Name: fabrication of inverted colloidal crystal poly(ethylene glycol) scaffold: a three-dimensional cell culture platform for liver tissue engineering
Uploaded: 2016-08-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Polyethylene glycol Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier le soutien d&#39;une recherche nationale Foundation Fellowship (NRF -NRFF2011-01) et le Programme de recherche concurrentiel (NRF-CRP10-2012-07).

1. ICC Échafaudages Fabrication (Figure 1) <ol><li> Préparer le polystyrène (PS) lattices (diamètre = 6 mm; 8-13 couches de perles). <ol><li> Pour préparer le moule, couper les pointes hors de 0,2 ml microtubes bouillir à l&#39;épreuve au niveau de 40 pi. Adhérer au sommet des coupe-tubes à 24 x 60 mm 2 microscope glisse en verre de couverture avec de la colle imperméable à l&#39; eau. </li><li> Mettez les sphères PS (diamètre = 140 um) contenues dans une suspension de l&#39;eau dans un flacon ...

Échafauds d&#39;ingénierie tissulaire évoluent rapidement pour fournir tous les indices physiques et biochimiques nécessaires pour régénérer, maintenir ou réparer les tissus pour l&#39;application de remplacement d&#39;organes, d&#39; étudier la maladie, le développement de médicaments, et beaucoup d&#39; autres 57. Dans le foie ingénierie tissulaire, les hépatocytes humains primaires perdent rapidement leurs fonctions métaboliques, une fois isolés du corps, créant ainsi un grand besoin d&#39;...

Le foie est un organe hautement vascularisé avec une multitude de fonctions, y compris la désintoxication du sang, le métabolisme des xénobiotiques et la production de protéines sériques. Le tissu hépatique a trois dimensions (3D), la microstructure complexe, comprenant plusieurs types cellulaires, les canalicules biliaires, sinusoïdes, et des zones de composition différente biomatrice et différentes concentrations en oxygène. Compte tenu de cette structure complexe, il a été difficile de créer un modèle correct du foie in vitro 1. Cependant, il y a une demande croissante de fonctionnement des modèles in vitro d&#39; hébergement hépatocytes humains comme plates - formes pour les tests de toxicité médicamenteuse 2 et l&#39; étude des maladies associées au foie 3. Plates - formes d&#39;ingénierie tissulaire du foie actuel ont simplifié la complexité du foie en isolant l&#39; une, ou en se concentrant sur ​​un petit nombre, des paramètres du foie, à savoir la co-culture de cellules 4, la composition biochimique du zonal microenvironnements 5, la dynamique d&#39;écoulement 6,7 et la configuration de la biomatrice 8. La configuration de la biomatrice peut être décomposée en des paramètres tels que les matériaux d&#39;échafaudage, la composition de la matrice extracellulaire (ECM), la raideur des protéines de la matrice, ainsi que la conception et la structure de l&#39;échafaudage. Il y a eu une augmentation dans les études d&#39;ingénierie tissulaire en utilisant des hydrogels synthétiques, en particulier le poly (éthylène glycol) (PEG) hydrogels 9, compte tenu de la capacité d&#39;accorder des propriétés, la bioactivité et de vitesse de dégradation mécanique de l&#39;hydrogel. En ce qui concerne la recherche liée au foie, l&#39;hydrogel biocompatible a été appliquée pour l&#39; étude de l&#39; infection par le virus de la maladie du foie 3. En tant que plate - forme de conception de hépatocytes, de nombreuses études ont utilisé hépatocytes cultures sandwich 10,11 et l&#39; encapsulation des cellules dans un hydrogel 12,13 pour fournir l&#39;environnement 3D et cellule-ECM et l&#39; interaction cellule-cellule qui sont essentiels pour imiter en microenvironnement vivo. However, ces plates - formes ne possèdent pas un degré élevé de contrôle et de l&#39; organisation spatiale, conduisant à des propriétés non uniformes à travers l&#39;échafaudage 14. Le colloïdal de cristal inversée (ICC) 14 échafaudage est un échafaudage 3D hautement organisée pour la culture cellulaire qui a été introduit dans les années 2000. La structure unique de L&#39;échafaudage peut être attribué au procédé de fabrication simple à l&#39;aide d&#39;un cristal colloïdal, un réseau ordonné de particules colloïdales de diamètre variable. En bref, pour résumer le processus, les particules sont bien rangés et recuites utilisant la chaleur pour former un réseau. La lixiviation de ce réseau, par un solvant organique, on obtient un hydrogel polymérisé dans des cavités sphériques hexagones emballés 15 avec une surface spécifique élevée. Cet échafaudage hautement ordonnée a été préalablement réalisé avec les deux matériaux synthétiques et naturels, y compris , mais sans s&#39;y limiter , le poly (acrylamide) 16-21, le poly (lactique-co-acide glycolique) 15,22-30, Le poly (éthylène glycol) 31,32, le poly (2-hydroxyéthylméthacrylate) 21,33-35, 36-39 et le chitosan. CPI échafauds constituées de matériaux non-salissures ont tendance à favoriser sphéroïdes cellulaires dans les cavités 14,23,40. Plusieurs types de cellules ont été représentés avec succès à proliférer, se différencier et de fonction dans cette configuration, y compris les 41 chondrocytes, les cellules stromales de la moelle osseuse 42, et les cellules souches 43,44. En ce qui concerne les hépatocytes, des études ont été menées avec des échafaudages de la CPI en Na 2 SiO 3 et de poly (acrylamide), mais pas de PEG. Avec des stratégies simples de bioconjugaison (c. -à- couplage amine par EDC / NHS), échafauds à base de PEG ECM protéines conjuguées peuvent être fabriquées, qui peuvent se révéler des sites de liaison plus de cellules pour être un plus in vivo comme l&#39; environnement et d&#39; améliorer la fonction hépatique. Dans ce manuscrit et la vidéo associée, nous détaillons la fabrication de l&#39;échafaudage de la CPIen utilisant le poly (éthylène glycol) diacrylate (PEGDA) et un réseau d&#39;hydrogel de polystyrène microsphère, optimisé pour une hépatocarcinome (Huh-7.5) la culture. Nous démontrons les différences entre les nues échafauds ICC PEGDA généralement non collantes et le PEGDA ICC échafaudage de collagène revêtu en termes d&#39;échafaudage topologie et la performance des cellules. La viabilité cellulaire et la fonction sont mesurés qualitativement et quantitativement pour évaluer Huh-7,5 comportement cellulaire.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tube</td>
			<td>Axygen Scientific</td>
			<td>PCR-02D-C</td>
			<td>Boil-proof</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gorilla Glue</td>
			<td>Gorilla Glue, Inc.</td>
			<td>Depends on vendor. This was purchased from a local store.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160;631-1575</td>
			<td>Dimensions: 24&#215;60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene spheres&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>TSS#4314A</td>
			<td>Diameter = 140 um; 3x10^4 particles per milliliter and 1.4% size distribution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.00983.1011</td>
			<td>absolute for analysis EMSURE; Dilute to 70% with Milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Bath</td>
			<td>Elma</td>
			<td>S10H</td>
			<td>Equiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Furnace</td>
			<td>Nabertherm</td>
			<td>N7/H</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L pipette tip</td>
			<td>Axygen Scientific</td>
			<td>T-210-Y-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol (PEG)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09727.0100</td>
			<td>Mw= 4kDa; acrylation of PEG monomers and purification of the resulting precipitate produces a PEGDA macromer with Mw = 4.6kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>392932</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylate-Poly (Ethylene Glycol) - Succinimidyl Valerate&#160;</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>ACRL-PEG-SVA-3400-1g</td>
			<td>Mw = 3.4 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-hydroxy-4&#39;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>410896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58816-123</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5404 000.413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Film&#160;</td>
			<td>Parafilm M&#160;</td>
			<td>#PM996</td>
			<td>Kept at 9&#34; with allows intensity of 10.84 mW/cm^2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluewave 200 UV spotlight</td>
			<td>Blaze Technology&#160;</td>
			<td>120008, 122300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran (THF)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>543-123120-00-5</td>
			<td>From rat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3867-1VL</td>
			<td>1X, w/o CaCl &#38; MgCl; Ph = 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012-027</td>
			<td>16% W/V AQ. 10x10ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>VWR</td>
			<td>43368.9M</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezone 4.5 freeze drier</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7750020</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputter coater</td>
			<td>Jeol Ltd.</td>
			<td>JFC-1600</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscope</td>
			<td>Jeol Ltd.</td>
			<td>JSM 5310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse primary antibodies against Collagen type I</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse secondary antibody conjugated with Alexa Fluor 488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate, Tissue Culture 24 Well, Flat Bottom (Nunclon)&#160;</td>
			<td>Bio-Rev PTE LTD</td>
			<td>3820-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium(DMEM) 
			2.5 g/L Glucose w/ L-Gln</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A15-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (P/S)</td>
			<td>Life Tchnologies</td>
			<td>15140-122 E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC49&#8208;Huh &#8208;7.5 Cell Line</td>
			<td>Apath</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Corning non-treated culture dishes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS430591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>Equipment; 37&#176;C, 5% Humidity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma Steri-Cycle CO2 Incubators</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>02-671-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit &#39;for mammalian cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L3224&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK-8 Assay</td>
			<td>Dojindo Laboratories</td>
			<td>CK04-11</td>
			<td>Monosodium-salt reagent (MSR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite 200 PRO microplate reader&#160;</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Human ELISA kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab108788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#1610407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse primary antibodies (against CYP3A4, albumin)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-53850; sc-271605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 labelled Phalloidin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A34055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15596-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22706.326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67-63-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPEC water</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>AM9916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000c Spectrophotometer</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix&#160;</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1708840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR select Master Mix for CFX</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>4472937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers (to be chosen)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Real-Time System, C-1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio Rad Laboratories</td>
			<td>SOFT-CFX-31-PATCH&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of inverted colloidal crystal poly(ethylene glycol) scaffold: a three-dimensional cell culture platform for liver tissue engineering

La possibilité de maintenir la fonction des hépatocytes in vitro, dans le but de tester la cytotoxicité des xénobiotiques, l&#39; étude de l&#39; infection virale et le développement de médicaments ciblant le foie, nécessite une plate - forme dans laquelle les cellules reçoivent des signaux biochimiques et mécaniques appropriées. systèmes d&#39;ingénierie tissulaire du foie récents ont utilisé trois dimensions (3D) échafauds composés de hydrogels synthétiques ou naturelles, compte tenu de leur rétention d&#39;eau élevée et leur capacité à fournir les stimuli mécaniques nécessaires par les cellules. Il y a eu un intérêt croissant dans le cristal colloïdal (CPI) échafaudage inversé, un développement récent, qui permet à l&#39;organisation spatiale élevée, homotypique et l&#39;interaction des cellules hétérotypique, ainsi que la matrice (ECM) interaction cellulaire extracellulaire. Nous décrivons ici un protocole pour la fabrication de l&#39;échafaudage ICC à l&#39;aide de poly (éthylène glycol) diacrylate (PEGDA), et le procédé de lixiviation des particules. En bref, un treillis est composé de particules microsphériques, après quoi un pré-polymela solution r est ajoutée proprement polymérisé et les particules sont ensuite éliminés, ou lessivés, à l&#39; aide d&#39; un solvant organique (par exemple le tétrahydrofuranne). La dissolution des résultats du réseau dans un échafaudage très poreuse avec des tailles et des interconnectivités qui permettent aux médias d&#39;atteindre plus facilement les cellules interstitielles contrôlées. Cette structure unique permet une grande surface spécifique pour les cellules à adhérer à ainsi que la communication facile entre les pores, et la capacité de revêtir la CPI échafaudage PEGDA avec des protéines montre également un effet marqué sur la performance des cellules. Nous analysons la morphologie de l&#39;échafaudage ainsi que la cellule d&#39;hépatocarcinome (Huh-7.5) le comportement en termes de viabilité et de la fonction pour explorer l&#39;effet de la structure de la CPI et les revêtements ECM. Dans l&#39;ensemble, ce document fournit un protocole détaillé d&#39;un échafaudage émergent qui a de larges applications dans l&#39;ingénierie tissulaire, en particulier le foie ingénierie tissulaire.

Les résultats représentatifs pour la caractérisation structurale de l&#39;échafaudage de la CPI et la comparaison de l&#39;efficacité de chaque CPI échafaudage condition dans la culture des hépatocytes sont présentés et expliqués ci-dessous. Les conditions CPI d&#39;échafaudage utilisés dans ces résultats sont enduits de collagène de 0 pg / ml (nu), 20 pg / ml (collagène 20), 200 ug / ml (collagène 200), et 400 ug / ml (collagène 400) et le premier huh-7,5 cellulaire nom...

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Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Polyethylene glycol Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

This manuscript presents a detailed protocol for the fabrication of an emerging three-dimensional hepatocyte culture platform, the inverted colloidal crystal scaffold, and the concomitant techniques to assess hepatocyte behavior. The size-controllable pores, interconnectivity and ability to conjugate extracellular matrix proteins to the poly(ethylene glycol) (PEG) scaffold enhance Huh-7.5 cell performance.

Fabrication de Inverted colloïdal cristal Poly (éthylène glycol) Échafaudages: Une cellule plate-forme en trois dimensions de la culture pour l&#39;ingénierie tissulaire du foie

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

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JoVE Journal

Bioengineering

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