Name: comparison of tobacco host cell protein removal methods by blanching intact plants or by heat treatment of extracts
Uploaded: 2016-08-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comparison of Tobacco Host Cell Protein Removal Methods by Blanching Intact Plants or by Heat Treatment of Extracts at JoVE.com

We would like to acknowledge Dr. Thomas Rademacher, Alexander Boes and Veronique Bei&#223; for providing the transgenic tobacco seeds, and Ibrahim Al Amedi for cultivating the tobacco plants. The authors wish to thank Dr. Richard M. Twyman for editorial assistance as well as G&#252;ven Edg&#252; for providing the MSP1-19 reference. This work was funded in part by the European Research Council Advanced Grant ''Future-Pharma'', proposal number 269110, the Fraunhofer-Zukunftsstiftung (Fraunhofer Future Foundation) and Fraunhofer-Gesellschaft Internal Programs under Grant No. Attract 125-600164.

1. ולטפח את צמחי הטבק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוקן כל בלוק צמר סלעים עם 1 עד 2 ליטר מים ללא יונים, ובהמשך עם 1 ליטר של 0.1% [w / v] פתרון דשן. מניחים זרע טבק אחד בכל גוש צמר סלעים ולשטוף בעדינות עם 0.25 ליטר של תמיסת הדישון ללא שטיפת זרע 16. </li><li style=";te...

<ol>
	<li>PhRMA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 2013 Report: Medicines in Development - Biologics. , (2013).</li><li>Buyel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+development+strategies+in+plant+molecular+farming.">Process development strategies in plant molecular farming.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 16, 966-982 (2015).</li><li>Stoger, E., Fischer, R., Moloney, M., Ma, J. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+molecular+pharming+for+the+treatment+of+chronic+and+infectious+diseases.">Plant molecular pharming for the treatment of chronic and infectious diseases.</a> Annu. Rev. Plant Biol. 65, 743-768 (2014).</li><li>Melnik, S., Stoger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+factories+for+biopharmaceuticals.">Green factories for biopharmaceuticals.</a> Curr. Med. Chem. 20, 1038-1046 (2013).</li><li>Buyel, J. F., Twyman, R. M., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+downstream+processing+of+plant-derived+recombinant+proteins.">Extraction and downstream processing of plant-derived recombinant proteins.</a> Biotechnol. Adv. 33, 902-913 (2015).</li><li>Wilken, L. R., Nikolov, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+and+purification+of+plant-made+recombinant+proteins.">Recovery and purification of plant-made recombinant proteins.</a> Biotechnol. Adv. 30, 419-433 (2012).</li><li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale-down+models+to+optimize+a+filter+train+for+the+downstream+purification+of+recombinant+pharmaceutical+proteins+produced+in+tobacco+leaves.">Scale-down models to optimize a filter train for the downstream purification of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco leaves.</a> Biotechnol. J. 9, 415-425 (2014).</li><li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flocculation+increases+the+efficacy+of+depth+filtration+during+the+downstream+processing+of+recombinant+pharmaceutical+proteins+produced+in+tobacco.">Flocculation increases the efficacy of depth filtration during the downstream processing of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco.</a> Plant Biotechnol. J. 12, 240-252 (2014).</li><li>Buyel, J. F., Opdensteinen, P., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose-based+filter+aids+increase+the+capacity+of+depth+filters+during+the+downstream+processing+of+plant-derived+biopharmaceutical+proteins.">Cellulose-based filter aids increase the capacity of depth filters during the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins.</a> Biotechnol. J. 10, 584-591 (2014).</li><li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generic+chromatography-based+purification+strategies+accelerate+the+development+of+downstream+processes+for+biopharmaceutical+proteins+produced+in+plants.">Generic chromatography-based purification strategies accelerate the development of downstream processes for biopharmaceutical proteins produced in plants.</a> Biotechnol. J. 9, 566-577 (2014).</li><li>Buyel, J. F., Woo, J. A., Cramer, S. M., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+quantitative+structure-activity+relationship+models+to+develop+optimized+processes+for+the+removal+of+tobacco+host+cell+proteins+during+biopharmaceutical+production.">The use of quantitative structure-activity relationship models to develop optimized processes for the removal of tobacco host cell proteins during biopharmaceutical production.</a> J. Chromatogr. A. 1322, 18-28 (2013).</li><li>Holler, C., Vaughan, D., Zhang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethyleneimine+precipitation+versus+anion+exchange+chromatography+in+fractionating+recombinant+beta-glucuronidase+from+transgenic+tobacco+extract.">Polyethyleneimine precipitation versus anion exchange chromatography in fractionating recombinant beta-glucuronidase from transgenic tobacco extract.</a> J. Chromatogr. A. 1142, 98-105 (2007).</li><li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downstream+processing+of+biopharmaceutical+proteins+produced+in+plants:+the+pros+and+cons+of+flocculants.">Downstream processing of biopharmaceutical proteins produced in plants: the pros and cons of flocculants.</a> Bioengineered. 5, 138-142 (2014).</li><li>Hassan, S., van Dolleweerd, C. J., Ioakeimidis, F., Keshavarz-Moore, E., Ma, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+extraction+of+monoclonal+antibodies+targeted+to+different+subcellular+compartments+in+transgenic+tobacco+plants.">Considerations for extraction of monoclonal antibodies targeted to different subcellular compartments in transgenic tobacco plants.</a> Plant Biotechnol. J. 6, 733-748 (2008).</li><li>Arfi, Z. A., Drossard, J., Hellwig, S., Fischer, R., Buyel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyclonal+antibodies+can+effectively+detect+tobacco+host+cell+proteins+after+RuBisCO+depletion+and+endotoxin+removal.">Polyclonal antibodies can effectively detect tobacco host cell proteins after RuBisCO depletion and endotoxin removal.</a> Biotechnol. J. , (2015).</li><li>Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Boes, A., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+a+host+cell+protein+heat+precipitation+step+simplifies+the+subsequent+purification+of+recombinant+proteins+from+tobacco.">Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco.</a> Biochem. Eng. J. 88, 162-170 (2014).</li><li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+juice+extractor+can+simplify+the+downstream+processing+of+plant-derived+biopharmaceutical+proteins+compared+to+blade-based+homogenizers.">A juice extractor can simplify the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins compared to blade-based homogenizers.</a> Process Biochem. 50, 859-866 (2014).</li><li>Beiss, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-precipitation+allows+the+efficient+purification+of+a+functional+plant-derived+malaria+transmission-blocking+vaccine+candidate+fusion+protein.">Heat-precipitation allows the efficient purification of a functional plant-derived malaria transmission-blocking vaccine candidate fusion protein.</a> Biotechnol. Bioeng. 112, 1297-1305 (2015).</li><li>Ma, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+approval+and+a+first-in-human+phase+I+clinical+trial+of+a+monoclonal+antibody+produced+in+transgenic+tobacco+plants.">Regulatory approval and a first-in-human phase I clinical trial of a monoclonal antibody produced in transgenic tobacco plants.</a> Plant Biotechnol. J. 13, 1106-1120 (2015).</li><li>Mahajan, P. V., Caleb, O. J., Singh, Z., Watkins, C. B., Geyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postharvest+treatments+of+fresh+produce.">Postharvest treatments of fresh produce.</a> Philos T R Soc A. 372, (2014).</li><li>Menzel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+blanching+reduces+the+host+cell+protein+content+and+substantially+enhances+the+recovery+and+stability+of+two+plant+derived+malaria+vaccine+candidates.">Optimized blanching reduces the host cell protein content and substantially enhances the recovery and stability of two plant derived malaria vaccine candidates.</a> Front. Plant Sci. , (2015).</li><li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+complex+systems+using+the+design+of+experiments+approach:+transient+protein+expression+in+tobacco+as+a+case+study.">Characterization of complex systems using the design of experiments approach: transient protein expression in tobacco as a case study.</a> J. Vis. Exp. , e51216 (2014).</li><li>Buyel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedure+to+evaluate+the+efficiency+of+flocculants+for+the+removal+of+dispersed+particles+from+plant+extracts.">Procedure to evaluate the efficiency of flocculants for the removal of dispersed particles from plant extracts.</a> J. Vis. Exp. , e53940 (2016).</li><li>Simonian, M. H., Smith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+and+colorimetric+determination+of+protein+concentration.">Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. 76, (2006).</li><li>Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+models+for+the+accumulation+of+a+fluorescent+marker+protein+in+tobacco+leaves+according+to+the+promoter/5'UTR+combination.">Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination.</a> Biotechnol. Bioeng. 110, 471-482 (2013).</li><li>Piliarik, M., Vaisocherova, H., Homola, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+plasmon+resonance+biosensing.">Surface plasmon resonance biosensing.</a> Methods Mol. Biol. 503, 65-88 (2009).</li><li>Kim, T. D., Ryu, H. J., Cho, H. I., Yang, C. H., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+behavior+of+proteins:+Heat-resistant+proteins+and+their+heat-induced+secondary+structural+changes.">Thermal behavior of proteins: Heat-resistant proteins and their heat-induced secondary structural changes.</a> Biochemistry-Us. 39, 14839-14846 (2000).</li><li>Kwon, S., Jung, Y., Lim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+heat-stable+proteins+in+Escherichia+coli.">Proteomic analysis of heat-stable proteins in Escherichia coli.</a> Bmb Rep. 41, 108-111 (2008).</li><li>Komarnytsky, S., Borisjuk, N. V., Borisjuk, L. G., Alam, M. Z., Raskin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+proteins+in+tobacco+guttation+fluid.">Production of recombinant proteins in tobacco guttation fluid.</a> Plant Physiol. 124, 927-933 (2000).</li><li>Drake, P. M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+rhizosecretion+as+a+production+system+for+recombinant+proteins+from+hydroponic+cultivated+tobacco.">Development of rhizosecretion as a production system for recombinant proteins from hydroponic cultivated tobacco.</a> FASEB J. 23, 3581-3589 (2009).</li><li>Turpen, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+mosaic+virus+and+the+virescence+of+biotechnology.">Tobacco mosaic virus and the virescence of biotechnology.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond., Ser. B: Biol. Sci. 354, 665-673 (1999).</li><li>Kingsbury, N. J., McDonald, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Evaluation+of+E1+Endoglucanase+Recovery+from+Tobacco+Leaves+Using+the+Vacuum+Infiltration-Centrifugation+Method.">Quantitative Evaluation of E1 Endoglucanase Recovery from Tobacco Leaves Using the Vacuum Infiltration-Centrifugation Method.</a> Biomed. Res. Int. , (2014).</li><li>Buyel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numeric+simulation+can+be+used+to+predict+heat+transfer+during+the+blanching+of+leaves+and+intact.">Numeric simulation can be used to predict heat transfer during the blanching of leaves and intact.</a> Biochem. Eng. J. , (2015).</li><li>Mandal, M. K., Fischer, R., Schillberg, S., Schiermeyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+protease+activity+by+antisense+RNA+improves+recombinant+protein+production+in+Nicotiana+tabacum+cv.+Bright+Yellow+2+(BY-2)+suspension+cells.">Inhibition of protease activity by antisense RNA improves recombinant protein production in Nicotiana tabacum cv. Bright Yellow 2 (BY-2) suspension cells.</a> Biotechnol. J. 9, 1065-1073 (2014).</li><li>Welty, J. R., Wicks, C. E., Wilson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fundamentals of momentum, heat, and mass transfer. , (1976).</li><li>Lowe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation,+stability,+and+formulation+of+human+antibody+therapeutics.">Aggregation, stability, and formulation of human antibody therapeutics.</a> Advances in protein chemistry and structural biology. 84, 41-61 (2011).</li><li>Gong, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+human+antibody+constant+domains+with+increased+stability.">Engineered human antibody constant domains with increased stability.</a> J. Biol. Chem. 284, 14203-14210 (2009).</li><li>Rouet, R., Lowe, D., Christ, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+engineering+of+the+human+antibody+repertoire.">Stability engineering of the human antibody repertoire.</a> FEBS Lett. 588, 269-277 (2014).</li><li>Stabel, J. R., Lambertz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+pasteurization+conditions+for+the+inactivation+of+Mycobacterium+avium+subsp+paratuberculosis+in+milk.">Efficacy of pasteurization conditions for the inactivation of Mycobacterium avium subsp paratuberculosis in milk.</a> J. Food Prot. 67, 2719-2726 (2004).</li><li>Wichers, H., Mills, C., Wichers, H., Hoffmann-Sommergruber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+12.">Ch. 12.</a> Managing Allergens in Food. , 336 (2006).</li><li>Davis, P. J., Williams, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+modification+by+thermal+processing.">Protein modification by thermal processing.</a> Allergy. 53, 102-105 (1998).</li><li>Dubois, M. F., Hovanessian, A. G., Bensaude, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-shock-induced+denaturation+of+proteins.+Characterization+of+the+insolubilization+of+the+interferon-induced+p68+kinase.">Heat-shock-induced denaturation of proteins. Characterization of the insolubilization of the interferon-induced p68 kinase.</a> J. Biol. Chem. 266, 9707-9711 (1991).</li></ol>

שלוש השיטות עבור משקעים חום המתואר לעיל ניתן להסיר ביעילות HCPs טבק לפני כל צעד טיהור chromatographic 16,17. הם משלימים אסטראטגי אחרים שמטרתן להגדיל טוהר מוצר ראשוני, למשל, guttation 29, rhizosecretion 30 או צנטריפוגלי חילוץ 31,32, שכולן מוגבלי חלבונים מופרשים. עם זא?...

מערכות בריאות מודרניות תלויות יותר ויותר על חלבונים ביולוגיים 1. הפקת חלבונים אלה בצמחים יש יתרון בגלל הנטל הפתוגן נמוך מדרוג גבוה יותר בהשוואה למערכות ביטוי קונבנציונאלי 2-4. עם זאת, העיבוד במורד הזרם (DSP) של תרופות צמחיות יכול להיות מאתגר, מכיוון שתהליך החילוץ משבש לגרום לניטל חלקיקים גבוה, עם turbidities העולה על 5,000 יחידות עכירות nephelometric (NTUs), וחלבון תא מארח (HCP) ריכוזים לעתים קרובות עולים על 95 % [מ &#39;/ מ&#39;] 5,6. נהלי הבהרה משוכללים נדרשים להסיר התפזרו חלקיקים 7-9, אבל ציוד כרומטוגרפיה הוא פחות יקר לפעול במצב לאגד-ו-elute במהלך ההתאוששות ראשונית של מוצר אם יש שלב מוקדם להסרת יעיל של HCPs 10,11. זו יכולה להיות מושגת גם על ידי מזרז חלבון המטרה באמצעות flocculנמלים 12 או pH נמוך 13,14, כמו גם על ידי גורם HCPs לצבור. ההצטברות סלקטיבית של ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase / oxygenase (RuBisCO), את HCP הנפוץ ביותר בצמחים ירוקים כגון טבק (טבק), ניתן לקדם באמצעות הוספת פוליאתילן גליקול 15, אבל זה יקר עולה בקנה אחד עם גדול ייצור -scale. עיבוד תרמי הוכח לפגל משקע יותר מ -95% של HCPs טבק, בעוד מועמדי חיסון חלבון מלריה כגון Vax8 להישאר יציבים בתמיסה 16-18. שלוש גישות שונות שימשו כדי להשיג את המשקעים הנגרמת בלהט HCPs טבק: (i) הלבנה, כלומר, טבילה של עלים שלמים נוזל חם, (ii) בטמפרטורה מבוקרת עוררה כלי, וכן (iii) מחליף חום ( איור 1) 16. לקבלת עלים שלמים, לבנה השיג את המשקעים המהירים ויעילים של HCPs והיה גם קלבהיקף של עד ועומד בקנה אחד עם תהליכי ייצור בקנה מידה גדול הקיימים הכוללים צעד ראשון לשטוף את ביומסה במפעל 19. לעומת זאת, כלי בקרת טמפרטורה כבר זמין בתהליכים מסוימים וניתן להשתמש בו לטיפול התרמי של תמציות צמחים 20, אבל מדרגיות אנרגית קצב העברה שלהם מוגבלות בגלל היחס שטחו פן לנפח של הטנקים מצטמצם בהדרגה הופך מתאים בקנה מידה תהליך. מחליף חום הוא אלטרנטיבה מוגדרת היטב מבחינה טכנית מחוממת כלי עוררה אבל דורש שפע של חימום ומדיה קירור, למשל, קיטור ומים קרים, כמו גם ספיקה בחוזקה מבוקרת ומותאמת הגיאומטריה המחליפה חום נכסי מדיה, למשל., קיבולת החום הסגולית. מאמר זה מראה כיצד כל שלוש שיטות יכולות לשמש עבור הממטרים החומים הנגרמת של HCPs הטבק, HCPs צמח בכלל. הקמה והפעלה של EACשיטת h במעבדה הגדרה שניתן להשתמש בהם כדי להעריך את מידת התאמתם תהליכים בקנה מידה גדול יותר. האתגר העיקרי הוא לזהות מודלים בקנה מידה למטה נאותים ותנאי פועל עבור כל פעולה דומה ההתקנים ותנאי שימוש במהלך תהליך ייצור בקנה מידה. הנתונים המוצגים כאן מתייחסים ניסויים שנערכו עם צמחי טבק מהונדסים מבטא מועמד חיסון למלריה Vax8 ו חלבון פלואורסצנטי DsRed 16, אבל השיטה גם יושמה בהצלחת נ צמחי benthamiana לבטא חלבונים ביולוגיים אחרים זמן 21. עיצוב-של-ניסויים (DOE) להתקרב 22 יכול להקל על פיתוח תהליך, flocculants 23 יכול גם להיות מועיל בהקשר זה כפי שתואר לעיל 8. ההבדל העיקרי בין הלבנה, כלי מחומם מחליפי חום הוא הלבנה מוחלת על עלים שלמים מוקדם בתהליך ואילו otשלה מוחלים תמציות צמחים (איור 1). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54343/54343fig1.jpg" /> איור 1:. תהליך Scheme הזרימה הממחיש את היישום בשלוש שיטות שונות עבור משקעי חום הטבק HCP החומר הצמחי נשטף הומוגני לפני ההבהרה וטיהור. הציוד עבור השלב הלבן (אדום) ניתן להוסיף בקלות על המכונות הקיימות. לעומת זאת, מתוך כלי בחש (כתומה) ובמיוחד מחליף חום (כחול) דורש אחד או מספר התקנים נוספים צינורות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54343/54343fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1026">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">2100P Portable Turbidimeter</td>
			<td style="width:195px;">Hach</td>
			<td style="width:119px;">4650000</td>
			<td style="width:352px;">Turbidimeter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Amine Coupling Kit</td>
			<td style="width:195px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">BR100050&#160;</td>
			<td>SPR chip coupling kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Autoclaving basket</td>
			<td style="width:195px;">Nalgene</td>
			<td style="width:119px;">6917-0230</td>
			<td>Basket for leaf blanching</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Biacore T200</td>
			<td style="width:195px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">28-9750-01</td>
			<td>SPR device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Bio Cell Analyser BCA 003 R&#38;D with 3D ORM</td>
			<td style="width:195px;">Sequip</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td>Particle size analyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Blender</td>
			<td style="width:195px;">Waring</td>
			<td style="width:119px;">800EG</td>
			<td>Blender</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">BP-410</td>
			<td style="width:195px;">Furh</td>
			<td style="width:119px;">2632410001</td>
			<td>Bag filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Centrifuge 5415D</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5424 000.410</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Centrifuge tube 15 mL</td>
			<td style="width:195px;">Labomedic</td>
			<td style="width:119px;">2017106</td>
			<td>Reaction tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Centrifuge tube 50 mL self-standing</td>
			<td style="width:195px;">Labomedic</td>
			<td style="width:119px;">1110504</td>
			<td>Reaction tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">CM5 chip</td>
			<td style="width:195px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">BR100012&#160;</td>
			<td>Chip for SPR measurements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Cuvette 10x10x45</td>
			<td style="width:195px;">Sarsted</td>
			<td style="width:119px;">67.754</td>
			<td>Cuvette for Zetasizer Nano ZS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Design-Expert(R) 8</td>
			<td style="width:195px;">Stat-Ease, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td>DoE software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Disodium phosphate</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">&#160;4984.3&#160;</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Ferty 2 Mega</td>
			<td style="width:195px;">Kammlott</td>
			<td style="width:119px;">5.220072</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Forma -86C ULT freezer</td>
			<td style="width:195px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">88400</td>
			<td>Freezer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Greenhouse</td>
			<td style="width:195px;">n.a.</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td>For plant cultivation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Grodan Rockwool Cubes 10x10cm</td>
			<td style="width:195px;">Grodan</td>
			<td style="width:119px;">102446</td>
			<td>Rockwool block</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Twentey-loop heat exchanger (4.8 m length)</td>
			<td style="width:195px;">n.a. (custom design)</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td>Heat exchanger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">HEPES</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">9105.3</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">K200P 60D</td>
			<td style="width:195px;">Pall</td>
			<td style="width:119px;">5302303</td>
			<td>Depth filter layer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">KS50P 60D</td>
			<td style="width:195px;">Pall</td>
			<td style="width:119px;">B12486</td>
			<td>Depth filter layer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Lauda E300</td>
			<td style="width:195px;">Lauda Dr Wobser GmbH</td>
			<td style="width:119px;">Z90010</td>
			<td>Water bath thermostat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">L/S 24</td>
			<td style="width:195px;">Masterflex</td>
			<td style="width:119px;">SN-06508-24</td>
			<td>Tubing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:360px;">mAb 5.2</td>
			<td style="width:195px;">American Type Culture Collection</td>
			<td style="width:119px;">HB-9148</td>
			<td>Vax8 specific antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Masterflex L/S</td>
			<td style="width:195px;">Masterflex</td>
			<td style="width:119px;">HV-77921-75</td>
			<td>Peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Miracloth</td>
			<td style="width:195px;">Labomedic</td>
			<td style="width:119px;">475855-1R</td>
			<td>Filter cloth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">MultiLine Multi 3410 IDS</td>
			<td style="width:195px;">WTW</td>
			<td style="width:119px;">WTW_2020</td>
			<td>pH meter / conductivity meter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Osram cool white 36 W</td>
			<td style="width:195px;">Osram</td>
			<td style="width:119px;">4930440</td>
			<td>Light source</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Phytotron</td>
			<td style="width:195px;">Ilka Zell</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td>For plant cultivation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Sodium disulfit</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">8554.1</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">P029.2</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:360px;">Stainless-steel vessel; 0.7-kg 2.0-L; height 180 mm; diameter 120 mm</td>
			<td style="width:195px;">n.a. (custom design)</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td>Container for heat precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Synergy HT</td>
			<td style="width:195px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">SIAFRT</td>
			<td>Fluorescence and spectrometric plate reader</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">VelaPad 60</td>
			<td style="width:195px;">Pall</td>
			<td style="width:119px;">VP60G03KNH4</td>
			<td>Filter housing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Zetasizer Nano ZS</td>
			<td style="width:195px;">Malvern</td>
			<td style="width:119px;">ZEN3600</td>
			<td>DLS particle size distribution measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Zetasizer Software v7.11</td>
			<td style="width:195px;">Malvern</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td>Software to operate the Zetasizer Nano ZS device</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comparison of tobacco host cell protein removal methods by blanching intact plants or by heat treatment of extracts

צמחים לא רק לספק מזון, מזון וחומר גלם עבור בני אדם, אלא גם פותחו כמערכת ייצור חסכונית עבור חלבונים הביו-פרמצבטיקה, כגון נוגדנים, מועמדי חיסון ואנזימים. חייבים להיות מטוהרים אלה מן ביומסה במפעל אבל צעדים כרומטוגרפיה הם הפריעו ידי הריכוזים הגבוהים של חלבוני תא מארח (HCPs) תמציות צמחים. עם זאת, רוב HCPs לצבור באופן בלתי הפיך בטמפרטורות מעל 60 מעלות צלזיוס הקלת הטיהור הבאה של חלבון המטרה. הנה, שלוש שיטות מוצגות כדי להשיג את המשקעים בלהט HCPs טבק או שלמי עלים או תמציות. מבצע לבנת עלים שלמים ניתן לשלב בקלות לתוך תהליכים קיימים אך עשויה להיות השפעה שלילית על צעדי סינון הבאים. ההפך הוא נכון עבור משקעים חומים של תמציות עלו בתוך כלי בחש, אשר יכול לשפר את הביצועים של פעולות במורד זרם אמנם עם שינויים משמעותיים בעיצוב מכשור הטכנולוגי, כגוןגיאומטרית homogenizer. לבסוף, התקנה מחליפה חום מאופיין גם מבחינת תנאי העברת חום קל מידה, אבל ניקוי יכול להיות קשה ולא תיתכן השפעה שלילית על יכולת סינון. העיצוב-של-ניסויי הגישה יכולה לשמש כדי לזהות את הפרמטרים של תהליך הרלוונטיים ביותר משפיעי הסרת HCP והתאוששות מוצר. זה מקל על היישום של כל שיטה בפלטפורמות ביטוי אחרות וזיהוי של השיטה המתאימה ביותר עבור אסטרטגיה לטיהור נתונה.

ממטרים חומים של חלבוני תא מארח טבק ידי לבן ההליך הלבנה בסעיף 2. שימש בהצלחה כדי לזרז HCPs מטבק עלים עם 70 מעלות צלזיוס, דבר שיפחית את TSP ידי 96 ± 1% (n = 3) בעודו מחלים עד 51% של חלבון המטרה Vax8, ובכך להגדיל שלה טוהר מ -0.1% ל -1.2% לפני ההפרדה chromatographic 16. ז?...

Watch this Scientific Journal Video about Comparison of Tobacco Host Cell Protein Removal Methods by Blanching Intact Plants or by Heat Treatment of Extracts at JoVE.com

Comparison of Tobacco Host Cell Protein Removal Methods by Blanching Intact Plants or by Heat Treatment of Extracts

שלושה חום שיטות ממטרים מוצגות ביעילות להסיר יותר מ -90% של חלבוני תא מארח (HCPs) מטבק תמציות לפני כל צעד טיהור אחר. המפעל HCPs לצבור באופן בלתי הפיך בטמפרטורות מעל 60 מעלות צלזיוס.

השוואת שיטות להסרת Cell חלבון מארח טבק ידי לבנת צמחים שלמים או על ידי טיפול בחום של תמציות

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

הכנה ההיפוך חלוקה של Xenopus laevis ביצה תמציות

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

איתור של פוסט translational שינויים על nucleosomes אינטקט Native ידי ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

פלטפורמת הפקת MultiBac החלבון המורכבת בEMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

חלבונים אינטראקציות דמיינו ידי bimolecular הקרינה complementation בProtoplasts הטבק ועלים

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

ניתוח Glucocorticoid צואה: לא פולשני ניטור הכליה ב Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

DamID-seq: מיפוי הגנום של אינטראקציות החלבון-DNA על ידי תפוקה גבוהה רצף של קטעי DNA-מפוגל אדנין

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts

נוהל כדי להעריך את היעילות של flocculants להרחקת מפוזרי חלקיקים מן תמציות צמחים

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used ...

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

השוואה של שלוש שיטות שונות לקביעת שגשוג תאים בשורות תאי סרטן השד

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Xenopus ביציות: שיטות אופטימיזציה עבור Microinjection, הסרת שכבות ניידות זקיקים, ושינויי פתרון מהירים בניסויי אלקטרו

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery ...