser photocoagulation combined with yellow (561-577-nm) direct photocoagulation for diabetic macular edema.</a> Jpn J Ophthalmol. 59 (1), 21-28 (2015).</li><li>Roider, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+retina+therapy+(SRT)+for+clinically+significant+diabetic+macular+edema.">Selective retina therapy (SRT) for clinically significant diabetic macular edema.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 248 (9), 1263-1272 (2010).</li><li>Brinkmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+temperature+determination+during+retinal+photocoagulation+on+patients.">Real-time temperature determination during retinal photocoagulation on patients.</a> J Biomed Opt. 17 (6), 061219 (2012).</li><li>Yoshimura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocoagulated+human+retinal+pigment+epithelial+cells+produce+an+inhibitor+of+vascular+endothelial+cell+proliferation.">Photocoagulated human retinal pigment epithelial cells produce an inhibitor of vascular endothelial cell proliferation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (8), 1686-1691 (1995).</li><li>Denton, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damage+Thresholds+for+Exposure+to+NIR+and+Blue+Lasers+in+an+In+Vitro+RPE+Cell+System.">Damage Thresholds for Exposure to NIR and Blue Lasers in an In Vitro RPE Cell System.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (7), 3065-3073 (2006).</li><li>Shrestha, R., Choi, T. Y., Chang, W., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-precision+micropipette+sensor+for+cellular-level+real-time+thermal+characterization.">A high-precision micropipette sensor for cellular-level real-time thermal characterization.</a> Sensors (Basel). 11 (9), 8826-8835 (2011).</li><li>Gao, F., Ye, Y., Zhang, Y., Yang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+bath+hyperthermia+reduces+stemness+of+colon+cancer+cells.">Water bath hyperthermia reduces stemness of colon cancer cells.</a> Clin Biochem. 46 (16-17), 1747-1750 (2013).</li><li>Jansen, E. D., van Leeuwen, T. G., Motamedi, M., Borst, C., Welch, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+dependence+of+the+absorption+coefficient+of+water+for+midinfrared+laser+radiation.">Temperature dependence of the absorption coefficient of water for midinfrared laser radiation.</a> Lasers Surg Med. 14 (3), 258-268 (1994).</li><li>Iwami, H., Pruessner, J., Shiraki, K., Brinkmann, R., Miura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+of+a+laser-induced+sub-lethal+temperature+rise+on+RPE+cells+from+oxidative+stress.">Protective effect of a laser-induced sub-lethal temperature rise on RPE cells from oxidative stress.</a> Exp Eye Res. 124, 37-47 (2014).</li><li>Denton, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+correlated+microthermography+maps+threshold+temperature+in+laser-induced+damage.">Spatially correlated microthermography maps threshold temperature in laser-induced damage.</a> J Biomed Optics. 16 (3), (2011).</li><li>Morgan, C. M., Schatz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrophic+creep+of+the+retinal+pigment+epithelium+after+focal+macular+photocoagulation.">Atrophic creep of the retinal pigment epithelium after focal macular photocoagulation.</a> Ophthalmology. 96 (1), 96-103 (1989).</li></ol>

Vid diskussion av temperaturrelaterade biologiska cellulära reaktioner är inte bara temperaturen men också tiden för den ökade temperaturen av betydelse, eftersom de flesta biokemiska processer är tidsberoende. Särskilt inom området för laserinducerad hypertermi i oftalmologi, på grund av det korta tidsintervallerna, från millisekunder till sekunder, är det svårt att undersöka cellulära termiska effekter med exakt temperaturkontroll. Därför är en laserbestrålningsinstallation lämplig för cellodlings...

Förstå temperaturberoende cellbiologiska reaktioner är av stor betydelse för framgångsrika hypertermibehandlingar. Retinal laserfotokoagulering med en termisk laser, som används i oftalmologi, är en av de mest etablerade laserbehandlingarna i medicin. Synligt ljus, mestadels från grön till gul våglängder, används vid retinal laserbehandling. Ljuset absorberas starkt av melaninet i retinala pigmentepiteliala (RPE) celler, som bildar det yttersta cellmonolaget i näthinnan. Det har varit aktuellt intresse bland läkare och forskare vid mycket mild termisk bestrålning (sub-synlig fotokoagulering) som en ny terapeutisk strategi för olika typer av retinala sjukdomar 1 , 2 . Efter denna trend är vårt intresse att höja RPE-celler med lågt värme under exakt temperaturkontroll, en teknik som kallas temperaturstyrd fototermisk terapi (TC-PTT). Senaste optoAkustisk teknik från vårt institut har gjort det möjligt för realtidsmätning av temperaturökningar vid bestrålade platser i näthinnan. Detta möjliggör kontroll över temperaturökning under bestrålning 3 . Eftersom sub-dödlig hypertermi på näthinnan, orsakad av upphettning av RPE-celler sub-lethalt, inte tidigare har beaktats på grund av omöjligheten att mäta och styra temperaturen, har emellertid de temperaturberoende cellreaktionerna av RPE-celler efter termisk laserbestrålning Har studerats väldigt lite hittills. Dessutom har inte temperaturskillnaden inte diskuterats i detalj, utan även skillnaden i cellöverträdandet hos de överlevande cellerna efter sub-dödlig och dödlig bestrålning. För att samla vetenskapliga bevis på TC-PTT-baserade behandlingar strävar vi därför efter att klargöra de temperaturberoende RPE-cellbiologiska svaren och deras mekanismer med hjälp av in vitro experimentella inställningar. För tHans syfte är det nödvändigt att upprätta en celluppvärmningsinstallation som uppfyller följande villkor: 1) möjligheten för snabb temperaturökning ökar, 2) en exakt kontrollerad tid och temperatur och 3) ett relativt högt antal undersökta celler för biologiska experiment . Beträffande uppvärmningsmetoden är en klinisk laser, såsom en frekvensdubblad Nd.YAG-laser (532 nm), tyvärr olämplig för cellodling. Detta beror på det starkt reducerade antalet melanosomer i odlade RPE-celler. Laserljusabsorptionen kan vara inhomogen, och temperaturökningen på cellulär nivå varierar mellan experiment, även vid bestrålning med samma strålningseffekt. Flera tidigare studier har rapporterat användningen av svart papper under diskbotten under bestrålning 4 eller användningen av ytterligare melanosomer som fagocytiseras av odlingscellerna före experimenten 5 , 6 . Många avDe in vitro biologiska studierna för att bedöma hypertermiinducerad cellrespons har utförts med användning av en hetplatta, ett vattenbad eller en CO2-inkubator med en temperaturinställning 7 . Dessa metoder kräver en lång uppvärmningsperiod, eftersom det tar lite tid ( dvs flera minuter) för att nå önskad temperatur. Vidare är det svårt att erhålla en detaljerad termisk historia ( dvs temperatur multiplicerad med tiden) på cellulär nivå med hjälp av dessa metoder. Vidare kan temperaturen mellan cellerna vid olika positioner i en odlingsskål variera beroende på diffusion av variabel temperatur. I de flesta fall har denna tidsmässiga och rumsliga temperaturinformation under hypertermi inte beaktats för biologiska analyser, även om biologiskt cellsvar kan påverkas kritiskt av temperaturen och tiden för den ökade temperaturen. För att övervinna dessa problem, en fortsättningNuös-våg-thuliumlaser användes här för att värma cellerna. Thuliumlaserstrålning (A = 1,94 μm) absorberas starkt av vatten 8 och cellerna i botten av odlingsskålen stimuleras termiskt endast genom termisk diffusion. Laserfibern med en diameter på 365 μm är satt ca 12 cm över odlingsskålen utan någon optik däremellan. Laserstråldiametern avviker så att den nästan motsvarar den inre diameteren av odlingsskålen (30 mm) vid odlingsmediets yta. Med en konsekvent mängd odlingsmedium är det möjligt att bestråla cellerna med temperaturökning Av hög repeterbarhet. Variabla effektinställningar möjliggör bestrålning med upp till 20 W och medeltemperaturen på mobilnivån kan ökas upp till ΔT ≈ 26 ° C på 10 s. Genom att ändra bestrålningsförhållandena är det också möjligt att byta laserstråleprofil för att variera temperaturdistributionenPå i en kulturrätt. Det är till exempel möjligt att undersöka med en Gauss-liknande temperaturfördelning, som i den aktuella studien, eller med en homogen temperaturfördelning. Det senare kan vara fördelaktigt för att undersöka effekterna av temperaturberoende cellreaktioner mer specifikt för sub-dödlig temperaturökning, men inte för celldödspänning eller sårläkningssvar. Sammantaget kan thuliumlaserbestrålning möjliggöra undersökning av olika typer av biologiska faktorer, såsom gen / proteinuttryck, celldödskinetik, cellproliferation och utveckling av cellfunktionalitet efter olika termiska exponeringar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796-500ML</td>
			<td>Add (2)-(4) before use. Warm in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100&#215;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955-100ML</td>
			<td>Containing 10000 units penicillin, 10 mg streptomycin and 25 &#956;g Amphotericin B in 1ml. Add 5.5 ml in 500 ml medium bottle (1) before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636-100ML</td>
			<td>Add 5.5 ml in 500 ml medium bottle (1) before use (final concentration: 1 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12736C-500ML</td>
			<td>Add 50 ml in 500 ml medium bottole (1) before use (final: 10%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from porcine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4799-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ED-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human VEGF Quantikine ELISA Kit</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>DVE00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxiselect Total Glutathione Assay Kit</td>
			<td>Cell Biolabs, Inc</td>
			<td>STA-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apoptotic/Necrotic/Healthy Cells Detection Kit</td>
			<td>PromoKine</td>
			<td>PK-CA707-30018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thulium laser</td>
			<td>Starmedtec GmbH</td>
			<td>Prototype</td>
			<td>0-20 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>365 mm core diameter fiber</td>
			<td>LASER COMPONENTS Germany</td>
			<td>CF01493-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocouple</td>
			<td>Omega Engineering Inc</td>
			<td>HYP-0- 33-1-T-G-60-SMPW-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate</td>
			<td>MEDAX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (spectrofluorometer)</td>
			<td>Molecular Device</td>
			<td>Spectramax M4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell homogenizer</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>TissueLyser LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mathematical software program</td>
			<td>The Mathworks. Inc</td>
			<td>MATLAB Release 2015b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>system-design platform</td>
			<td>National Instrument</td>
			<td>Labview</td>
			<td>Laboratory Virtual Instrument Engineering Workbench</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

continuous-wave thulium laser for heating cultured cells to investigate cellular thermal effects

En ursprunglig metod för att värma odlade celler med användning av en 1,94 μm kontinuerlig våg thuliumlaser för biologisk bedömning införs här. Thuliumlaserstrålningen absorberas kraftigt av vatten, och cellerna i botten av odlingsskålen upphettas genom termisk diffusion. En laserfiber med en diameter av 365 μm sätts ca 12 cm över odlingsskålen utan någon optik, så att laserstrålediametern är nästan ekvivalent med odlingsskålens (30 mm) innerdiameter. Genom att hålla en konsekvent mängd odlingsmedium i varje experiment är det möjligt att bestråla cellerna med en höggradigt reproducerbar temperaturökning. För att kalibrera temperaturökningen och dess fördelning i en cellkulturskål för varje effektinställning uppmättes temperaturen under 10 s av bestrålning vid olika positioner och på cellulär nivå. Temperaturfördelningen representerades med användning av en matematisk grafikprogramvaraProgram, och dess mönster över kulturrätten var i Gaussisk form. Efter laserbestrålning kunde olika biologiska experiment utföras för att utvärdera temperaturberoende cellresponser. I detta manuskript introduceras livskraftbar färgning ( dvs. att skilja levande, apoptotiska och döda celler) för att bestämma tröskelvärdena för cellapoptos och död efter olika tidpunkter. Fördelarna med denna metod är precisionen av temperaturen och upphettningstiden, liksom dess höga effektivitet i uppvärmningsceller i en hel cellodlingsskål. Dessutom tillåter det studier med en mängd olika temperaturer och tidsperioder, vilket kan styras av ett datoriserat operativsystem.

Temperaturfördelning efter olika ströminställningar Alla temperaturutvecklingar för varje enskild bestrålning övervakades vid temperaturkalibrering. Från denna data erhölls maximal temperatur vid den uppmätta punkten och definierad som T max (° C). Som visas i figur 3A exekverades programmet vid tidpunkten när odlingsskålen placerades på värmeplattan. Efter 140 s &quot;förup...

Watch this Scientific Journal Video about Continuous-wave Thulium Laser for Heating Cultured Cells to Investigate Cellular Thermal Effects at JoVE.com

Continuous-wave Thulium Laser for Heating Cultured Cells to Investigate Cellular Thermal Effects

En original experimentell inställning för uppvärmning av celler i en kulturrätt med användning av 1,94 μm kontinuerligvåglasstrålning introduceras här. Med hjälp av denna metod kan de biologiska svaren hos retinala pigmentepiteliala (RPE) celler efter olika termiska exponeringar undersökas.

Kontinuerlig våg-thuliumlaser för uppvärmning av odlade celler för att undersöka cellulära termiska effekter

An original method to heat cultured cells using a 1.94 &#181;m continuous-wave thulium laser for biological assessment is introduced here. Thulium laser ...

Research

JoVE Journal

Biology

Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels

Studera effekter av Matrix Stelhet på cellulär funktion med Akrylamid-baserade Hydrogeler

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

Adenovirus-medierad genetisk Borttagning av signalmolekyler i odlade primära musknappen Embryonala fibroblasts

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Skapa Definierade Gasformiga miljöer för att studera effekterna av Hypoxi på<em&gt; C. elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Kromosom Förberedelser från odlade celler

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

siRNA Screening för att identifiera Ubiquitin och Ubiquitin-liknande system Regulatorer av biologiska banor i odlade däggdjursceller

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

Massively Parallel Reporter Analyser hos odlade däggdjursceller

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Kvantifiering av endotelceller Vidhäftnings<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nefrotoxin mikroinjektion i Zebrafish till Model akut njursvikt

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Använda mikroflödessystem enheter för att mäta livslängd och Cellular fenotyper i Single Budding jästceller

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

En grafisk användargränssnitt för programvaruassisterad spårning av proteinkoncentration i dynamiska cellulära protrusioner

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...