Name: fabrication of inverted colloidal crystal poly(ethylene glycol) scaffold: a three-dimensional cell culture platform for liver tissue engineering
Uploaded: 2016-08-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Polyethylene glycol Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering at JoVE.com

Författarna vill erkänna stöd från en National Research Foundation Fellowship (NRF -NRFF2011-01) och konkurrenskraftig forskning (NRF-CRP10-2012-07).

1. ICC Scaffold Fabrication (figur 1) <ol><li> Förbered polystyren (PS) gitter (diameter = 6 mm, 8-13 lager av pärlor). <ol><li> För att förbereda formen, klippa tips bort från 0,2 ml koka säkra mikrocentrifugrör på 40 pl nivå. Vidhäfta toppen av cut-rören till 24 x 60 mm 2 mikroskop täckglas halk med vattentätt lim. </li><li> Sätt PS sfärer (diameter = 140 pm) som finns i en vattensuspension i en 20 ml flaska, försiktigt pipett ur vattnet fjädring, och tillsätt 18 ml av 70% etanollösning...

Vävnadstekniska byggnadsställningar utvecklas snabbt för att ge alla de fysiska och biokemiska signaler som är nödvändiga för att regenerera, underhålla eller reparera vävnad för tillämpningen av ersättnings organ, studera sjukdomar, utveckling av läkemedel och många andra 57. I levervävnadsteknik, primära humana hepatocyter förlorar snabbt deras metaboliska funktioner när isolerade från kroppen, vilket skapar ett stort behov av tekniska ställningar och utveckla plattformar för att upprä...

Levern är ett mycket vaskulariserad organ med en mängd funktioner, inklusive avgiftning av blodet, metabolism av xenobiotika, och produktionen av serumproteiner. Levervävnad har en komplex tredimensionell (3D) mikrostruktur, bestående av flera celltyper, gallcanaliculi, sinuskurvor, och zoner med olika biomatris sammansättning och olika syrekoncentrationer. Med tanke på detta noggrant struktur, har det varit svårt att skapa en ordentlig levermodell in vitro en. Det finns dock en ökande efterfrågan på funktionella in vitro-modeller värd humana hepatocyter som plattformar för att testa läkemedelstoxicitet 2 och studera sjukdomar associerade med levern 3. Aktuell levervävnadstekniska plattformar har förenklat komplexiteten av levern genom att isolera en eller fokusera på ett fåtal av leverns parametrar, nämligen co-odling av celler 4, biokemisk sammansättning zonal mikromiljöer 5, flödesdynamik 6,7 och konfigurationen av biomatris 8. Konfiguration av biomatris kan delas in parametrar såsom ställningsmaterial, sammansättningen av extracellulär matris (ECM) -proteiner, matris styvhet samt utformningen och konstruktionen av byggnadsställningen. Det har skett en ökning i vävnadsingenjörsstudier med syntetiska hydrogeler, särskilt poly (etylenglykol) (PEG) hydrogeler 9, ges möjlighet att ställa hydrogelen mekaniska egenskaper, bioaktivitet och nedbrytning takt. När det gäller leverrelaterad forskning, var det biokompatibla hydrogelen ansökt om virusinfektion studie av leversjukdom 3. Som en hepatocyte plattform konstruktion, har många studier utnyttjade levercell sandwich kulturer 10,11 och cell inkapsling i en hydrogel 12,13 för att ge 3D-miljö och cell ECM och interaktion cell-cell som är nödvändiga för att efterlikna in vivo mikromiljö. However, dessa plattformar inte har en hög grad av kontroll och fysisk planering, vilket leder till icke-likformiga egenskaper genom ställningen 14. Den inverterade kristall kolloidalt (ICC) 14 Ställningen är en mycket organiserad 3D byggnadsställning för cellodling som först introducerades i början av 2000-talet. Ställningen unika struktur kan hänföras till den enkla tillverkningsprocessen med användning av en kolloidal kristall, en ordnad gitter av kolloidala partiklar av varierande diameter. I korthet, för att sammanfatta processen partiklar är prydligt ordnade och glödgade hjälp av värme för att bilda ett galler. Urlakningen av detta gitter, genom ett organiskt lösningsmedel, i en polymeriserad hydrogel resulterar i hexagonalt packade sfäriska kaviteter 15 med hög ytarea. Denna höggradigt ordnad scaffold tidigare har gjorts med både syntetiska och naturliga material, inklusive men inte begränsat till poly (akrylamid) från 16 till 21, poly (mjölksyra-sam-glykolsyra) 15,22-30, Poly (etylenglykol) 31,32, poly (2-hydroxietylmetakrylat) 21,33-35, och kitosan 36-39. ICC byggnadsställningar tillverkade av icke-fouling material tenderar att främja cellulära sfäroider inuti håligheterna 14,23,40. Flera celltyper har visat sig framgångsrikt proliferera, differentiera och fungera inom denna konfiguration, inklusive kondrocyter 41, benmärgsstromaceller 42, och stamceller 43,44. Beträffande hepatocyt, har studier utförts med ICC ställningar gjorda av Na 2SiO 3 och poly (akrylamid), men inte PEG. Med enkla biokonjugering strategier (dvs aminkoppling via EDC / NHS), kan ECM-proteiner-konjugerade PEG-baserade stödstrukturer tillverkas, som kan visa sig vara mer cellbindningsställen för att vara en mer in vivo liknande miljö och förbättra leverfunktion. I detta manuskript och tillhörande video, är vi i detalj tillverkningen av ICC ställningenmed användning av poly (etylenglykol) diakrylat (PEGDA) hydrogel och en polystyren mikrosfärer galler, optimerad för hepatokarcinom (Va-7,5) kultur. Vi visar skillnaderna mellan de i allmänhet icke-adhesiva nakna PEGDA ICC byggnadsställningar och det kollagenbelagda PEGDA ICC scaffold i form av byggnadsställning topologi och cellprestanda. Cellviabilitet och funktion mäts kvalitativt och kvantitativt bedöma Huh-7,5 cellens beteende.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tube</td>
			<td>Axygen Scientific</td>
			<td>PCR-02D-C</td>
			<td>Boil-proof</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gorilla Glue</td>
			<td>Gorilla Glue, Inc.</td>
			<td>Depends on vendor. This was purchased from a local store.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160;631-1575</td>
			<td>Dimensions: 24&#215;60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene spheres&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>TSS#4314A</td>
			<td>Diameter = 140 um; 3x10^4 particles per milliliter and 1.4% size distribution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.00983.1011</td>
			<td>absolute for analysis EMSURE; Dilute to 70% with Milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Bath</td>
			<td>Elma</td>
			<td>S10H</td>
			<td>Equiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Furnace</td>
			<td>Nabertherm</td>
			<td>N7/H</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L pipette tip</td>
			<td>Axygen Scientific</td>
			<td>T-210-Y-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol (PEG)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09727.0100</td>
			<td>Mw= 4kDa; acrylation of PEG monomers and purification of the resulting precipitate produces a PEGDA macromer with Mw = 4.6kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>392932</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylate-Poly (Ethylene Glycol) - Succinimidyl Valerate&#160;</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>ACRL-PEG-SVA-3400-1g</td>
			<td>Mw = 3.4 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-hydroxy-4&#39;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>410896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58816-123</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5404 000.413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Film&#160;</td>
			<td>Parafilm M&#160;</td>
			<td>#PM996</td>
			<td>Kept at 9&#34; with allows intensity of 10.84 mW/cm^2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluewave 200 UV spotlight</td>
			<td>Blaze Technology&#160;</td>
			<td>120008, 122300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran (THF)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>543-123120-00-5</td>
			<td>From rat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3867-1VL</td>
			<td>1X, w/o CaCl &#38; MgCl; Ph = 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012-027</td>
			<td>16% W/V AQ. 10x10ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>VWR</td>
			<td>43368.9M</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezone 4.5 freeze drier</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7750020</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputter coater</td>
			<td>Jeol Ltd.</td>
			<td>JFC-1600</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscope</td>
			<td>Jeol Ltd.</td>
			<td>JSM 5310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse primary antibodies against Collagen type I</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse secondary antibody conjugated with Alexa Fluor 488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate, Tissue Culture 24 Well, Flat Bottom (Nunclon)&#160;</td>
			<td>Bio-Rev PTE LTD</td>
			<td>3820-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium(DMEM) 
			2.5 g/L Glucose w/ L-Gln</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A15-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (P/S)</td>
			<td>Life Tchnologies</td>
			<td>15140-122 E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC49&#8208;Huh &#8208;7.5 Cell Line</td>
			<td>Apath</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Corning non-treated culture dishes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS430591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>Equipment; 37&#176;C, 5% Humidity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma Steri-Cycle CO2 Incubators</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>02-671-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit &#39;for mammalian cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L3224&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK-8 Assay</td>
			<td>Dojindo Laboratories</td>
			<td>CK04-11</td>
			<td>Monosodium-salt reagent (MSR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite 200 PRO microplate reader&#160;</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Human ELISA kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab108788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#1610407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse primary antibodies (against CYP3A4, albumin)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-53850; sc-271605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 labelled Phalloidin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A34055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15596-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22706.326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67-63-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPEC water</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>AM9916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000c Spectrophotometer</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript Reverse Transcription Supermix&#160;</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1708840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR select Master Mix for CFX</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>4472937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers (to be chosen)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Real-Time System, C-1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio Rad Laboratories</td>
			<td>SOFT-CFX-31-PATCH&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of inverted colloidal crystal poly(ethylene glycol) scaffold: a three-dimensional cell culture platform for liver tissue engineering

Förmågan att upprätthålla hepatocyte funktion in vitro, i syfte att testa xenobiotika &quot;cytotoxicitet, studera virusinfektion och utveckla läkemedel som riktar sig till levern, kräver en plattform där celler får rätt biokemiska och mekaniska signaler. Senaste levervävnad tekniska system har använt tredimensionella (3D) ställningar bestående av syntetiska eller naturliga hydrogeler, med tanke på deras höga vattenbindande och deras förmåga att ge de mekaniska stimuli som behövs av cellerna. Det har funnits ett växande intresse för den inverterade kolloidalt kristallen (ICC) byggnadsställning, en ny utveckling, vilket möjliggör hög rumslig organisation, homotypisk och hetero cell interaktion, liksom cell extracellulärt matrix (ECM) interaktion. Häri beskriver vi ett protokoll för att tillverka ICC ställningen med användning av poly (etylenglykol) diakrylat (PEGDA) och urlakningspartikelmetoden. Kortfattat är ett gitter tillverkat av mikrosfärpartiklar, varefter en i förväg polymer lösning tillsättes, korrekt polymeriseras, och partiklarna avlägsnas därefter, eller urlakas, med användning av ett organiskt lösningsmedel (t.ex. tetrahydrofuran). Upplösningen av gitterresulterar i en mycket porös scaffold med kontrollerade porstorlekar och interconnectivities som tillåter medier för att nå cellerna lättare. Denna unika struktur tillåter en hög ytarea för cellerna att vidhäfta till samt enkel kommunikation mellan porerna, och möjligheten att belägga PEGDA ICC scaffold med proteiner visar också en markant effekt på cellprestanda. Vi analyserar morfologi ställningen samt hepatokarcinom cellen (Va-7,5) beteende när det gäller lönsamhet och funktion för att undersöka effekten av ICC struktur och ECM beläggningar. Sammantaget ger detta papper ett detaljerat protokoll av en framväxande byggnadsställning som har breda tillämpningar inom tissue engineering, särskilt levervävnadsteknik.

De representativa resultat för strukturbestämning av ICC ställningen och jämförelse av varje ICC ställnings tillstånd effektivitet i odling hepatocyter visas och förklaras nedan. ICC ställnings betingelser som användes i dessa resultat är kollagen beläggningar av 0 | ig / ml (Bare), 20 | ig / ml (Kollagen 20), 200 | ig / ml (Kollagen 200), och 400 | ig / ml (Kollagen 400) och den initiala va-7,5 cell sådd antal är 1x10 6. <p class="jove_content" fo:keep-toget...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Polyethylene glycol Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering at JoVE.com

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Polyethylene glycol Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

This manuscript presents a detailed protocol for the fabrication of an emerging three-dimensional hepatocyte culture platform, the inverted colloidal crystal scaffold, and the concomitant techniques to assess hepatocyte behavior. The size-controllable pores, interconnectivity and ability to conjugate extracellular matrix proteins to the poly(ethylene glycol) (PEG) scaffold enhance Huh-7.5 cell performance.

Tillverkning av Inverted kolloidalt Crystal Poly (etylenglykol) Scaffold: En tredimensionell cellkultur plattform för levervävnad Engineering

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

Tredimensionell cellkulturmodell för mätning av effekterna av interstitialvätska Flow på Tumörcellinvasion

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Tissue Engineering: Konstruktion av en flercellig 3D Scaffold för Leverans av Layered Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Human Brosk Tissue Fabrication Använda Tredimensionell Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Generering av ett tredimensionellt Full Tjocklek hudekvivalent och automatiserade sårar

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Fabrication of a Bioactive, PCL-based "Self-fitting" Shape Memory Polymer Scaffold

Tillverkning av ett bioaktivt, PCL-baserade &quot;Självpassande&quot; formminne polymerskelettet

Tissue engineering has been explored as an alternative strategy for the treatment of critical-sized cranio-maxillofacial (CMF) bone defects. Essential to ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

En mikroflödessystem plattform för hög genomströmning Single-cell isolering och kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Smälta Electrospinning handstil av tredimensionella Poly(ε-caprolactone) ställningar med kontrollerbar morfologier för Tissue Engineering program

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Odling däggdjursceller i tredimensionella peptid ställningar

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

En netto mögel-baserade metod byggnadsställning-fri tredimensionella hjärtvävnad skapelsens

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

Lab-på-en-CD plattform för att generera Multicellulära tredimensionell spheroids

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...