Name: snare-mediated fusion of single proteoliposomes with tethered supported bilayers in a microfluidic flow cell monitored by polarized tirf microscopy
Uploaded: 2016-08-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy at JoVE.co

We thank Vladimir Polejaev (Yale West Campus Imaging Core) for the design and construction of the polarized TIRF microscope, David Baddeley (Yale University) for help with two-color detection instrumentation, and James E. Rothman (Yale University) and Ben O'Shaughnessy (Columbia University) and members of their groups for stimulating discussions. EK is supported by a Kavli Neuroscience Scholar Award from the Kavli Foundation and NIH grant 1R01GM108954.

1. Préparation d&#39;un bloc PDMS pour former le canal microfluidique <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54349/54349fig1.jpg" /> La figure 1. La microfabrication de matrice de cellules d&#39;écoulement et la préparation des blocs PDMS. (A) la conception d&#39;une cellule d&#39;écoulement à quatre canaux qui se fixe sur une lamelle de verre de 24 x 60 mm ( en bas). Six designs identiques sont disposés pour te...

la mise en œuvre réussie de l&#39;essai de fusion SUV-SBL décrite ici dépend essentiellement de plusieurs étapes clés, telles que la reconstitution fonctionnelle des protéines dans des liposomes, l&#39;obtention de bons LTTS de qualité, et en choisissant les paramètres d&#39;imagerie droite pour détecter des molécules simples. Bien que cela puisse prendre un certain temps et d&#39; efforts pour réussir, une fois que le test est mis en œuvre avec succès, il fournit une foule de renseignements sur le process...

Fusion membranaire est un processus biologique universel requis pour le trafic intracellulaire de lipides et de protéines, la sécrétion, la fertilisation, le développement, et enveloppait entrée du virus dans des organismes hôtes 1-3. Pour la plupart des réactions de fusion intracellulaire , y compris la libération d&#39;hormones et de neurotransmetteurs par exocytose, l&#39;énergie nécessaire pour faire fondre les deux bicouches lipidiques est assurée par la formation d&#39;un faisceau de quatre hélices entre les récepteurs de la protéine de fixation du facteur apparenté soluble dans le N-éthylmaléimide sensible à des protéines (SNARE), ancrée dans la vésicule (v-SNARE) et la membrane cible (t-SNARE) 4, respectivement. Synaptic vésiculaire exocytose est la réaction de la fusion la plus étroitement régulée et se produit au sein d&#39; une milliseconde après l&#39;arrivée d&#39;une action 1,4,5 potentiel. Le pore de fusion, la connexion initiale entre les deux compartiments de fusion, peut scintiller ouvert et fermé à plusieurs reprises avant refermeture ou l&#39; expansion irréversible 5-7. Les résultats antérieursen transitoire, &quot;kiss &amp; run&quot; fusion, tandis que le second conduit à la pleine fusion. Les facteurs qui régissent l&#39;équilibre entre ces deux modes de fusion et des mécanismes de régulation des pores scintillements ne sont pas bien comprises 5,8. protéines SNARE sont nécessaires pour l&#39;exocytose; fusion des vésicules synaptiques est abolie lors du clivage de SNAREs par des neurotoxines 9. Expériences de fusion en vrac à l&#39; aide de petites vésicules unilamellaires (SUV) ont montré que SNAREs sont non seulement nécessaires, mais aussi suffisante pour entraîner la fusion de la membrane 10. Dans cet essai en vrac, SUVs reconstitués avec v-SNARE (v-SUV) ont été dopés avec des phospholipides fluorescents (N - (7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) -phosphoethanolamine (NBD-PE) et ( N -. (lissamine rhodamine B sulfonyl) -phosphoethanolamine (LR-PE) et on mélange avec des vésicules non marquées contenant du t-SNARE (t-SUV) dans un premier temps la fluorescence du NBD-PE en v-SUV est désactivé par Förster transfert d&#39;énergie par résonance (FRET ) pour LR-PE. En laboratoireELED v-VUS fusionnent avec sans étiquette t-SUV, la densité de surface de fluorophore dans la membrane maintenant combinée est réduite et l&#39;augmentation résultante de NBD-PE fluorescence rapporte l&#39;étendue des lipides de mélange 10. Comme le test en vrac est facile à configurer et à analyser, il a été largement utilisé pour étudier les mécanismes de SNARE médiée par fusion 10-14. Cependant, il présente plusieurs limites, telles que la faible sensibilité et une mauvaise résolution temporelle. Plus important encore, en tant que mesure d&#39;ensemble, il est en moyenne des résultats sur tous les événements qui font une discrimination entre l&#39;amarrage et la fusion, ainsi que la détection des intermédiaires difficiles de hemifusion. Au cours de la dernière décennie , plusieurs groupes, dont le nôtre, ont mis au point de nouveaux tests pour surveiller les événements de fusion au niveau de la vésicule unique 15-27. Ha et ses collègues ont utilisé v-VUS attachés sur une surface et un suivi de leur fusion avec libres t-VUS 18,19. Le mélange de lipides a été contrôlée en utilisant le FRET entre une paire de fluorophores lié aux lipides emlits dans le v- et t-SUV, respectivement, en utilisant la fluorescence totale de réflexion interne (FRBR) microscopie 18. Plus tard, le laboratoire de Brunger utilisé une seule espèce de lipide-étiquette avec un marqueur de contenu pour la détection simultanée des teneurs en lipides et le mélange 20,28. Tant le lipide et les marqueurs de contenu ont été inclus à des concentrations élevées, auto-extinction; fusion avec VUS non marqués a donné lieu à fluorescence dequenching 20,28. D&#39; autres ont fusionné v-VUS à bicouches planes reconstituées avec t-SNAREs 15-17,21-27,29. La géométrie plane de la cible (t-SNARE contenant) bicouches imite mieux le processus de fusion physiologique de petites vésicules, à forte courbure d&#39;une membrane plasmique à plat. Le groupe Steinem utilise des membranes à pores transmembranaires reconstituées avec du t-SNARE, suspendue sur un substrat de nitrure de silicium poreux et détecté la fusion avec v-SUV individuels en utilisant laser microscopie confocale à balayage 23. f Autresv-VUS d&#39; occasion à bicouches planes reconstituées avec t-SNAREs, pris en charge sur un substrat de verre 15-17,21,22,24-27,29. Le grand avantage de l&#39;utilisation de bicouches pris en charge (SBLS) est que la microscopie TIRF peut être utilisé pour détecter accueil et de fusion des événements avec un excellent rapport signal-bruit et sans interférence de v-VUS libres, bien que l&#39;utilisation microfluidique fournit également la résolution d&#39;événement unique à l&#39;aide champ lointain norme microscopie épifluorescence 24. Une préoccupation majeure est de savoir si et comment les interactions substrat-bicouche affectent pris en charge la qualité de bicouche et le processus de fusion. Les premiers travaux a fait usage de LTTS planes qui ont été directement pris en charge sur un verre ou de quartz substrat 15-17. Ces LTTS ont été faites par adsorption, à l&#39;éclatement d&#39;étalement et de la fusion des membranes du t-SUV sur le substrat. Il a été vite rendu compte, cependant, que l&#39;omission d&#39;un élément clé t-SNARE, SNAP25, de LTTS préparés de cette manière a donné lieu à v-SUV accueil et fusion cinétique indistinguishable de ceux obtenus en utilisant la complète t-SNAREs 17. Parce que SNAP25 est absolument nécessaire pour la fusion in vivo 30,31, la pertinence physiologique de ces premières tentatives a été mis en question. Le groupe de Tamm a surmonté ce défi en utilisant mieux contrôlé appuyé la formation de bicouche 21. Il a utilisé un dépôt de Langmuir-Blodgett , pour la première plaquette exempt de protéines du SBL, suivi par la fusion de cette monocouche avec des T-SUV 21. Cela a abouti à la fusion SNAP25-dépendante. Afin d&#39; éviter des artefacts potentiels associés à un bi - couche directement supporté sur un substrat de verre sans qu&#39;il soit nécessaire d&#39;utiliser des méthodes de Langmuir-Blodgett, Karatekin et al. , A présenté un poly hydraté (éthylène glycol) (PEG) amortit entre la double couche et le substrat 24. Cette modification a aussi entraîné SNAP25 dépendant fusion 24. Bicouches rembourrées sur une couche de polymère mou avaient été connus pour mieux préserver transmembranairela mobilité de la protéine et de la fonction 32, et ont été utilisées dans des études de fusion avec 33 les virus. En outre, les bicouches PEGylés semblent conserver une certaine capacité d&#39;auto-guérison et sont très robustes 34,35. Tout d&#39;abord, une fraction de disponibles dans le commerce, les chaînes de PEG lipidiques liées sont inclus dans la membrane t-SUV. Lorsque ces T-VUS éclatent et forment une bicouche plane sur un substrat de verre, une brosse PEG couvre les deux feuillets de la bicouche planaire. Comme la formation de bicouches plane est entraînée par adhérence des chaînes de PEG entourant t-SUV sur la surface du verre hydrophile, d&#39;un liposome éclatement et la formation de deux couches planes sont relativement insensibles à la composition lipidique utilisée. Cependant, lorsque de grandes quantités de cholestérol sont inclus, ce qui augmente les propriétés de cohésion des VUS, les VUS ne peuvent pas éclater spontanément. Si tel est le cas, les ions divalents ou choc osmotique peuvent être utilisés pour aider à la formation de deux couches planes 25. Comme il est mentionné ci-dessus, dans la présente apapproche une brosse PEG couvre les deux côtés de la plane, soutenue bicouche. La brosse en face du canal d&#39;écoulement microfluidique aide à prévenir l&#39;adhérence non spécifique de v-VUS entrants qui sont aussi généralement recouvertes d&#39;une couche de PEG. Formation de complexes V- et t-SNARE commence à partir de l&#39; extrémité N-terminales et procède à la membrane distale progressivement vers les domaines de la membrane proximale 36. Pour les v-VUS d&#39;interagir avec le t-SBL, le v- et le besoin t-SNARE N-terminales pour faire saillie au-dessus des brosses PEG, ce qui semble être le cas dans les conditions de l&#39;essai. La hauteur de brosse peut être adapté à l&#39; étude des protéines autres que SNAREs en faisant varier la densité des lipides pégylés et la longueur de la chaîne de PEG 37,38. Un autre avantage des brosses PEG couvrant les surfaces proximales des bicouches de fusion est qu&#39;ils imitent l&#39;environnement encombré des membranes biologiques qui sont emballés avec 30.000-40.000 protéines membranaires intégrales par micron carré 39. Tout comme les chaînes de PEG dans cet essai, le repulsive couche de protéines portant sur des membranes biologiques doit être mis de côté pour permettre un contact entre les deux bicouches phospholipidiques pour la fusion se produise. des canaux d&#39;écoulement fluidiques sont utilisés dans ce test, car ils offrent des avantages uniques. Tout d&#39;abord, le flux microfluidique permet un dépôt plus uniforme de t-VUS à se répandre et fusible pour former le t-SBL. Deuxièmement, le petit volume de canal (&lt;1 pi) minimise la consommation d&#39;échantillon. Troisièmement, les petits volumes requis permettent à l&#39;ensemble de l&#39;expérience effectuée en vertu du débit constant. Débit supprime faiblement, probablement non spécifique, adhéré v-VUS de la SBL 16. Il maintient également une densité constante de v-VUS au- dessus du t-SBL, ce qui simplifie l&#39; analyse cinétique 17. Enfin, les vésicules accostés se distinguent facilement de celles qui sont libres portés par le flux 25. Quatrièmement, plusieurs canaux microfluidiques peuvent être utilisés sur le même lamelle, sonder chacun un état différent. Ceci permet la comparaison des conditions during le même essai expérimental. Une approche similaire a été utilisée par le groupe van Oijen pour étudier la fusion entre le virus de la grippe et LTTS rembourrées 33. En microscopie TIRF, la décroissance exponentielle du champ évanescent (avec une constante de désintégration ~ 100 nm) confine l&#39;excitation de fluorescence à ces molécules qui sont très près de l&#39;interface verre-tampon. Cela réduit la contribution des molécules fluorescentes qui sont plus loin, augmente le rapport signal-bruit, et permet une sensibilité molécule unique avec des temps d&#39;exposition de vues de 10-40 msec. Le champ évanescent conduit également à une augmentation du signal lors de la fusion: le transfert marqué des lipides du SUV dans la SBL, ils se trouvent, en moyenne, dans un champ d&#39;excitation plus forte. Cette augmentation de la fluorescence est plus forte pour les grands liposomes. Si la lumière polarisée est utilisée pour générer le champ évanescent, d&#39;autres effets contribuent à des changements de fluorescence lors de la transfert des étiquettes du SUV dans la SBL. Certains colorants lipidiques ont un dipôle de transition orienté avec un angle moyen préféré par rapport à la double couche dans laquelle elles sont incorporées. Cela crée une différence dans la quantité de fluorescence émise par les fluorophores quand ils sont dans le SUV par rapport à la SBL, étant donné que le faisceau polarisé excitera les colorants dans les deux membranes différentes. Pour les premiers, le faisceau d&#39;excitation va interagir avec dipôles de transition orientés autour du SUV sphérique, alors que pour ce dernier, les orientations dipolaires seront limitées par la géométrie SBL plat. Par exemple, quand on utilise de lumière polarisée incidente (polarisation perpendiculaire au plan d&#39;incidence), l&#39; excitation est plus efficace lorsque le colorant est dans la SBL que dans le SUV à un lipide colorant transition dipôle orienté parallèlement à la membrane 29,40 (comme celui de Dil ou DiD 41-43). Un SUV dopé avec un tel fluorophore apparaît dim quand il docks sur la SBL (Figure 7, représentat<html> ive résultats). Comme un pore de fusion ouvre et relie les membranes de SUV et SBL, les sondes fluorescentes diffusent dans la SBL et deviennent plus susceptibles d&#39;être excités par le champ évanescent 25,27,29 polarisée s. Par conséquent, le signal de fluorescence intégrée autour du site de fusion augmente fortement au cours du transfert de colorant depuis le SUV dans la (figure 7 et figure 3) SBL 27. Un autre facteur qui contribue à signaler des changements qui l&#39;accompagnent fusion est dequenching de marqueurs fluorescents tels qu&#39;ils sont dilués lorsqu&#39;ils sont transférés dans le SBL. La contribution de dequenching est généralement mineure par rapport aux effets évanescents de décroissance du champ et de polarisation dans l&#39;essai décrit ici, car seule une petite fraction ( <img alt="L&#39;équation 1" src="/files/ftp_upload/54349/54349eq1.jpg" /> ) Des lipides sont marqués. L&#39;augmentation du signal lors de la fusion peut être exploitée pour déduire des propriétés de fusion des pores en comparant le temps,1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54349 / 54349eq2.jpg &quot;/&gt;, requis pour un lipide pour échapper à travers un pore qui est librement perméable aux lipides à l&#39;instant réel de libération, <img alt="L&#39;équation 1" src="/files/ftp_upload/54349/54349eq3.jpg" /> . Si les deux échelles de temps sont comparables, on en conclut que le pore présente une faible résistance à l&#39;écoulement des lipides. Toutefois, si le temps de libération réelle est beaucoup plus longue que le temps pour la libération de diffusion limitée, cela indiquerait un processus, tels que les pores vacillement, retardant la libération des lipides. Le temps de libération limitée par diffusion, <img alt="L&#39;équation 1" src="/files/ftp_upload/54349/54349eq2.jpg" /> , Dépend de la taille du liposome de fusion et de lipides diffusivité; son estimation exige que ces deux paramètres à quantifier. La sensibilité seule molécule de l&#39;essai permet lipidique diffusivité à mesurer au moyen de plusieurs fluorophores unique de lipides après leur libération dans la SBL pour chaque événement de fusion 26. La taille de chaque vésicule fusionpeut être estimée 27 en combinant : (i) l&#39;intensité d&#39;un colorant unique de lipides, (ii) la modification de la fluorescence totale autour d&#39; un site d&#39;accueil après que tous les fluorophores sont transférés dans la SBL lors de la fusion, (iii) la densité de marquage connu de SUV les lipides, et (iv) la surface par lipide. Pour de nombreux événements de fusion, les temps des lipides de libération réels se sont révélés être beaucoup plus lent que prévu par la diffusion à libération contrôlée 27, comme cela a été indiqué précédemment en supposant que la taille de SUV uniforme 44. En supposant un retard de lipide libération est due à des pores de scintillement, un modèle quantitatif permet d&#39; estimer « l&#39; ouverture des pores&quot;, la fraction du temps le pore reste ouvert pendant la fusion 27. À chaque fois que possible, il est important de tester les mécanismes de fusion en utilisant à la fois solubles dans les lipides et les contenus des étiquettes. Par exemple, le lipide libération pourrait être retardée par des procédés autres que le scintillement des pores, telles que la restriction de la diffusion des lipides par les protéines SNARE qui entourent til pore. Si tel était le cas, alors la libération de contenus précéderait libération des étiquettes lipidiques, à condition que le pore est assez grand pour permettre le passage de sondes solubles. Une faille plus fondamentale dans l&#39;approche pourrait être dans l&#39;hypothèse que le transfert des lipides marqués à la SBL se produit à travers une fusion étroite pores reliant la SBL à une vésicule qui a conservé en grande partie sa forme pré-fusion. Transfert de Lipid dans le SBL pourrait également résulter de la dilatation rapide du pore de fusion avec une concomitante, extrêmement rapide effondrement du SUV dans la membrane SBL, comme précédemment suggéré sur la base de données des lipides de libération seuls 29. Contrôler à la fois des lipides et le contenu de libérer en même temps, on a constaté que de nombreux pores refermés après libération de leurs marqueurs de lipides, mais a conservé une partie de leur cargaison soluble 27. Ceci indique qu&#39;au moins certains des liposomes ne fusionnent pas dans la SBL après la fusion, et que le transfert des lipides de colorant dans le SBL se produit à travers un pore de fusion. En outre, lipid et le contenu de presse a eu lieu simultanément 27, ce qui rend peu probable que le retard de lipide libération était due à l&#39; entrave de la diffusion des lipides par les protéines SNARE entourant le pore 45. Un protocole de fusion SUV-SBL qui ne surveille pas le contenu soluble communiqué a été publié par Karatekin et Rothman 25. Ici, des développements plus récents sont inclus, la surveillance soit simultanée des teneurs en lipides et libèrent et l&#39; estimation des propriétés SUV, lipides, et la fusion des pores 27. Le protocole commence avec des instructions pour la préparation des cellules microfluidiques, réalisés par collage d&#39; un poly (diméthylsiloxane) , des rainures (PDMS) élastomère à blocs contenant une lamelle de verre 25. Ensuite, la préparation de v-SUV à la fois avec les lipides et le contenu des marqueurs est expliqué. Les articles 4 et 5 fournissent des instructions pour l&#39; assemblage des cellules microfluidiques, formant les LTTS in situ et la vérification des défauts et la fluidité, l&#39; introduction de vSUVS dans les cellules d&#39;écoulement et la détection d&#39;événements de fusion. Section 6 fournit des instructions pour l&#39;analyse des données.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q (MQ) water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3040-05</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 190 Proof</td>
			<td>Decon</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A416P4</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td rowspan="3">AmericanBio</td>
			<td>AB00892</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cholride (KCl)</td>
			<td>AB01915</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>AB00490</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-[2-hydroxyethyl] piperazine-N&#39;-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES)</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB00892</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>409911000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES-KOH buffer (pH 7.4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25 mM HEPES-KOH, 140 mM KCl, 100 &#956;M EGTA, 1 mM DTT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform&#160;</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9180-01</td>
			<td>in glass bottle, CAUTION, wear PPE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9070-03</td>
			<td>in glass bottle, CAUTION, wear PPE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liposome preparation&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>var. sizes</td>
			<td>only use glass sringe with solents (Chlorophorm/ Methanon, 2:1, v/v)</td>
			<td><a href="http://www.hamiltoncompany.com/">http://www.hamiltoncompany.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tubes Pyrex Vista 11 ml, 16x100 mm screw cap culture tube</td>
			<td>Pyrex&#160;</td>
			<td>70825-16</td>
			<td>clean thoroughly, rinse with chloroform</td>
			<td><a href="http://catalog2.corning.com/LifeSciences/">http://catalog2.corning.com/LifeSciences/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 16:0-18:1 PC (POPC)</td>
			<td rowspan="7">Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457</td>
			<td rowspan="7">Lipids come dissolved in CHCl3 or as lyphilized powder in sealed vials. Aliquot upon opening. Store extra as dried lipid films under inert atmosphere at -20 &#176;C. Keep stocks in CHCl3/MeOH (2:1, v/v) at -20 &#176;C. let come to RT before opening</td>
			<td rowspan="7"><a href="http://www.avantilipids.com/">http://www.avantilipids.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt), 18:1 PS (DOPS)</td>
			<td>840035</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-stearoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 18:0-20:4 PE (SAPE)</td>
			<td>850804</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt), Brain PI(4,5)P2</td>
			<td>840046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt), 18:1 NBD PE</td>
			<td>810145</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt), 18:1 PEG2000 PE</td>
			<td>880130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholesterol (ovine wool, &#62;98%)</td>
			<td>700000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiD&#39; oil; DiIC18(5) oil (1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindodicarbocyanine Perchlorate)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>D-307</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/">https://www.thermofisher.com/&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotavapor R-210</td>
			<td>Buchi</td>
			<td>R-210</td>
			<td>heat bath above Tm of lipids used</td>
			<td><a href="http://www.buchi.com/">http://www.buchi.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OG n-Octyl-&#946;-D-Glucopyranoside</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>0311</td>
			<td>store at -20&#176;C, let come to RT before opening</td>
			<td><a href="https://www.anatrace.com/">https://www.anatrace.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker - Eppendorf Thermomixer R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.eppendorf.com/">https://www.eppendorf.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyze Dialysis Cassettes, 20K MWCO, 3 mL</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>66003</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/">https://www.lifetechnologies.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Beads SM-2 Adsorbents</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1523920</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep&#160;Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifugation tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 x 89 mm&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>41121703</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.beckmancoulter.com/">https://www.beckmancoulter.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman SW41 Ti rotor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuflorhodamineB</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S-1307</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/">https://www.thermofisher.com/&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Column&#160;Chromatography Columns, 2.5 &#215; 10 cm</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7372512</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose CL-4B</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0150-01</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.gelifesciences.com/">http://www.gelifesciences.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Orange Protein Gel Stain</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S-6650</td>
			<td>5,000X Concentrate in DMSO</td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/">https://www.lifetechnologies.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone elastomer kit, PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.dowcorning.com/">http://www.dowcorning.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex glass petri dish, 150 x 20 mm, complete with cover</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3160-152</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://catalog2.corning.com/LifeSciences/">http://catalog2.corning.com/LifeSciences/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole puncher - Reusable Biopsy Punch, 0.75mm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504529</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.wpi-europe.com/">http://www.wpi-europe.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Hole Punching Machine&#160;</td>
			<td rowspan="2">SYNEO</td>
			<td>MHPM-UNV</td>
			<td></td>
			<td rowspan="2">http://www.syneoco.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill .035 x .026 x 1.5 304 SS TiN coated round punch</td>
			<td>CR0350265N20R4</td>
			<td>drill diameter: 0.9 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Microbore tubing, 0.25 mm ID, 0.76 mm OD</td>
			<td rowspan="2">Cole-Parmer</td>
			<td>06419-00</td>
			<td>0.010&#34; ID, 0.030&#34; OD</td>
			<td rowspan="2"><a href="http://www.coleparmer.com/">http://www.coleparmer.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Tubing (0.51 mm ID, 2.1 mm OD</td>
			<td>95802-00</td>
			<td>0.020&#34; ID, 0.083&#34; OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass -&#160; cleanroom cleaned</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schott Nexterion cover slip glass D</td>
			<td>Schott</td>
			<td>1472305</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.us.schott.com/">http://www.us.schott.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasma cleaner</td>
			<td>Harrick</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://harrickplasma.com/">http://harrickplasma.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTIRF setup and accessories</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX81 microscope body</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.olympus-lifescience.com/en/">http://www.olympus-lifescience.com/en/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM CCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>ixon-ultra-897</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.andor.com/">http://www.andor.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Plate, heated microscope stage</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>MATS-U52RA26</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.tokaihit.com/">http://www.tokaihit.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml hamilton glass syringes (4x)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81365</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.hamiltoncompany.com/">http://www.hamiltoncompany.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe pump</td>
			<td>kd Scientific</td>
			<td>KDS-230</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.kdscientific.com/">http://www.kdscientific.com/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

snare-mediated fusion of single proteoliposomes with tethered supported bilayers in a microfluidic flow cell monitored by polarized tirf microscopy

Dans le procédé omniprésent de fusion membranaire de l&#39;ouverture d&#39;un pore de fusion établit la première liaison entre les deux compartiments séparés auparavant. Pendant neurotransmetteur ou la libération d&#39;hormones par exocytose, le pore de fusion peut et fermer à plusieurs reprises, la régulation cargaison cinétique de libération transitoirement ouverts. la dynamique de Pore déterminent également le mode de recyclage des vésicules; Résultats de réapposition de sceau irréversibles transitoire fusion, &quot;kiss-and-run&quot;, alors que la dilatation conduit à pleine fusion. Pour mieux comprendre les facteurs qui régissent la dynamique des pores, nous avons développé un test pour contrôler la fusion membranaire en utilisant polarisée totale fluorescence à réflexion interne (FRBR) microscopie avec une sensibilité seule molécule et ~ 15 résolution temporelle msec dans un biochimiquement bien défini dans le système in vitro. Fusion de marquée par fluorescence de petites vésicules unilamellaires contenant des protéines v-v-SNARE (SUV) avec une double couche plane portant le t-SNARE, supporté sur un coussin de polymère mou (t-SBL, t-supporté bicouches) Est surveillée. Le test utilise des canaux d&#39;écoulement microfluidiques qui assurent la consommation minimale de l&#39;échantillon tout en fournissant une densité constante de VUS. Exploiter le signal amélioration rapide lors du transfert d&#39;étiquettes lipidiques du SUV à la SBL lors de la fusion, la cinétique de transfert lipidique de colorant est surveillée. La sensibilité de la microscopie TIRF permet de suivre simples étiquettes lipidiques fluorescentes, à partir de laquelle des lipides diffusivité et la taille SUV peuvent être déduites pour chaque événement de fusion. Lipid fois colorant de libération peuvent être beaucoup plus longtemps que prévu pour le passage sans entrave à travers les pores ouverts en permanence. L&#39;utilisation d&#39;un modèle qui suppose un retard de lipide libération est due à des pores de scintillement, un pore «ouverture», la fraction du temps le pore reste ouvert pendant la fusion, peut être estimée. Un marqueur soluble peut être encapsulé dans les VUS pour la surveillance simultanée des lipides et de la libération de la cargaison soluble. Ces mesures indiquent des pores peuvent reboucher après avoir perdu une partie de la cargaison soluble.

qualité SBL Il est crucial de vérifier la qualité et la fluidité du SBL avant l&#39;expérience de fusion. La fluorescence sur le côté inférieur, le verre d&#39;un canal microfluidique doit être uniforme, sans défauts apparents. Si une bulle d&#39;air passe à travers le canal, il laisse généralement des cicatrices visibles sur le SBL. S&#39;il y a de telles grandes cicatrices d&#39;échelle / défa...

Watch this Scientific Journal Video about SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy at JoVE.co

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

Ici, nous présentons un protocole pour détecter un seul, les événements de fusion SNARE médiation entre liposomes et bicouches pris en charge dans des canaux microfluidiques utilisant TIRFM polarisée, avec une sensibilité et une seule molécule ~ 15 résolution temporelle msec. Lipid et la libération de la cargaison soluble peuvent être détectés simultanément. la taille des liposomes, des lipides diffusivité et la fusion des pores propriétés sont mesurées.

Fusion SNARE-médiée de Single protéoliposomes avec bicouches supportées Tethered dans une cellule microfluidique débit contrôlé par Polarized FRBR Microscopie

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Single Cell Measurement of Dopamine Release with Simultaneous Voltage-clamp and Amperometry

Mesure Single Cell de la libération de dopamine avec Voltage-clamp simultanée et Amperometry

After its release into the synaptic cleft, dopamine exerts its biological properties via its pre- and post-synaptic targets1. The dopamine signal is ...

Recherche

Neurosciences

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Marquage fluorescent rétrograde Permet ciblée extracellulaire seule unité d&#39;enregistrement de neurones identifiés<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

D&#39;enregistrement optique de l&#39;activité neuronale supraliminaire avec une résolution à cellule unique et un seul pic

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

In Vivo microscopie à deux photons de terminaisons nerveuses dans la peau simples

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

Préparation de neurones co-cultures avec l&#39;unité portable de précision

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Induire la plasticité de Astrocytic récepteurs neuronaux par manipulation des taux de combustion

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

A Simple Flight Mill for the Study of Tethered Flight in Insects

A Mill vol simple pour l&#39;étude du vol captif chez les insectes

Flight in insects can be long-range migratory flights, intermediate-range dispersal flights, or short-range host-seeking flights. Previous studies have ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

Analyse des cellules immunitaires dans unique des nerfs sciatique et Ganglion de la racine dorsale d’une souris à l’aide de cytométrie en flux

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers

Bicouche lipidique expérimente le Contact bulle bicouches pour Patch-colliers

Lipid bilayers provide a unique experimental platform for functional studies of ion channels, allowing the examination of channel-membrane interactions ...

Three-dimensional Navigation-guided, Prone, Single-position, Lateral Lumbar Interbody Fusion Technique

Technique de fusion intercorporelle lombaire latérale guidée par navigation tridimensionnelle, couchée, couchée,

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