Name: determining immune system suppression versus cns protection for pharmacological interventions in autoimmune demyelination
Uploaded: 2016-09-12T14:00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining Immune System Suppression versus CNS Protection for Pharmacological Interventions in Autoimmune Demyelination at JoVE.com

Este trabajo fue financiado por el NINDS-P30 NS069324, El Nacional de Esclerosis Múltiple SocietyRG 4587-A-1, La Fundación Internacional de Investigación Civitan, La Fundación Mike L. Jezdimir mielitis transversa, La Fundación Universidad de Alabama Servicios de Salud - Fondo General de Dotación, El Nacional Science Foundation 1355183 y T32 AI007051 del Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas de los Institutos nacionales de Salud.

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C., Lane, T. E., Stohlman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronavirus+infection+of+the+central+nervous+system:+host-virus+stand-off.">Coronavirus infection of the central nervous system: host-virus stand-off.</a> Nat Rev Microbiol. 4, 121-132 (2006).</li><li>Anghelina, D., Pewe, L., Perlman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+role+for+virus-specific+CD4+T+cells+in+mice+with+coronavirus-induced+acute+encephalitis.">Pathogenic role for virus-specific CD4 T cells in mice with coronavirus-induced acute encephalitis.</a> The American Journal of Pathology. 169, 209-222 (2006).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los pacientes con EM continúan experimentando recaídas de la enfermedad mientras esté tomando medicamentos que atenúan la activación y / o infiltración de células T en el SNC, lo que justifica el desarrollo de opciones de tratamiento que protegen directamente el sistema nervioso central. EAE clásicamente se ha utilizado para modelar los síntomas de la EM y puede ser una herramienta poderosa en el estudio de la naturaleza de las interacciones entre el sistema inmune y sistema nervioso central in vivo. El uso de la sincronización de las consideraciones de tratamiento en EAE, por ejemplo, antes o después de la iniciación de la enfermedad, en conjunción con el examen de la infiltración de células inmunes en el SNC y la proliferación y activación en la periferia, es posible delimitar los efectos de los tratamientos tanto en el sistema inmune y el SNC. Mientras EAE en el ratón C57BL / 6 se utiliza más ampliamente, EAE en el ratón SJL puede ser más representativa de la mayoría de los casos de EM, ya que estos ratones tienen un fenotipo de recaída-remisión y la infiltración de células inmunes en el parénquimadel cerebro 10. ratones SJL tienen clara recuperación durante la remisión, así, por lo que es posible comenzar el tratamiento después de la enfermedad se ha presentado, pero en tiempos de disminución de la inflamación. Es importante tener en cuenta que los ratones SJL no siempre recaída y remitir en sincronía, lo que resulta en potencialmente gran variabilidad cuando los resultados se agruparon. Por lo tanto, algunos investigadores pueden optar por mostrar resultados representativos de las puntuaciones clínicas de un animal, teniendo ratones para el análisis FACS e histología en los puntos individualizados en la progresión de la enfermedad. Teniendo en cuenta cuando se realizan manipulaciones a ratones EAE puede ayudar en la determinación de cómo un tratamiento afecta al sistema inmune o del SNC. Hay muchas opciones para cuando comience el tratamiento, cada una con su connotación de si las células inmunes han entrado en el sistema nervioso central y la forma en que puede estar interactuando con el sistema nervioso central. Tratamiento antes de inicio de los síntomas implica que las células inmunes aún no han entrado o causado daños en el sistema nervioso central.El tratamiento después de la aparición de los síntomas implica que las células inmunes han entrado en el sistema nervioso central y han causado algún daño. Utilizando ratones SJL, el tratamiento también puede comenzar durante una recaída, donde las células inmunes se están infiltrando en forma activa y causando inflamación, o durante la remisión, donde las células inmunes pueden ser menos frecuente en el SNC con menos inflamación. hipótesis iniciales con respecto a cómo los tratamientos afectan el sistema nervioso central y el sistema inmunológico se pueden hacer cuando se considera en donde las células inmunes están en el proceso patológico durante el tratamiento. Hay un número de maneras en las que los tratamientos pueden afectar a las células inmunes y la CNS, cada uno con el resultado final de la reducción de severidad de los síntomas de EAE. Por lo tanto, es necesario el uso de análisis de citometría de flujo e inmunohistoquímica para examinar cómo las células inmunes se ven afectados en la periferia y el SNC, si las células inmunes han entrado en el sistema nervioso central, y cómo el sistema nervioso central reacciona al tratamiento. Mientras que el análisis de citometría de flujo de la médula espinal puede determinar el número de células hahe entrado en el sistema nervioso central en un momento dado, no se puede determinar que este efecto es debido al tráfico de célula inmune reducida a no ser que la proliferación de las células inmunes no se ve afectada en el bazo. Por lo tanto, es necesario analizar tanto el tejido periférico y el sistema nervioso central y determinar qué resultados significan mecánicamente cuando se comparan ambos tejidos. También es posible que los perfiles de actividad de las células inmunes a ser alterados por el tratamiento, por ejemplo con un interruptor en un perfil de células T helper pesada patógena a un perfil de células T reguladoras pesada. En cuanto a los marcadores para los diferentes tipos de células y la comparación de la expresión por ciento entre los animales tratados y no tratados tanto, es también una consideración importante. Un concepto emergente en la investigación MS sugiere que las células B desempeñan un papel importante en la desmielinización autoinmune. Esto se basa en estudios que muestran que las células B son necesarias para la reactivación de las células T 20. Este concepto se apoya en el éxito de los tratamientos como el rituximab, un anticuerpo contra CD20 expresionado en la superficie de las células B 21,22. Como lo demuestra el éxito de la ocrelizumab anticuerpo monoclonal en los ensayos clínicos, las drogas dirigidas a diferentes epítopos del antígeno CD20 pueden mejorar la eficacia de la terapéutica específica de células B-23. Una de las limitaciones de las técnicas presentadas aquí es que es posible que las células inmunitarias para entrar en el CNS, pero ser incapaces de viajar en el parénquima. La inmunohistoquímica se puede utilizar para detectar manguitos perivasculares de células inmunes y evaluar la distancia recorrida en el parénquima entre los animales tratados y no tratados. Otra posible limitación implica los efectos de la microbioma sobre la EAE patogénesis. Microbiota intestinal comensal puede influir mucho en la patogénesis de enfermedades 24; Por lo tanto, los ratones alojados en diferentes colonias e incluso en diferentes jaulas pueden tener grandes diferencias en la gravedad de la enfermedad. En consecuencia, es preferible siempre que sea posible utilizar los controles de la misma camada criados en la misma jaula paraexperimentos con EAE. Una nota final es que si se trata de forma experimental deseable eliminar los efectos de los cambios proliferativos de células inmunes en la periferia, es posible que se pueda hacer por medio de la inducción de la transferencia pasiva en lugar de la inducción activa descrita en este protocolo. La confirmación adicional para la neuroprotección se puede lograr utilizando un sistema de co-cultivo 11 para poner a prueba los mecanismos específicos de la muerte celular o a través del uso de ratones knockout condicional que permite la eliminación de las proteínas de forma selectiva en un tipo de célula. Además, para extender la exploración de agentes farmacológicos que son neuroprotectores, los marcadores de la transección axonal y la muerte neuronal deben ser incluidos. Otra área de importancia es la remielinización. axones lesionados son incapaces de mielinizar prestar más apoyo que las terapias neuroprotectoras deben ser una parte importante de las terapias de remielinización. Además, los axones no mielinizados son más vulnerables a las lesiones que myelinaaxones TED. Esto sugiere que cuando un axón se convierte en intervenciones terapéuticas desmielinizadas que promueven la remielinización oportuna impedirá la lesión axonal. Para estudiar estas posibilidades, otros modelos in vivo para la desmielinización y remielinización se pueden utilizar (es decir, cuprizone y lisolecitina). El método descrito en la presente memoria se centró en la evaluación de la neuroprotección mediante la cuantificación de la pérdida de mielina. Para la evaluación de la remielinización del número de células progenitoras, así como su capacidad para proliferar y madurar también sería importante investigar. Con la mención de estos modelos alternativos, se debe considerar también diferentes modelos de encefalitis que están mediadas por virus. Hay dos modelos virales de ARN bien caracterizados que producen la pérdida de la mielina: una es la encefalomielitis murina de Theiler, un virus sin envoltura Picornaviridae, y el otro es el virus de hepatitis de ratón, un miembro de la familia del virus Coronaviridae 25,26. La EAE es una herramienta valiosa para studies de cómo manipulaciones o tratamientos afectan el sistema inmune y el sistema nervioso central in vivo. El protocolo descrito aquí puede ayudar a determinar donde los tratamientos están afectando el proceso de la enfermedad, ya sea en la periferia, en la barrera sangre-cerebro, o en el SNC. No hay tratamientos actuales para la EM curan la enfermedad y los pacientes a menudo experimentan declive en el tiempo. Del mismo modo, otras enfermedades que implican la infiltración de células inmunes en el SNC y la degradación de la mielina, incluyendo encefalomielitis diseminada aguda, mielitis transversa y la neuromielitis óptica, tratamientos falta que protegen el sistema nervioso central ya que está directamente bajo el ataque de la infiltración de células inmunes. Teniendo en cuenta el tiempo de tratamiento y el uso de análisis de citometría de flujo del bazo y la médula espinal en relación con la inmunohistoquímica de la CNS para evaluar la inflamación y el daño permitirá determinaciones mecanicistas ser realizados en relación con los tratamientos.

La esclerosis múltiple (MS) se caracteriza por lesiones inflamatorias predominantemente en las regiones de la materia blanca del cerebro en la enfermedad temprana. Después de progresión a largo plazo, gris atrofia de la materia se detecta mediante imágenes de resonancia magnética y marca la fase neurodegenerativa de la enfermedad. gliosis reactiva, desmielinización y daño axonal en la sustancia blanca se atribuyen a las células inmunes que infiltran el SNC. Ninguno de los tratamientos utilizados actualmente en MS revertir o prevenir la neurodegeneración directamente en el SNC - en cambio, reducir la inflamación mediante la atenuación de la activación de células T y / o la infiltración en el sistema nervioso central. Debido a que no existe una cura para la EM y los pacientes que usan tratamientos actuales continúan experimentando progresión de la enfermedad, los descubrimientos de fármacos que impiden la desmielinización y la pérdida neuronal son de importancia crítica. Sin embargo, diferenciar entre los efectos sobre las células inmunes y los de la CNS puede ser difícil experimentalmente, como el resultado - es decir, la reducción de daños en el SNC - ve los sAME independientemente de los mecanismos mediante los cuales se produce. Por lo tanto, la evaluación de la protección CNS debe asoció con evaluaciones de CNS-infiltración de células y la proliferación de las células inmunes inmunes en la periferia para determinar cómo afecta a los agentes farmacológicos mecanismos de la enfermedad. La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo animal bien establecido de trastornos inflamatorios autoinmunes que era directamente responsable del descubrimiento de fármacos utilizados actualmente para tratar la EM 1-4. Los ratones a menudo se utilizan para EAE, con ratones C57BL / 6 de ser una cepa popular basada en la disponibilidad de variantes genéticas. C57BL / 6 ratones inducidos con EAE exhiben progresión de la enfermedad crónica con inicio alrededor de 10 días después de la inducción. La infiltración del parénquima de la médula espinal y cerebelo son características de la histopatología de estos animales, con ausencia de infiltración en el parénquima cortical 5. lesiones Además, corticales y desmielinización en el blluvia son características de la enfermedad 6-9, que son relativamente ausente en ratones C57BL / 6. Por lo tanto, puede ser preferible cuando es posible utilizar ratones SJL, que tienen la enfermedad de recaída-remisión y lesiones encontradas en el cerebro y la médula espinal que parecen similares a los de MS 10. El tratamiento no puede ser clasificado como neuroprotector si las células inmunes nunca llegan al SNC. Por lo tanto, este protocolo hace uso de análisis de citometría de flujo de cerebro, médula espinal, y los bazos de ratones EAE para determinar los efectos del tratamiento sobre la infiltración de células inmunes en el SNC y la proliferación de células inmunes en la periferia, como se ha demostrado previamente 11. También se describen los análisis inmunohistoquímicos de tejido del SNC para determinar la extensión y naturaleza de la neuroprotección. La combinación de estos métodos permite la determinación de si las células inmunes se activan y proliferan en la periferia, si las células inmunes entraron en el CNS, y si el CNS era protected de la inflamación o daño. Si se sospecha de efectos neuroprotectores pesar de los efectos sobre el sistema inmune, los experimentadores pueden alterar el tratamiento se inicia veces después de la infiltración de células inmunes en ha producido el CNS. A continuación, presentamos un protocolo utilizando dos modelos diferentes de la EAE activo, un modelo animal mediada por células T de la EM, y citometría de flujo análisis combinado con técnicas de inmunohistoquímica en varios puntos de tiempo durante la enfermedad para determinar la eficacia de las terapias experimentales en diferentes aspectos de patogénesis de MS. Este método ayudará a los investigadores en la diferenciación entre los efectos sobre la proliferación de células inmunes y la infiltración frente a protección de CNS, por lo que es más fácil a reducir cómo fármacos actúan sobre la patogénesis de enfermedades.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>22 x 22 x 20 mm embedding mold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9719245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 x 30 x 20 mm embedding mold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9531194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (55mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O3551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 x 22 x 20 mm embedding mold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>118-156-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD4 PE-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552775</td>
			<td>0.2 mg/mL stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Foxp3-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-5773-82</td>
			<td>0.5 mg/mL stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFAP (Cocktail)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>835301</td>
			<td>1-3 mg/mL stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Iba-1 Polyclonal Antibody (50 ug)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-19741</td>
			<td>0.5 mg/mL stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-IFN-&#947; APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-7311-82</td>
			<td>0.2 mg/mL stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-IL-17A PerCP-Cy5.5</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>45-7177-82</td>
			<td>0.2 mg/mL stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Ki-67 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5698-82</td>
			<td>0.2 mg/mL stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-MBP (D-18)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-13912</td>
			<td>0.2 mg/mL stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TCR&#946; FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-5961-85</td>
			<td>0.5 mg/mL stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TCR&#946; PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5961-83</td>
			<td>0.2 mg/mL stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>BA-1000</td>
			<td>1.5 mg/mL stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Horse Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>BA-2000&#160;</td>
			<td>1.5 mg/mL stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid, Anhydrous, 99.5%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC42356-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), tetrasodium salt dihydrate, 99%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC446085000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, case of 10</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td>&#8203;Foxp3 transcription factor staining reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Golgi Plug</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555029</td>
			<td>protein transport inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immedge Hydrophobic Barrier Pen</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9545623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>407952-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine, 100X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-005-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Nonessential Amino Acids</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-025-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Near IR Live/Dead Staining Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L10119</td>
			<td>viability dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal horse serum</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>S-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 96%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC416785000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution, 100X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td>density gradient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td>resinous mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1585-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified anti-Myelin Basic Protein Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>808401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-000-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek CRYO-OCT Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-373-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>nonionic detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectastain Elite ABC Kit (Standard)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9206402</td>
			<td>avidin-biotin-peroxidase&#160;complex (ABC) in immunoperoxidase&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector Laboratories Peroxidase Substrate Kit (DAB)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9276270</td>
			<td>DAB solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining immune system suppression versus cns protection for pharmacological interventions in autoimmune demyelination

A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in myelin destruction, which not only slows conduction of nerve impulses, but causes axonal injury resulting in motor and cognitive decline. Current treatments for MS focus on attenuating immune cell infiltration into the central nervous system (CNS). These treatments decrease the number of relapses, improving quality of life, but do not completely eliminate relapses so long-term disability is not improved. Therefore, therapeutic agents that protect the CNS are warranted. In both animal models as well as human patients with MS, T cell entry into the CNS is generally considered the initiating inflammatory event. In order to assess if a drug protects the CNS, any potential effects on immune cell infiltration or proliferation in the periphery must be ruled out. This protocol describes how to determine whether CNS protection observed after drug intervention is a consequence of attenuating CNS-infiltrating immune cells or blocking death of CNS cells during inflammatory insults. The ability to examine MS treatments that are protective to the CNS during inflammatory insults is highly critical for the advancement of therapeutic strategies since current treatments reduce, but do not completely eliminate, relapses (i.e., immune cell infiltration), leaving the CNS vulnerable to degeneration.

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Determining Immune System Suppression versus CNS Protection for Pharmacological Interventions in Autoimmune Demyelination

This protocol describes how to determine whether pharmacological treatments for experimental autoimmune encephalomyelitis show CNS protection as a consequence of suppressing immune cell infiltration or are neuroprotective during the onslaught of immune cell infiltration.

La determinación de supresión del sistema inmunológico frente a la protección del SNC para Intervenciones farmacológicas en la desmielinización autoinmune

A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in ...

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Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase G6PI-Induced RA Mice

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