Name: snare-mediated fusion of single proteoliposomes with tethered supported bilayers in a microfluidic flow cell monitored by polarized tirf microscopy
Uploaded: 2016-08-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy at JoVE.co

We thank Vladimir Polejaev (Yale West Campus Imaging Core) for the design and construction of the polarized TIRF microscope, David Baddeley (Yale University) for help with two-color detection instrumentation, and James E. Rothman (Yale University) and Ben O'Shaughnessy (Columbia University) and members of their groups for stimulating discussions. EK is supported by a Kavli Neuroscience Scholar Award from the Kavli Foundation and NIH grant 1R01GM108954.

1. Herstellung eines PDMS-Block der mikrofluidischen Kanal zu bilden <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54349/54349fig1.jpg" /> Abbildung 1. Mikrofertigung von Flusszelle Vorlage und PDMS Satzvorbereitung. (A) Entwurf eines Vier-Kanal - Durchflusszelle , die auf einem 24 x 60 mm Deckglas passt (unten). Sechs identische Entwürfe sind so angeordnet, auf ein 10 cm Silizium-Wafer passen (oben). (B) ausschneiden Bl...

Die erfolgreiche Umsetzung des SUV-SBL Fusionstest hier beschrieben hängt entscheidend von mehreren wichtigen Schritten, wie funktionelle Rekonstitution von Proteinen in Liposomen, gute Qualität SBLS zu erhalten, und die Wahl der richtigen Abbildungsparameter einzelner Moleküle zu detektieren. Obwohl es einige Zeit und Mühe in Anspruch nehmen , um zu folgen, sobald der Test erfolgreich durchgeführt wird, liefert es eine Fülle von Informationen über den Schweißvorgang nicht bei jedem anderen in vitro Fus...

Die Membranfusion ist ein universeller biologischer Prozess , die für intrazellulären Transport von Lipiden und Proteinen, Sekretion, Befruchtung, Entwicklung und umhüllte Virus den Eintritt in die Wirtsorganismen 1-3. Für die meisten intrazellulären Fusionsreaktionen einschließlich der Freisetzung von Hormonen und Neurotransmittern über Exozytose, die Energie zwei Lipid - Doppelschichten zu verschmelzen wird durch die Bildung eines Vier-Helix - Bündel von cognaten löslichen N-Ethylmaleimid-sensitive Faktor Attachment - Protein - Rezeptor (SNARE) Proteine ​​zur Verfügung gestellt, verankert in das Vesikel (v-SNARE) und die Zielmembran (t-SNARE) 4. Synaptischen Vesikel Exocytose ist die streng reguliert Fusionsreaktion und tritt innerhalb einer Millisekunde nach der Ankunft eines Aktionspotentials 1,4,5. Die Fusionspore, die erste Verbindung zwischen den beiden Verschmelzen Fächer, flackern offen und geschlossen mehrere Male vor der Wiederverschließung oder irreversibel 5-7 erweitert. Die bisherigen Ergebnissein transient, &quot;Kiss &amp; run&quot; Fusion, während Letzteres führt zur vollständigen Fusion. Faktoren , die die Balance zwischen diesen beiden Modi der Fusion regeln und Mechanismen Poren Flimmern Regulierung sind nicht gut 5,8 verstanden. SNARE-Proteine ​​sind für die Exocytose erforderlich; synaptischen Vesikel Fusion 9 , bei der Spaltung von SNARE durch Neurotoxine abgeschafft. Bulk - Fusionsexperimente mit kleinen unilamellaren Vesikeln (SUVs) haben gezeigt , dass SNAREs sind nicht nur erforderlich, sondern auch eine ausreichende Membranfusion 10 zu fahren. In diesem bulk Assay mit v-SNARE rekonstituiert SUVs (v-SUV) wurden mit fluoreszierenden Phospholipide (N dotiertem - (7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) -phosphoethanolamine (NBD-PE) und ( N -. (Lissamins Rhodamin B sulfonyl) -phosphoethanolamine (LR-PE) und gemischt mit nicht - markierten Vesikeln t-SNAREs (t-SUV) Zunächst wird die Fluoreszenz von NBD-PE in v-SUVs wird abgeschreckt durch Förster - Resonanzenergietransfer (FRET enthaltend ) zu LR-PE. Da LaborELED v-SUVs Sicherung mit unmarkiertem t-SUVs, das Fluorophor Oberflächendichte in der nun kombinierten Membran reduziert wird und die sich ergebende Erhöhung der NBD-PE - Fluoreszenz berichtet , um das Ausmaß der Lipid - 10 gemischt wird . Da der Groß Assay einfach einzurichten und zu analysieren ist, wurde es allgemein zu untersuchen Mechanismen der SNARE-vermittelte Fusion 10-14 verwendet. Allerdings hat es einige Einschränkungen, wie niedrige Empfindlichkeit und schlechte Zeitauflösung. Am wichtigsten ist, als Ensemble-Messung, mittelt Ergebnisse aller Ereignisse zwischen docking und Fusion sowie Detektion von hemifusion Zwischenprodukte erschwert Diskriminierung. In den letzten zehn Jahren mehrere Gruppen, darunter auch unsere, haben neue Assays entwickelt , um Fusionsereignisse an der einzelnen Vesikel Ebene 15-27 überwachen. Ha und Kollegen verwendeten V-SUVs auf eine Oberfläche gebunden und überwacht ihre Fusion mit kostenlosen T-SUVs 18,19. Lipidmischung wurde unter Verwendung von FRET zwischen einem Paar von Lipid-gebundenen Fluorophoren überwacht emin der v- und T-SUVs bett jeweils 18 Totalreflexions - Fluoreszenz (TIRF) Mikroskopie. Später benutzte Brunger Labor eine einzige Lipid-Label - Spezies zusammen mit einem Inhalt Marker für die simultane Detektion von Lipid und Inhalt 20,28 mischen. Sowohl das Lipid und die Inhalte Marker wurden bei hohen, selbstlöschenden Konzentrationen enthalten sind; Fusion mit unmarkierten SUVs führte Fluoreszenz Dequenching 20,28. Andere haben fusioniert v-SUVs auf planaren Doppel Rekonstitution mit t-SNAREs 15-17,21-27,29. Die planare Geometrie des Targets (t-SNARE enthält) bilayer besser imitiert die physiologische Fusionsprozess von kleinen, stark gekrümmten Vesikel mit einer flachen Plasmamembran. Die Steinem Gruppe poren Spanning Membranen rekonstituiert mit t-SNAREs, suspendiert über ein poröses Siliciumnitridsubstrats und detektiert Fusion mit einzelnen V-SUVs mit der konfokalen Laser - Scanning - Mikroskopie 23 eingesetzt. Andere fgebrauchte v-SUVs zu planar bilayers mit t-SNAREs rekonstituiert, auf einem Glassubstrat 15-17,21,22,24-27,29 unterstützt. Der große Vorteil bei der Verwendung unterstützt Bilayer (SBLS) ist, dass die TIRF-Mikroskopie verwendet werden können, Docking und Fusionsereignisse mit hervorragenden Signal-Rausch-Verhältnis und ohne Interferenz von freiem V-SUVs zu erkennen, obwohl auch Einzelereignis Mikrofluidik mit Auflösung bietet mit Standard Fernfeld - Epifluoreszenzmikroskopie 24. Ein wichtiges Anliegen ist, ob und wie Substrat-Wechselwirkungen Bilayer Bilayer Qualität und den Fusionsprozess unterstützt Affekt. Frühe Arbeiten gemacht Verwendung von planaren SBLS , die auf einem Glas- oder Quarzsubstrat 15-17 direkt unterstützt wurden. Diese SBLS wurden durch Adsorption hergestellt, bersten, Aufstreichen und Fusion von T-SUV Membranen auf dem Substrat. Es wurde jedoch bald erkannt, dass ein Schlüssel t-SNARE-Komponente weggelassen, SNAP25 aus SBLS auf diese Weise hergestellten führte V-SUV Andocken und Fusion Kinetik indistinguisHable von denen 17 mit der kompletten t-SNAREs erhalten. Da SNAP25 absolut für die Fusion in vivo 30,31 erforderlich ist, wurde die physiologische Relevanz dieser frühen Versuche in Frage gestellt. Tamm Gruppe überwanden diese Herausforderung durch eine bessere Verwendung von 21 unterstützten Doppelschichtbildung gesteuert. Es verwendete Langmuir-Blodgett - Abscheidung für die proteinfreie erste Beilage des SBL, gefolgt von der Fusion von dieser Monoschicht mit t-SUVs 21. Dies resultierte in SNAP25 abhängigen Fusion. Potentielle Artefakte mit einer Doppelschicht direkt unterstützt auf einem Glassubstrat ohne die Notwendigkeit zu verwenden , Langmuir-Blodgett - Verfahren, zu vermeiden, Karatekin et al. Eingeführt einem weichen, hydratisierten Poly (ethylenglycol) (PEG) Polsters zwischen der Doppelschicht und dem Substrat 24. Diese Änderung führte auch in SNAP25 abhängigen Fusion 24. Doppelschichten auf einer Schicht weichen Polymer abgefedert war bekannt Trans besser zu bewahrenProtein Mobilität und Funktion 32, und hatte in der Fusionsstudien mit Viren 33 verwendet. Zusätzlich PEGylierten bilayers scheinen gewisse Fähigkeit zur Selbstheilung und sind sehr robust 34,35 zu halten. Zunächst wird eine Fraktion des handelsüblichen, Lipid-gebundenen PEG-Ketten sind in der t-SUV-Membran enthalten. Wenn diese t-SUVs bersten und eine planare Doppelschicht auf einem Glassubstrat bildet, erstreckt sich ein PEG brush beide Blättchen der planaren Bilayer. Weil planaren Doppelschichtbildung durch Anhaften der PEG-Ketten umgebenden t-SUVs auf die hydrophile Glasoberfläche, Liposom Berst- und planaren Doppelschichtbildung sind relativ unempfindlich gegenüber der Lipidzusammensetzung eingesetzt angetrieben wird. Wenn jedoch große Mengen an Cholesterin enthalten sind, die Kohäsionseigenschaften der SUVs zu erhöhen, können die SUVs nicht spontan platzen. Wenn dies der Fall ist, kann osmotischen Schock oder zweiwertige Ionen eingesetzt werden 25 planar Doppelschichtbildung zu helfen. Wie oben erwähnt, in diesem apsatz eine PEG-Bürste auf beiden Seiten des ebenen umfasst, supported bilayer. Die Bürste den mikrofluidischen Strömungskanal zugewandt hilft unspezifischen Adhäsion von eingehenden v-SUVs zu verhindern, die sich auch in der Regel mit einer PEG-Schicht bedeckt. Die Bildung von v- und T-SNARE - Komplexen geht von der Membran-distalen N-Termini und verläuft in Stufen in Richtung der Membran-proximalen Domänen 36. Für die V-SUVs mit dem t-SBL, die v- und t-SNARE N-Termini Notwendigkeit vorzustehen über den PEG Bürsten zu interagieren, was der Fall unter den Bedingungen des Assays zu sein scheint. Bürstenhöhe können an andere Proteine ​​als SNAREs studieren angepasst werden , indem die Dichte von PEGyliertem Lipiden variierende und die PEG - Kettenlänge 37,38. Ein weiterer Vorteil der PEG - Bürsten die proximalen Oberflächen der Fusionieren Bilayer bedeckt , ist , dass sie die überfüllten Umgebung von biologischen Membranen imitieren , die mit 30.000-40.000 integrale Membranproteine ​​pro Quadratmikrometer 39 verpackt werden. Genau wie die PEG-Ketten in diesem Assay die repulsive Proteinschicht, die biologischen Membranen muss gedrückt werden, zur Seite für den Kontakt zwischen den beiden Phospholipiddoppelschichten zu ermöglichen für die Fusion auftritt. Mikrofluidischen Strömungskanäle werden in diesem Test verwendet, da sie einzigartige Vorteile bieten. Erstens ermöglicht mikrofluidischen Strömungs einheitlichere Abscheidung von T-SUVs zu verbreiten und Sicherung der t-SBL zu bilden. Zweitens ist die kleine Kanalvolumen (&lt;1 &amp; mgr; l) minimiert Probenverbrauch. Drittens benötigt die kleinen Volumina ermöglichen das gesamte Experiment unter konstanten Fluss durchgeführt werden. Fluss entfernt schwach, vermutlich nicht spezifisch haftete v-SUVs von der SBL 16. Es unterhält auch eine konstante Dichte von v-SUVs über dem t-SBL, kinetische Analyse zu vereinfachen 17. Schließlich werden dockt Vesikel aus kostenlos sind durch die Strömung 25 durch leicht zu unterscheiden. Viertens mehrere mikrofluidische Kanäle auf dem gleichen Deckglas verwendet werden, die jeweils einen anderen Zustand Sondieren. Dies ermöglicht den Vergleich der Bedingungen during der gleichen Versuchslauf. Ein ähnlicher Ansatz wurde von der van Oijen Gruppe verwendet Fusion zwischen Influenza - Virus zu studieren und gepolsterten SBLS 33. In TIRF Mikroskopie, das exponentielle Abklingen des evaneszenten Feldes (mit einer Zerfallskonstante ~ 100 nm) Fluoreszenzanregung beschränkt auf diejenigen Moleküle, die in unmittelbarer Nähe der Glaspufferschnittstelle sind. Dies minimiert Beitrag von fluoreszierenden Molekülen, die weiter entfernt sind, erhöht das Signal-zu-Rauschverhältnis und erlaubt Einzelmolekülempfindlichkeit mit Rahmen Belichtungszeiten von 10-40 msec. Das abklingende Feld führt auch zu einem Signalanstieg beim Schmelzen: als markierter Lipide Transfer vom SUV in die SBL, finden sie sich im Durchschnitt in einer stärkeren Erregungsfeld. Dieser Anstieg in der Fluoreszenz ist für größere Liposomen stärker. Wenn polarisiertes Licht verwendet wird, das abklingende Feld zu erzeugen, tragen zusätzliche Effekte zu Veränderungen in der Fluoreszenz auf transfer von Etiketten aus dem SUV in die SBL. Einige Lipid-Farbstoffe haben einen Übergangsdipolmomente orientiert mit einem bevorzugten mittleren Winkel in Bezug auf die Doppelschicht in die sie eingebettet sind. Dies erzeugt eine Differenz in der Menge an Fluoreszenz , die durch die Fluorophore emittiert wird, wenn sie in der gegenüber dem SUV SBL sind, da die polarisierten Strahl Farbstoffe in den beiden Membranen unterschiedlich erregt wird. Für erstere wird der Anregungsstrahl mit Übergangsdipole interagieren um den sphärischen SUV orientiert, während für letztere Dipolorientierungen wird durch die flache SBL Geometrie beschränkt werden. Wenn beispielsweise s-polarisierte einfallende Licht (polarisiertes normal zur Einfallsebene) verwendet wird, ist Erregungs effizienter , wenn der Farbstoff in der SBL ist als im SUV für eine Lipidfarbstoff Übergangsdipolmomente parallel zu der Membran 29,40 (wie die von Dil oder DiD 41-43). Ein SUV mit einem solchen Fluorophor dotierten erscheint dunkler , wenn es Docks auf die SBL (Bild 7, Representat<html> ive Ergebnisse). Als Fusions Pore öffnet und verbindet die SUV und SBL Membranen diffundieren Fluoreszenzsonden in das SBL und werden eher durch den s-polarisierten abklingende Feld 25,27,29 angeregt werden. Folglich erhöht sich das Fluoreszenzsignal um die Fusionsstelle integriert scharf während der Farbstoffübertragung von dem SUV in die SBL 27 (Abbildung 3 und Abbildung 7). Ein zusätzlicher Faktor, der auf Signaländerungen trägt, die Fusions begleiten wird Dequenching von Fluoreszenzmarkierungen, wie sie verdünnt werden, wenn sie in die SBL übertragen. Der Beitrag der Dequenching ist üblicherweise gering im Vergleich zu abklingende Feld Zerfalls und Polarisationseffekte in dem Assay hier beschrieben, da nur ein kleiner Bruchteil ( <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/54349/54349eq1.jpg" /> ) Der Lipide sind markiert. Der Signalanstieg bei Fusion kann ausgenutzt werden, um Fusionsporeneigenschaften ableiten, indem sie die Zeit zu vergleichen,1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54349 / 54349eq2.jpg &quot;/&gt;, die für ein Lipid durch eine Pore zu entkommen, die frei durchlässig Lipide auf die tatsächliche Release-Zeit ist, <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/54349/54349eq3.jpg" /> . Wenn die beiden Zeitskalen vergleichbar sind, würde geschlossen werden, daß die Poren wenig Widerstand gegen Lipidfluss darstellt. Wenn jedoch die tatsächliche Auslösezeit wesentlich länger als die Zeit für die Diffusion begrenzte Freisetzung ist, wäre dies ein Verfahren zeigen, wie Poren Flackern, Lipid-Freisetzung zu verzögern. Die diffusionsbegrenzten Freigabezeit, <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/54349/54349eq2.jpg" /> , Hängt von der Größe des Schmelz Liposom und Lipid-Diffusionsvermögen; seine Schätzung erfordert diese beiden Parameter zu quantifizieren. Die Einzelmolekülempfindlichkeit des Assays ermöglicht Lipid Diffusität durch die Verfolgung mehrerer Einzellipid Fluorophore nach ihrer Freisetzung in die SBL für jedes Fusionsereignis 26 gemessen werden. Die Größe jedes Verschmelzen Vesikel27 durch die Kombination von (i) geschätzt werden , um die Intensität eines einzelnen Lipid Farbstoff kann, (ii) die Änderung der Gesamtfluoreszenz um eine Andockstelle nachdem alle Fluorophore in die SBL beim Schmelzen übertragen werden, (iii) die bekannte Markierungsdichte von SUV Lipide, und (iv) die Fläche pro Lipid. Für viele Fusionsereignisse wurden die tatsächlichen Lipid Freisetzungszeiten gefunden viel langsamer als 27 durch diffusionskontrollierte Freisetzung erwartet, wie zuvor einheitliche Größe SUV 44 unter der Annahme festgestellt wurde. Unter der Annahme , Verzögerung der Lipid - Freisetzung durch flackert Poren, ein quantitatives Modell ermöglicht Schätzung von &quot;Poren Offenheit&quot;, der Anteil der Zeit bleibt die Pore offen bei der Fusion 27. Wann immer praktisch, ist es wichtig, Fusionsmechanismen zu testen, unter Verwendung von sowohl Lipid und löslichen Inhalt Etiketten. Zum Beispiel könnte Lipid-Freisetzung durch andere Prozesse als die Poren Flackern, wie die Beschränkung der Lipid-Diffusion durch die SNARE-Proteine, die Surround-t verzögert werdener Pore. Wenn dies der Fall wäre, dann loslassen Inhalts würde Freisetzung von Lipid Etiketten voran, vorausgesetzt die Poren groß genug ist, Durchgang von löslichen Sonden zu ermöglichen. Ein grundlegender Fehler im Ansatz könnte in der Annahme sein, dass die Übertragung von markierten Lipide an die SBL einer engen Fusionspore erfolgt durch die SBL zu einem Vesikel anschließen, der seine Pre-fusion Form weitgehend erhalten hat. Lipid - Transfer in die SBL könnte auch mit einer begleitenden von einer schnellen Erweiterung der Fusionspore führen, extrem schnellen Zusammenbruch des SUV in die SBL - Membran, wie zuvor auf den Lipidfreisetzungsdaten allein 29 basierend vorschlug. Überwachung sowohl Lipid und Inhalt freigeben gleichzeitig wurde festgestellt , dass viele Poren wieder verschlossen , nachdem alle Etiketten ihre Lipid zu veröffentlichen, aber 27 einige ihrer löslichen Ladung erhalten. Dies zeigt, dass zumindest einige Liposomen in die SBL nicht nach dem Verschmelzen kollabieren, und daß die Lipidfarbstoffübertragung in die SBL Fusions Pore erfolgt durch. Zudem lIPID und Inhalt Release aufgetreten 27 gleichzeitig, ist es unwahrscheinlich , dass Verzögerung der Lipid - Release machen zurückzuführen war durch die SNARE - Proteine ​​von Lipiddiffusion Behinderung 45 der Pore umgibt. Ein SUV-SBL Fusionsprotokoll , die nicht löslichen Anteile Release überwachen tat , war zuvor von Karatekin und Rothman 25 veröffentlicht. Hier neuere Entwicklungen enthalten sind, nämlich die gleichzeitige Überwachung von Lipid und Inhalte freigeben und die Schätzung von SUV, Lipid und Fusionspore - Eigenschaften 27. Das Protokoll beginnt mit Anweisungen für die Mikrofluidik - Zellen vorbereitet, hergestellt durch ein Poly (dimethylsiloxan) Bindung (PDMS) Elastomerblock enthält Rillen mit einem Deckglas 25. Als nächstes Herstellung von v-SUVs mit sowohl Lipid und Inhalt Marker erläutert. Abschnitte 4 und 5 enthalten Anweisungen für die Mikrofluidik - Zellen zusammenbauen, die SBLS in situ Bildung und Überprüfung auf Defekte und Flüssigkeit, die Einführung von vSUVS in den Flusszellen und die Detektion von Fusionsereignissen. Abschnitt 6 enthält Anweisungen für die Datenanalyse.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q (MQ) water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3040-05</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 190 Proof</td>
			<td>Decon</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A416P4</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td rowspan="3">AmericanBio</td>
			<td>AB00892</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cholride (KCl)</td>
			<td>AB01915</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>AB00490</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-[2-hydroxyethyl] piperazine-N&#39;-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES)</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB00892</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>409911000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES-KOH buffer (pH 7.4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25 mM HEPES-KOH, 140 mM KCl, 100 &#956;M EGTA, 1 mM DTT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform&#160;</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9180-01</td>
			<td>in glass bottle, CAUTION, wear PPE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9070-03</td>
			<td>in glass bottle, CAUTION, wear PPE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liposome preparation&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>var. sizes</td>
			<td>only use glass sringe with solents (Chlorophorm/ Methanon, 2:1, v/v)</td>
			<td><a href="http://www.hamiltoncompany.com/">http://www.hamiltoncompany.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tubes Pyrex Vista 11 ml, 16x100 mm screw cap culture tube</td>
			<td>Pyrex&#160;</td>
			<td>70825-16</td>
			<td>clean thoroughly, rinse with chloroform</td>
			<td><a href="http://catalog2.corning.com/LifeSciences/">http://catalog2.corning.com/LifeSciences/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 16:0-18:1 PC (POPC)</td>
			<td rowspan="7">Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457</td>
			<td rowspan="7">Lipids come dissolved in CHCl3 or as lyphilized powder in sealed vials. Aliquot upon opening. Store extra as dried lipid films under inert atmosphere at -20 &#176;C. Keep stocks in CHCl3/MeOH (2:1, v/v) at -20 &#176;C. let come to RT before opening</td>
			<td rowspan="7"><a href="http://www.avantilipids.com/">http://www.avantilipids.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt), 18:1 PS (DOPS)</td>
			<td>840035</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-stearoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 18:0-20:4 PE (SAPE)</td>
			<td>850804</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt), Brain PI(4,5)P2</td>
			<td>840046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt), 18:1 NBD PE</td>
			<td>810145</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt), 18:1 PEG2000 PE</td>
			<td>880130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholesterol (ovine wool, &#62;98%)</td>
			<td>700000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiD&#39; oil; DiIC18(5) oil (1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindodicarbocyanine Perchlorate)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>D-307</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/">https://www.thermofisher.com/&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotavapor R-210</td>
			<td>Buchi</td>
			<td>R-210</td>
			<td>heat bath above Tm of lipids used</td>
			<td><a href="http://www.buchi.com/">http://www.buchi.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OG n-Octyl-&#946;-D-Glucopyranoside</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>0311</td>
			<td>store at -20&#176;C, let come to RT before opening</td>
			<td><a href="https://www.anatrace.com/">https://www.anatrace.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker - Eppendorf Thermomixer R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.eppendorf.com/">https://www.eppendorf.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyze Dialysis Cassettes, 20K MWCO, 3 mL</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>66003</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/">https://www.lifetechnologies.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Beads SM-2 Adsorbents</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1523920</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep&#160;Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifugation tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 x 89 mm&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>41121703</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.beckmancoulter.com/">https://www.beckmancoulter.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman SW41 Ti rotor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuflorhodamineB</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S-1307</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/">https://www.thermofisher.com/&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Column&#160;Chromatography Columns, 2.5 &#215; 10 cm</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7372512</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose CL-4B</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0150-01</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.gelifesciences.com/">http://www.gelifesciences.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Orange Protein Gel Stain</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S-6650</td>
			<td>5,000X Concentrate in DMSO</td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/">https://www.lifetechnologies.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone elastomer kit, PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.dowcorning.com/">http://www.dowcorning.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex glass petri dish, 150 x 20 mm, complete with cover</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3160-152</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://catalog2.corning.com/LifeSciences/">http://catalog2.corning.com/LifeSciences/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole puncher - Reusable Biopsy Punch, 0.75mm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504529</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.wpi-europe.com/">http://www.wpi-europe.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Hole Punching Machine&#160;</td>
			<td rowspan="2">SYNEO</td>
			<td>MHPM-UNV</td>
			<td></td>
			<td rowspan="2">http://www.syneoco.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill .035 x .026 x 1.5 304 SS TiN coated round punch</td>
			<td>CR0350265N20R4</td>
			<td>drill diameter: 0.9 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Microbore tubing, 0.25 mm ID, 0.76 mm OD</td>
			<td rowspan="2">Cole-Parmer</td>
			<td>06419-00</td>
			<td>0.010&#34; ID, 0.030&#34; OD</td>
			<td rowspan="2"><a href="http://www.coleparmer.com/">http://www.coleparmer.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Tubing (0.51 mm ID, 2.1 mm OD</td>
			<td>95802-00</td>
			<td>0.020&#34; ID, 0.083&#34; OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass -&#160; cleanroom cleaned</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schott Nexterion cover slip glass D</td>
			<td>Schott</td>
			<td>1472305</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.us.schott.com/">http://www.us.schott.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasma cleaner</td>
			<td>Harrick</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://harrickplasma.com/">http://harrickplasma.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTIRF setup and accessories</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX81 microscope body</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.olympus-lifescience.com/en/">http://www.olympus-lifescience.com/en/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM CCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>ixon-ultra-897</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.andor.com/">http://www.andor.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Plate, heated microscope stage</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>MATS-U52RA26</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.tokaihit.com/">http://www.tokaihit.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml hamilton glass syringes (4x)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81365</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.hamiltoncompany.com/">http://www.hamiltoncompany.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe pump</td>
			<td>kd Scientific</td>
			<td>KDS-230</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.kdscientific.com/">http://www.kdscientific.com/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

snare-mediated fusion of single proteoliposomes with tethered supported bilayers in a microfluidic flow cell monitored by polarized tirf microscopy

In der allgegenwärtigen Prozess der Membranfusion die Eröffnung einer Fusionspore gründet die erste Verbindung zwischen zwei ehemals getrennten Fächern. Während Neurotransmitter oder Hormonfreisetzung über Exozytose, kann die Fusionspore vorübergehend öffnen und schließen sich immer wieder, die Regulierung Ladung Freisetzungskinetik. Pore ​​Dynamik bestimmen auch die Art der Vesikelrecycling; irreversible Wiederverschließbarkeit Ergebnisse in transient, &quot;kiss-and-run&quot; Fusion, während Dilatation führt zu Vollfusion. Um besser zu verstehen , welche Faktoren bestimmen Poren Dynamik entwickelten wir einen Test der Membranfusion unter Verwendung von polarisierten Totalreflexions - Fluoreszenz (TIRF) Mikroskopie mit Einzelmolekülempfindlichkeit und ~ 15 ms Zeitauflösung in einem biochemisch gut definierten in vitro - System zu überwachen. Fusion von fluoreszenzmarkierten kleine unilamellare Vesikel enthalten, v-SNARE-Proteine ​​(v-SUVs) mit einem planaren Bilayer Lager T-SNAREs, auf einem weichen Polymer Kissen unterstützt (t-SBL, t-supported bilayer), Wird überwacht. Der Test verwendet mikrofluidischen Strömungskanäle, die nur minimale Probenverbrauch gewährleisten, während eine konstante Dichte von SUVs liefern. Ausnutzen der schnellen Signalverstärkung bei der Übertragung von Lipid-Etiketten aus dem SUV auf die SBL bei der Fusion, die Kinetik der Lipid-Farbstoffübertragung wird überwacht. Die Empfindlichkeit der TIRF-Mikroskopie ermöglicht es einzelnen fluoreszierenden Lipid-Etiketten-Tracking, von dem Lipid Diffusität und SUV-Größe kann für jede Fusion Veranstaltung abgeleitet werden. Lipid Farbstofffreisetzungszeiten können viel länger sein als für die ungehinderte Passage erwartet durch permanent offenen Poren. Mit Hilfe eines Modells, das Verzögerung der Lipid-Release übernimmt aufgrund flackert Poren, eine Pore &quot;Offenheit&quot;, den Anteil der Zeit, die Poren bei der Fusion offen bleibt, kann abgeschätzt werden. Ein lösliches Marker kann in den SUVs für die gleichzeitige Überwachung von Lipid und lösliche Ladung Freisetzung verkapselt werden. Solche Messungen zeigen einige Poren nach dem Verlust einer Fraktion des löslichen Ladung wieder verschließen kann.

SBL - Qualität Es ist wichtig, die Qualität und die Fluidität des SBL vor dem Fusionsexperiment zu verifizieren. Die Fluoreszenz an der Unterseite, Glasseite eines mikrofluidischen Kanal sollte ohne offensichtliche Mängel einheitlich sein. Wenn eine Luftblase, obwohl der Kanal passiert, lässt es in der Regel sichtbare Narben auf der SBL. Wenn es eine solche groß angelegte Narben / Defekt...

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SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

Hier präsentieren wir ein Protokoll Single, SNARE-vermittelte Fusion Ereignisse zwischen Liposomen und unterstützt Bilayer in mikrofluidischen Kanälen unter Verwendung von polarisierten TIRFM, mit Einzelmolekülempfindlichkeit und ~ 15 ms Zeitauflösung zu erfassen. Lipid und lösliche Ladung Freisetzung können gleichzeitig erfasst werden. Liposomgröße, Lipid-Diffusität und Fusion Poreneigenschaften gemessen werden.

SNARE-vermittelte Fusion von Einzelproteoliposomen mit Tethered Unterstützte Bilayers in einer Zelle Mikrofluidik-Flow-Überwacht durch polarisierte TIRF Mikroskopie

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Single Cell Measurement of Dopamine Release with Simultaneous Voltage-clamp and Amperometry

Single Cell Messung der Freisetzung von Dopamin mit gleichzeitiger Voltage-Clamp-und Amperometry

After its release into the synaptic cleft, dopamine exerts its biological properties via its pre- and post-synaptic targets1. The dopamine signal is ...

Forschung

Neurowissenschaften

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluoreszenzmarkierung Ermöglicht Gezielte Extracellular Einzel-Einheit Aufnahme von identifizierten Neuronen<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Optische Aufnahme überschwellige neuronale Aktivität mit Single-Cell-und Single-Spike Auflösung

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

In-vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie einzelner Nervenenden in der Haut

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

Vorbereitung der neuronalen Co-Kulturen mit Single Cell Precision

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Induktion von Plastizität Astrozytäre Rezeptoren durch Manipulation der neuronalen Feuerraten

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

A Simple Flight Mill for the Study of Tethered Flight in Insects

Ein einfacher Flug Mühle für das Studium der Flug Tethered in Insekten

Flight in insects can be long-range migratory flights, intermediate-range dispersal flights, or short-range host-seeking flights. Previous studies have ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

Analyse von Immunzellen in einzelnen Ischias Nerven und Dorsal Root Ganglion aus einem einzigen Mausklick mit Durchflusszytometrie

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers

Lipid Bilayer Experimente mit Kontakt Blase Bilayer für Patch-reckenden

Lipid bilayers provide a unique experimental platform for functional studies of ion channels, allowing the examination of channel-membrane interactions ...

Three-dimensional Navigation-guided, Prone, Single-position, Lateral Lumbar Interbody Fusion Technique

Dreidimensionale navigationsgesteuerte, anfällige, einschichtige, laterale lumbale Interbody Fusion Technique

Lateral interbody fusion provides a significant biomechanical advantage over the traditional transforaminal lumbar interbody fusion due to the large ...