Name: snare-mediated fusion of single proteoliposomes with tethered supported bilayers in a microfluidic flow cell monitored by polarized tirf microscopy
Uploaded: 2016-08-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy at JoVE.co

We thank Vladimir Polejaev (Yale West Campus Imaging Core) for the design and construction of the polarized TIRF microscope, David Baddeley (Yale University) for help with two-color detection instrumentation, and James E. Rothman (Yale University) and Ben O'Shaughnessy (Columbia University) and members of their groups for stimulating discussions. EK is supported by a Kavli Neuroscience Scholar Award from the Kavli Foundation and NIH grant 1R01GM108954.

1. Udarbejdelse af en PDMS blok at danne Mikrofluid Channel <img alt="figur 1" src="/files/ftp_upload/54349/54349fig1.jpg" /> Figur 1. mikrofabrikation af flowcelle skabelon og PDMS blok forberedelse. (A) Design af en fire-kanal flowcelle, der passer på en 24 x 60 mm dækglas (nederst). Seks identiske designs er indrettet til at passe på en 10 cm siliciumskive (øverst). (B) Skær blok på ca. 5-8 mm tykke PDMS på et h...

En vellykket gennemførelse af SUV-SBL fusion assay beskrevet her afhænger kritisk på flere vigtige skridt, såsom funktionel rekonstitution af proteiner i liposomer, opnå god kvalitet SBLs, og vælge de rigtige imaging parametre til at opdage enkelte molekyler. Selv om det kan tage lidt tid og kræfter til at lykkes, når analysen gennemføres med succes, det giver et væld af oplysninger om fusionsprocessen ikke nogen anden in vitro-fusion assay diskuteret i Introduction. De satser, hvor SUV&#39;er dock p?...

Membrane fusion er en universel biologisk proces kræves for intracellulær handel med lipider og proteiner, sekretion, gødskning, udvikling, og indhyllet virus indrejse i værtsorganismer 1-3. For de fleste intracellulær fusion reaktioner, herunder frigivelse af hormoner og neurotransmittere via exocytose, er energien til at smelte to lipid-dobbeltlag, som dannelsen af en fire-helix bundt mellem beslægtet opløseligt N-ethylmaleimid-følsomme faktor vedhæftet protein receptor (SNARE) proteiner, forankret i vesiklen (v-SNARE) og målmembranen (t-SNARE) 4. Synaptisk vesikel exocytose er den mest stramt reguleret fusionsreaktion og forekommer inden for et millisekund efter ankomsten af et aktionspotentiale 1,4,5. Fusionen pore, den oprindelige forbindelse mellem de to fusing rum, kan flimre åbne og lukkede flere gange, før genlukning eller udvide irreversibelt 5-7. De tidligere resultateri forbigående, &quot;kys &amp; run&quot; fusion, mens sidstnævnte fører til fuld fusion. Faktorer for balancen mellem disse to former for fusion og mekanismer, der regulerer pore flimmer er ikke godt forstået 5,8. SNARE proteiner er nødvendige for exocytose; synaptisk vesikel fusion afskaffes ved spaltning af snarer ved nervegifte 9. Bulk fusionseksperimenter med små unilamelblærer (SUV&#39;er) viste, at Snares ikke kræves kun, men også tilstrækkelig til at drive membran fusion 10. I denne bulk-assay SUV&#39;er rekonstitueret med v-Snares (v-SUV) blev doteret med fluorescerende phospholipider (N - (7-nitro-2-1,3-benzoxadiazo-4-yl) -phosphoethanolamine (NBD-PE) og ( N -. (lissamin rhodamin B sulfonyl) -phosphoethanolamine (LR-PE) og blandes med umærkede vesikler indeholdende t-snarer (t-SUV) Oprindelig fluorescensen af NBD-PE i V-SUV&#39;er standses ved Forster-resonansenergioverførsel (FRET ) til LR-PE. Som labELED v-SUV&#39;er fuse med umærkede t-SUV&#39;er, er fluoroforen overflade tætheden i den nu kombineret membran reduceret, og den deraf følgende stigning i NBD-PE fluorescens rapporterer omfanget af lipid blanding 10. Da hovedparten assay er nem at sætte op og analysere, har det været almindeligt anvendt til at undersøge mekanismerne for SNARE-medieret fusion 10-14. Det har imidlertid adskillige begrænsninger, såsom lav følsomhed og dårlig tidsopløsning. Vigtigst er det, som et ensemble måling, det gennemsnit resultaterne for alle hændelser gør forskelsbehandling mellem docking og fusion, samt påvisning af hemifusion mellemprodukter vanskelig. Gennem det seneste årti flere grupper, herunder vores, har udviklet nye analyser for at overvåge fusion begivenheder på enkelt vesikel niveauet 15-27. Ha og kolleger brugte v-SUV&#39;er tøjret på en overflade og overvåget deres fusion med gratis t-SUV&#39;er 18,19. Lipidblanding blev overvåget ved anvendelse FRET mellem et par lipid-bundne fluoroforer emsengs i v- og t-SUV&#39;er henholdsvis hjælp total intern refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi 18. Senere Brunger laboratorium brugt en enkelt lipid-label arter sammen med en indhold markør til samtidig påvisning af lipid og indhold blande 20,28. Både lipid og indholdet markører blev medtaget ved høje, selv-quenching koncentrationer; fusion med umærkede SUV&#39;er resulterede i fluorescens-dequenching 20,28. Andre har smeltet v-SUV&#39;er til plane dobbeltlag rekonstitueret med t-Snares 15-17,21-27,29. Den plane geometri af målet (t-SNARE holdige) dobbeltlaget bedre efterligner den fysiologiske fusionsprocessen af ​​små, meget krumme vesikler med en flad plasmamembranen. Den Steinem beskæftigede koncernen pore-spænder membraner rekonstitueret med t-Snares, suspenderet over en porøs silicium nitrid substrat og opdaget fusion med individuelle v-SUVs bruger konfokal laser scanning mikroskopi 23. Andre fbrugte v-SUV&#39;er til plane dobbeltlag rekonstitueret med t-Snares, støttet på et glas substrat 15-17,21,22,24-27,29. Den store fordel ved at anvende understøttede dobbeltlag (SBLs) er den TIRF mikroskopi kan anvendes til at detektere docking og fusionsbegivenheder med fremragende signal-til-støj-forhold og uden interferens fra fri V-SUV&#39;er, selv om anvendelse af mikrofluidik også tilvejebringer single-event opløsning ved brug standard fjernfelts epifluorescens mikroskopi 24. En stor bekymring er, om og hvordan substrat-dobbeltlag-interaktioner påvirker understøttet dobbeltlag kvalitet og fusionsprocessen. Tidlig arbejde gjort brug af plane SBLs, der blev støttet direkte på et glas eller kvarts substrat 15-17. Disse SBLs blev foretaget ved adsorption, fyldt, spredning og fusion af t-SUV membraner på substratet. Det blev snart indså dog, at udelade en vigtig t-SNARE komponent, SNAP25, fra SBLs fremstillet på denne måde resulterede i v-SUV docking og fusion kinetik indistinguisHable fra dem, der opnås ved hjælp af den fuldstændige t-snarer 17. Fordi SNAP25 er absolut nødvendig for fusion in vivo 30,31, blev den fysiologiske relevans af disse tidlige forsøg sat spørgsmålstegn. Tamm gruppe overvandt denne udfordring ved at bruge bedre kontrolleret understøttet dobbeltlag dannelse 21. Det bruges Langmuir-Blodgett deposition for proteinfrit første blad af SBL, efterfulgt af fusion af denne monolag med t-SUV&#39;er 21. Dette resulterede i SNAP25-afhængig fusion. At undgå potentielle artefakter forbundet med et dobbeltlag direkte understøttet på et glassubstrat uden behov for anvendelse af Langmuir-Blodgett metoder, Karatekin et al. Introducerede en blød, hydratiseret poly (ethylenglycol) (PEG) stødpude mellem dobbeltlaget og substratet 24. Denne ændring resulterede også i SNAP25-afhængig fusion 24. Dobbeltlag polstret på en blød polymerlag havde været kendt til bedre bevare transmembraneprotein mobilitet og funktion 32, og var blevet brugt i fusion studier med virus 33. Desuden PEGylerede dobbeltlag synes at bevare en vis evne til selv at helbrede og er meget robust 34,35. Først en brøkdel af kommercielt tilgængelige, lipid-bundne PEG-kæder med i t-SUV membran. Når disse t-SUV&#39;er briste og danne et plant dobbeltlag på et glassubstrat, en PEG børste dækker både foldere af den plane dobbeltlaget. Fordi plane dobbeltlagsformation drives af adhæsion af PEG-kæderne omgivende t-SUV&#39;er på hydrofile glasoverflade, liposom sprængning og plane dobbeltlagsformation er relativt ufølsomme for lipidsammensætningen anvendt. Men når store mængder af kolesterol er inkluderet, hvilket øger de kohæsive egenskaber af SUV&#39;er, SUV&#39;er kan ikke briste spontant. Hvis dette er tilfældet, kan osmotisk chok eller divalente ioner at medvirke til at plane dobbeltlagsformation 25. Som nævnt ovenfor i denne approach en PEG børste dækker begge sider af plane, støttet dobbeltlaget. Børsten overfor mikrofluid strømningskanal med til at forhindre ikke-specifik adhæsion af indkommende v-SUV&#39;er, som også normalt dækket med en PEG lag. Dannelse af V- og t-SNARE komplekser starter fra membranen-distale N-terminaler og fortsætter i etaper mod den membran-proksimale domæner 36. For v-SUV&#39;er til at interagere med T-SBL, den v- og t-SNARE N-terminaler behov for at rage op over PEG børster, hvilket synes at være tilfældet under betingelserne for assayet. Børste højde kan tilpasses til at studere andre end snarer proteiner ved at variere tætheden af PEGylerede lipider og PEG kædelængde 37,38. En anden fordel ved PEG børster dækker de proksimale overflader af fusing dobbeltlag er, at de efterligner de overfyldte miljø i biologiske membraner, som er pakket med 30.000-40.000 integrale membranproteiner per kvadrat mikron 39. Ligesom PEG-kæderne i dette assay repulsive protein lag, der dækker biologiske membraner skal skubbes til side for at give mulighed for kontakt mellem de to phospholipiddobbeltlag til fusion at forekomme. Mikrofluid strømningskanaler anvendes i dette assay, da de tilbyder unikke fordele. Først mikrofluid flow muliggør mere ensartet afsætning af T-SUV&#39;er til at sprede og sikringen til dannelse af t-SBL. For det andet, den lille kanal volumen (&lt;1 ul) minimerer forbruget prøve. Tredje de små rumfang, der kræves tillade hele forsøget kan udføres under konstant flow. Flow fjerner svagt, formentlig ikke-specifikt, klæbes v-SUV&#39;er fra SBL 16. Det opretholder også en konstant tæthed af v-SUV&#39;er over t-SBL, forenkling kinetisk analyse 17. Endelig er forankret vesikler let skelnes fra frie dem båret af strømmen 25. Fjerde, flere mikrofluidkanaler kan bruges på samme dækglas, hvert sondering en anden tilstand. Dette tillader sammenligning af vilkår during samme eksperimentelle løb. En lignende fremgangsmåde er blevet anvendt af van Oijen gruppe til at studere fusion mellem influenzavirus og polstrede SBLs 33. I TIRF mikroskopi, den eksponentielle henfald af flygtige felt (med en faldekonstant ~ 100 nm) begrænser fluorescens excitation til de molekyler, der er i meget tæt nærhed af glasset-buffer interface. Dette minimerer bidrag af fluorescerende molekyler, som er længere væk, øger signal-til-støj-forhold, og tillader enkelt molekyle følsomhed med eksponering ramme tider med 10-40 msek. Den kortvarigt felt fører også til et signal stigning på fusion: som den mærkede overførsel lipider fra SUV til SBL, de befinder sig i gennemsnit i en stærkere excitation felt. Denne stigning i fluorescens er stærkere for større liposomer. Hvis der anvendes polariseret lys til at generere den flygtige felt, yderligere effekter bidrage til ændringer i fluorescens ved T-ransfer etiketter fra SUV til SBL. Nogle lipid farvestoffer har en overgang dipol orienteret med en foretrukken gennemsnitlig vinkel i forhold til dobbeltlaget, hvori de er indlejret. Dette skaber en forskel i mængden af fluorescens, der udsendes af de fluoroforer, når de er i SUV versus SBL, eftersom det polariserede stråle vil excitere farvestoffer i de to membraner forskelligt. For førstnævnte vil excitation stråle interagere med overgangseffekter dipoler orienteret omkring den sfæriske SUV, mens der for sidstnævnte, vil dipol orienteringer begrænses af den flade SBL geometri. For eksempel, når s-polariseret indfaldende lys (polariseret vinkelret på planet af forekomst) anvendes, magnetisering er mere effektiv, når farvestoffet er i SBL end i SUV til et lipid farvestof overgang dipol orienteret parallelt med membranen 29,40 (som den i Dii eller har 41-43). En SUV doteret med sådan en fluorofor vises dim når den kører onto SBL (figur 7, Representat<html> ive Resultater). Som en fusion pore åbner og forbinder SUV og SBL membraner, fluorescerende prober diffundere ind i SBL og bliver mere tilbøjelige til at blive exciteret af s-polariseret kortvarigt felt 25,27,29. Følgelig fluorescenssignalet integreret omkring fusionsstedet øges kraftigt under overførsel farvestof fra SUV ind SBL 27 (figur 3 og figur 7). En yderligere faktor, der bidrager til at signalere ændringer, som ledsager fusion dequenching af fluorescerende mærker, som de er fortyndet, når de overføres til SBL. Bidraget fra dequenching er sædvanligvis mindre sammenlignet med flygtige felt henfald og polarisationseffekter i assayet beskrevet her, fordi kun en lille brøkdel ( <img alt="ligning 1" src="/files/ftp_upload/54349/54349eq1.jpg" /> ) Af lipiderne er mærket. Signalet stigning ved fusion kan udnyttes til at udlede fusion poreegenskaberne ved at sammenligne den tid,1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54349 / 54349eq2.jpg &quot;/&gt;, der kræves for et lipid at undslippe gennem en pore, der er frit gennemtrængelig for lipider til den aktuelle udgivelse tid, <img alt="ligning 1" src="/files/ftp_upload/54349/54349eq3.jpg" /> . Hvis de to tidsskalaer er sammenlignelige, ville det konkluderes, at pore præsenterer lidt modstand til lipid flow. Men hvis den faktiske frigivelse tid er betydeligt længere end den tid, for diffusion begrænset udgivelse, ville dette betyde en proces, såsom pore flimrende, forsinker lipid frigivelse. Udbredelsen-begrænset release tid, <img alt="ligning 1" src="/files/ftp_upload/54349/54349eq2.jpg" /> , Afhænger af størrelsen af ​​fusing liposom og lipid-diffusivitet; sin vurdering kræver disse to parametre, der skal kvantificeres. Den enkelt molekyle sensitivitet tillader lipid diffusivitet skal måles ved at spore flere enkelt lipid fluoroforer efter deres løsladelse i SBL for hver fusion begivenhed 26. Størrelsen af ​​hver fusing vesikelkan estimeres 27 ved at kombinere (i) intensiteten af en enkelt lipid farvestof, (ii) ændringen i den totale fluorescens omkring en docking websted efter alle fluoroforer overføres til SBL ved fusion, (iii) den kendte mærkning tæthed af SUV lipider, og (iv) det areal pr lipid. For mange fusionshændelser blev de faktiske lipid release gange fundet at være meget langsommere end forventet ved diffusion-controlled release 27, som blev bemærket tidligere antagelse ensartet SUV størrelse 44. Antages retardering af lipid frigivelse skyldes pore flimrende, en kvantitativ model tillader estimering af &quot;pore åbenhed&quot;, den del af tiden pore forbliver åben under fusion 27. Når praktisk, er det vigtigt at teste fusion mekanismer ved hjælp af både lipid og opløselige indhold etiketter. For eksempel kunne lipid frigivelse forsinkes af andre end pore flimrende processer, såsom begrænsning af lipid diffusion af SNARE proteiner, surround than pore. Hvis dette var tilfældet, så slip af indhold vil gå forud frigivelse af lipid etiketter, forudsat pore er stor nok til at tillade passage af opløselige sonder. En mere grundlæggende fejl i tilgangen kunne være i den antagelse, at overførslen af ​​mærkede lipider til SBL sker gennem en smal fusion pore forbinder SBL til en vesikel, der har stort set bevaret sin pre-fusion form. Lipid overførsel til SBL kan også skyldes en hurtig udvidelse af den fusion pore med en samtidig, ekstremt hurtige sammenbrud af SUV i SBL membran, som tidligere foreslået baseret på lipid release data alene 29. Overvågning både lipid og indholdet frigiver samtidigt, blev det konstateret, at mange porer lukkes igen efter udløsning alle deres lipid etiketter, men bevaret nogle af deres opløselige last 27. Dette indikerer, at i det mindste har nogle liposomer ikke skjule i SBL efter fusion, og at lipid farveoverføringsinhiberende ind SBL sker gennem en fusion pore. Derudover lipid og indhold udgivelse forekom samtidigt 27, hvilket gør det usandsynligt, at forsinkelse af lipid frigivelse skyldtes hindring for, lipid diffusion af SNARE proteiner omgiver pore 45. En SUV-SBL fusion protokol, der ikke overvåger opløselige indhold udgivelse er tidligere blevet udgivet af Karatekin og Rothman 25. Her er mere den seneste udvikling inkluderet, nemlig samtidig overvågning af lipid og indhold frigivelse og estimering af SUV, lipid, og fusion pore egenskaber 27. Protokollen begynder med instruktioner til at forberede mikrofluide celler, lavet af limning en poly (dimethylsiloxan) (PDMS) elastomer blok indeholder riller med et dækglas 25. Dernæst udarbejdelse af v-SUV&#39;er med både lipid og indhold markører forklaret. Afdeling 4 og 5 give anvisninger til at samle de mikrofluide celler, der danner SBLs in situ og kontrol for fejl og flydende, indførelse af vSUVS ind flowcellerne og detektion af fusionsbegivenheder. Afsnit 6 indeholder instruktioner til dataanalyse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q (MQ) water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3040-05</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 190 Proof</td>
			<td>Decon</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A416P4</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td rowspan="3">AmericanBio</td>
			<td>AB00892</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cholride (KCl)</td>
			<td>AB01915</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>AB00490</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-[2-hydroxyethyl] piperazine-N&#39;-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES)</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB00892</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>409911000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES-KOH buffer (pH 7.4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25 mM HEPES-KOH, 140 mM KCl, 100 &#956;M EGTA, 1 mM DTT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform&#160;</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9180-01</td>
			<td>in glass bottle, CAUTION, wear PPE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9070-03</td>
			<td>in glass bottle, CAUTION, wear PPE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liposome preparation&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>var. sizes</td>
			<td>only use glass sringe with solents (Chlorophorm/ Methanon, 2:1, v/v)</td>
			<td><a href="http://www.hamiltoncompany.com/">http://www.hamiltoncompany.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tubes Pyrex Vista 11 ml, 16x100 mm screw cap culture tube</td>
			<td>Pyrex&#160;</td>
			<td>70825-16</td>
			<td>clean thoroughly, rinse with chloroform</td>
			<td><a href="http://catalog2.corning.com/LifeSciences/">http://catalog2.corning.com/LifeSciences/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 16:0-18:1 PC (POPC)</td>
			<td rowspan="7">Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457</td>
			<td rowspan="7">Lipids come dissolved in CHCl3 or as lyphilized powder in sealed vials. Aliquot upon opening. Store extra as dried lipid films under inert atmosphere at -20 &#176;C. Keep stocks in CHCl3/MeOH (2:1, v/v) at -20 &#176;C. let come to RT before opening</td>
			<td rowspan="7"><a href="http://www.avantilipids.com/">http://www.avantilipids.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt), 18:1 PS (DOPS)</td>
			<td>840035</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-stearoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 18:0-20:4 PE (SAPE)</td>
			<td>850804</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt), Brain PI(4,5)P2</td>
			<td>840046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt), 18:1 NBD PE</td>
			<td>810145</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt), 18:1 PEG2000 PE</td>
			<td>880130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholesterol (ovine wool, &#62;98%)</td>
			<td>700000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiD&#39; oil; DiIC18(5) oil (1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindodicarbocyanine Perchlorate)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>D-307</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/">https://www.thermofisher.com/&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotavapor R-210</td>
			<td>Buchi</td>
			<td>R-210</td>
			<td>heat bath above Tm of lipids used</td>
			<td><a href="http://www.buchi.com/">http://www.buchi.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OG n-Octyl-&#946;-D-Glucopyranoside</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>0311</td>
			<td>store at -20&#176;C, let come to RT before opening</td>
			<td><a href="https://www.anatrace.com/">https://www.anatrace.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker - Eppendorf Thermomixer R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.eppendorf.com/">https://www.eppendorf.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyze Dialysis Cassettes, 20K MWCO, 3 mL</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>66003</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/">https://www.lifetechnologies.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Beads SM-2 Adsorbents</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1523920</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep&#160;Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifugation tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 x 89 mm&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>41121703</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.beckmancoulter.com/">https://www.beckmancoulter.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman SW41 Ti rotor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuflorhodamineB</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S-1307</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/">https://www.thermofisher.com/&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Column&#160;Chromatography Columns, 2.5 &#215; 10 cm</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7372512</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose CL-4B</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0150-01</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.gelifesciences.com/">http://www.gelifesciences.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Orange Protein Gel Stain</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S-6650</td>
			<td>5,000X Concentrate in DMSO</td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/">https://www.lifetechnologies.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone elastomer kit, PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.dowcorning.com/">http://www.dowcorning.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex glass petri dish, 150 x 20 mm, complete with cover</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3160-152</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://catalog2.corning.com/LifeSciences/">http://catalog2.corning.com/LifeSciences/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole puncher - Reusable Biopsy Punch, 0.75mm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504529</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.wpi-europe.com/">http://www.wpi-europe.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Hole Punching Machine&#160;</td>
			<td rowspan="2">SYNEO</td>
			<td>MHPM-UNV</td>
			<td></td>
			<td rowspan="2">http://www.syneoco.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill .035 x .026 x 1.5 304 SS TiN coated round punch</td>
			<td>CR0350265N20R4</td>
			<td>drill diameter: 0.9 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Microbore tubing, 0.25 mm ID, 0.76 mm OD</td>
			<td rowspan="2">Cole-Parmer</td>
			<td>06419-00</td>
			<td>0.010&#34; ID, 0.030&#34; OD</td>
			<td rowspan="2"><a href="http://www.coleparmer.com/">http://www.coleparmer.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Tubing (0.51 mm ID, 2.1 mm OD</td>
			<td>95802-00</td>
			<td>0.020&#34; ID, 0.083&#34; OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass -&#160; cleanroom cleaned</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schott Nexterion cover slip glass D</td>
			<td>Schott</td>
			<td>1472305</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.us.schott.com/">http://www.us.schott.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasma cleaner</td>
			<td>Harrick</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://harrickplasma.com/">http://harrickplasma.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTIRF setup and accessories</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX81 microscope body</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.olympus-lifescience.com/en/">http://www.olympus-lifescience.com/en/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM CCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>ixon-ultra-897</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.andor.com/">http://www.andor.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Plate, heated microscope stage</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>MATS-U52RA26</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.tokaihit.com/">http://www.tokaihit.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml hamilton glass syringes (4x)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81365</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.hamiltoncompany.com/">http://www.hamiltoncompany.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe pump</td>
			<td>kd Scientific</td>
			<td>KDS-230</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.kdscientific.com/">http://www.kdscientific.com/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

snare-mediated fusion of single proteoliposomes with tethered supported bilayers in a microfluidic flow cell monitored by polarized tirf microscopy

I den allestedsnærværende proces med membranfusion åbningen af ​​en fusion pore etablerer den første forbindelse mellem to tidligere adskilte rum. Under neurotransmitter eller hormon frigivelse via exocytose, fusion pore kan forbigående åbne og lukke flere gange, regulerer fragt release kinetik. Pore ​​dynamik også bestemme tilstanden af ​​vesikel genbrug; irreversible genforseglingsegenskaber resulterer i forbigående, &quot;kiss-and-run&quot; fusion, mens dilation fører til fuld fusion. For bedre at forstå, hvilke faktorer regulerer pore dynamik, vi udviklet et assay til overvågning membran fusion med polariseret total indre refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi med enkelt molekyle følsomhed og ~ 15 msek tidsopløsning i en biokemisk veldefineret in vitro-system. Fusion af fluorescensmærket små unilamellare vesikler indeholdende v-SNARE-proteiner (v-SUV&#39;er) med en plan dobbeltlag bærende t-snarer, understøttet på en blød polymer pude (t-SBL, t-understøttet dobbeltlag), Overvåges. Assayet anvender mikrofluide strømningskanaler, der sikrer minimal prøve forbrug under tilførsel en konstant densitet på SUV&#39;er. Udnyttelse af den hurtige signal forstærkning efter overførsel af lipid etiketter fra SUV til SBL under fusion, er kinetik overførsel lipid farvestof overvåges. Følsomheden af ​​TIRF mikroskopi tillader sporing enkelt fluorescerende lipid etiketter, hvorfra lipid diffusivitet og SUV størrelse kan udledes for hver fusion begivenhed. Lipid gange farvestof release kan være meget længere end forventet for uhindret passage gennem permanent åbne porer. Ved hjælp af en model, der antager retardering af lipid frigivelse skyldes pore flimrende, en pore &quot;åbenhed&quot;, den del af tiden pore forbliver åben under fusion, kan estimeres. Et opløseligt markør kan indkapsles i SUV&#39;er til samtidig overvågning af lipid og opløseligt fragt frigivelse. Sådanne målinger indikerer nogle porer kan tillukkes efter at have tabt en del af den opløselige last.

SBL Kvalitet Det er afgørende at kontrollere kvaliteten og flydende SBL forud for fusion eksperiment. Fluorescensen i bunden, glas side af en mikrofluid kanal bør være ensartet, uden nogen åbenlyse mangler. Hvis en luftboble passerer selvom kanalen, det normalt efterlader synlige ar på SBL. Hvis der er så store skala ar / defekter, skal du ikke bruge denne kanal. Sommetider SUV&#39;er kan klæbe på subs...

Watch this Scientific Journal Video about SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy at JoVE.co

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

Her præsenterer vi en protokol til at opdage enkelt, SNARE-medieret fusion begivenheder mellem liposomer og understøttede dobbeltlag i mikrofluide kanaler ved hjælp polariseret TIRFM, med enkelt molekyle følsomhed og ~ 15 ms tidsopløsning. Lipid- og opløseligt fragt frigivelse kan detekteres samtidigt. Liposomstørrelse, lipid diffusivitet, og fusion pore egenskaber måles.

SNARE-medieret Fusion af Single proteoliposomer med bundet understøttede dobbeltlag i en Mikrofluid Flow Cell Overvåget af Polariseret TIRF Microscopy

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Single Cell Measurement of Dopamine Release with Simultaneous Voltage-clamp and Amperometry

After its release into the synaptic cleft, dopamine exerts its biological properties via its pre- and post-synaptic targets1. The dopamine signal is ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograd fluorescensmærkning Tillader Målrettet Extracellular Single-unit Optagelse fra Identificerede Neuroner<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Optisk registrering af suprathreshold neurale aktivitet med enkelt-celle-og single-spike opløsning

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

In Vivo to-foton mikroskopi af Single nerveender i hud

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

Udarbejdelse af neuronale Co-kulturer med Single Cell Precision

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Inducerende plasticitet astrocytisk receptorer ved manipulation af neuronfyring priser

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

A Simple Flight Mill for the Study of Tethered Flight in Insects

A Simple Flight Mølle for Studiet af Tøjret Flight i Insekter

Flight in insects can be long-range migratory flights, intermediate-range dispersal flights, or short-range host-seeking flights. Previous studies have ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

Analyse af immunceller i enkelt ischiadicus nerver og dorsalrods Ganglion fra et enkelt museklik bruge flowcytometri

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers

Lipid tolagede eksperimenter med kontakt boble dobbeltlag for Patch-Clampers

Lipid bilayers provide a unique experimental platform for functional studies of ion channels, allowing the examination of channel-membrane interactions ...

Three-dimensional Navigation-guided, Prone, Single-position, Lateral Lumbar Interbody Fusion Technique

Tredimensionel navigationsstyret, tilbøjelig, enkeltposition, lateral lændehvirvel interbody fusionsteknik

Lateral interbody fusion provides a significant biomechanical advantage over the traditional transforaminal lumbar interbody fusion due to the large ...