Name: snare-mediated fusion of single proteoliposomes with tethered supported bilayers in a microfluidic flow cell monitored by polarized tirf microscopy
Uploaded: 2016-08-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy at JoVE.co

We thank Vladimir Polejaev (Yale West Campus Imaging Core) for the design and construction of the polarized TIRF microscope, David Baddeley (Yale University) for help with two-color detection instrumentation, and James E. Rothman (Yale University) and Ben O'Shaughnessy (Columbia University) and members of their groups for stimulating discussions. EK is supported by a Kavli Neuroscience Scholar Award from the Kavli Foundation and NIH grant 1R01GM108954.

1. एक PDMS ब्लॉक की तैयारी microfluidic चैनल पर्चा <img alt="आकृति 1" src="/files/ftp_upload/54349/54349fig1.jpg" /> चित्रा 1. प्रवाह सेल टेम्पलेट और PDMS ब्लॉक तैयारी के Microfabrication। (ए) एक चार चैनल प्रवाह सेल कि एक 24 x 60 मिमी गिलास c...

एसयूवी-एसबीएल संलयन यहाँ वर्णित परख के सफल कार्यान्वयन के ऐसे liposomes में प्रोटीन के कार्यात्मक पुनर्गठन के रूप में कई महत्वपूर्ण कदम है, पर निर्भर करता है, अच्छी गुणवत्ता SBLs प्राप्त करने, और एकल अणुओं का प?...

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q (MQ) water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3040-05</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 190 Proof</td>
			<td>Decon</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A416P4</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td rowspan="3">AmericanBio</td>
			<td>AB00892</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cholride (KCl)</td>
			<td>AB01915</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>AB00490</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-[2-hydroxyethyl] piperazine-N&#39;-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES)</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB00892</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>409911000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES-KOH buffer (pH 7.4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25 mM HEPES-KOH, 140 mM KCl, 100 &#956;M EGTA, 1 mM DTT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform&#160;</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9180-01</td>
			<td>in glass bottle, CAUTION, wear PPE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9070-03</td>
			<td>in glass bottle, CAUTION, wear PPE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liposome preparation&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>var. sizes</td>
			<td>only use glass sringe with solents (Chlorophorm/ Methanon, 2:1, v/v)</td>
			<td><a href="http://www.hamiltoncompany.com/">http://www.hamiltoncompany.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tubes Pyrex Vista 11 ml, 16x100 mm screw cap culture tube</td>
			<td>Pyrex&#160;</td>
			<td>70825-16</td>
			<td>clean thoroughly, rinse with chloroform</td>
			<td><a href="http://catalog2.corning.com/LifeSciences/">http://catalog2.corning.com/LifeSciences/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 16:0-18:1 PC (POPC)</td>
			<td rowspan="7">Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457</td>
			<td rowspan="7">Lipids come dissolved in CHCl3 or as lyphilized powder in sealed vials. Aliquot upon opening. Store extra as dried lipid films under inert atmosphere at -20 &#176;C. Keep stocks in CHCl3/MeOH (2:1, v/v) at -20 &#176;C. let come to RT before opening</td>
			<td rowspan="7"><a href="http://www.avantilipids.com/">http://www.avantilipids.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt), 18:1 PS (DOPS)</td>
			<td>840035</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-stearoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 18:0-20:4 PE (SAPE)</td>
			<td>850804</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt), Brain PI(4,5)P2</td>
			<td>840046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt), 18:1 NBD PE</td>
			<td>810145</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt), 18:1 PEG2000 PE</td>
			<td>880130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholesterol (ovine wool, &#62;98%)</td>
			<td>700000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiD&#39; oil; DiIC18(5) oil (1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindodicarbocyanine Perchlorate)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>D-307</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/">https://www.thermofisher.com/&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotavapor R-210</td>
			<td>Buchi</td>
			<td>R-210</td>
			<td>heat bath above Tm of lipids used</td>
			<td><a href="http://www.buchi.com/">http://www.buchi.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OG n-Octyl-&#946;-D-Glucopyranoside</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>0311</td>
			<td>store at -20&#176;C, let come to RT before opening</td>
			<td><a href="https://www.anatrace.com/">https://www.anatrace.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker - Eppendorf Thermomixer R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.eppendorf.com/">https://www.eppendorf.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyze Dialysis Cassettes, 20K MWCO, 3 mL</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>66003</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/">https://www.lifetechnologies.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Beads SM-2 Adsorbents</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1523920</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep&#160;Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifugation tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 x 89 mm&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>41121703</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.beckmancoulter.com/">https://www.beckmancoulter.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman SW41 Ti rotor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuflorhodamineB</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S-1307</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/">https://www.thermofisher.com/&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Column&#160;Chromatography Columns, 2.5 &#215; 10 cm</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7372512</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose CL-4B</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0150-01</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.gelifesciences.com/">http://www.gelifesciences.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Orange Protein Gel Stain</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S-6650</td>
			<td>5,000X Concentrate in DMSO</td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/">https://www.lifetechnologies.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone elastomer kit, PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.dowcorning.com/">http://www.dowcorning.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex glass petri dish, 150 x 20 mm, complete with cover</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3160-152</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://catalog2.corning.com/LifeSciences/">http://catalog2.corning.com/LifeSciences/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole puncher - Reusable Biopsy Punch, 0.75mm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504529</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.wpi-europe.com/">http://www.wpi-europe.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Hole Punching Machine&#160;</td>
			<td rowspan="2">SYNEO</td>
			<td>MHPM-UNV</td>
			<td></td>
			<td rowspan="2">http://www.syneoco.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill .035 x .026 x 1.5 304 SS TiN coated round punch</td>
			<td>CR0350265N20R4</td>
			<td>drill diameter: 0.9 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Microbore tubing, 0.25 mm ID, 0.76 mm OD</td>
			<td rowspan="2">Cole-Parmer</td>
			<td>06419-00</td>
			<td>0.010&#34; ID, 0.030&#34; OD</td>
			<td rowspan="2"><a href="http://www.coleparmer.com/">http://www.coleparmer.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Tubing (0.51 mm ID, 2.1 mm OD</td>
			<td>95802-00</td>
			<td>0.020&#34; ID, 0.083&#34; OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass -&#160; cleanroom cleaned</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schott Nexterion cover slip glass D</td>
			<td>Schott</td>
			<td>1472305</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.us.schott.com/">http://www.us.schott.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasma cleaner</td>
			<td>Harrick</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://harrickplasma.com/">http://harrickplasma.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTIRF setup and accessories</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX81 microscope body</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.olympus-lifescience.com/en/">http://www.olympus-lifescience.com/en/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM CCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>ixon-ultra-897</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.andor.com/">http://www.andor.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Plate, heated microscope stage</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>MATS-U52RA26</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.tokaihit.com/">http://www.tokaihit.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml hamilton glass syringes (4x)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81365</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.hamiltoncompany.com/">http://www.hamiltoncompany.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe pump</td>
			<td>kd Scientific</td>
			<td>KDS-230</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.kdscientific.com/">http://www.kdscientific.com/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

snare-mediated fusion of single proteoliposomes with tethered supported bilayers in a microfluidic flow cell monitored by polarized tirf microscopy

झिल्ली संलयन की प्रक्रिया में हर जगह का एक संलयन ताकना के उद्घाटन के दो पूर्व में अलग डिब्बों के बीच पहले कनेक्शन स्थापित करता है। exocytosis के माध्यम से न्यूरोट्रांसमीटर या हार्मोन रिलीज के दौरान, संलयन ताकना क्षणिक खुला और करीब से बार-बार, विनियमन माल रिलीज कैनेटीक्स कर सकते हैं। ताकना गतिशीलता भी पुटिका रीसाइक्लिंग की विधा का निर्धारण; क्षणिक, &quot;चुंबन एंड रन&quot; फ्यूजन में अपरिवर्तनीय resealing परिणाम है, जबकि फैलाव पूर्ण संलयन की ओर जाता है। बेहतर क्या कारकों ताकना गतिशीलता शासन को समझते हैं, हम एक अणु संवेदनशीलता और ~ विट्रो प्रणाली में एक biochemically अच्छी तरह से परिभाषित में 15 मिसे समय संकल्प के साथ ध्रुवीकृत कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी का उपयोग झिल्ली संलयन की निगरानी के लिए एक परख विकसित की है। फ्यूजन के fluorescently छोटे unilamellar एक तलीय bilayer असर टी फन्दे के साथ वी-जाल प्रोटीन (वि एसयूवी) युक्त पुटिकाओं लेबल, एक नरम बहुलक गद्दी पर समर्थित (टी एसबीएल, टी समर्थित bilayer), नजर रखी है। परख microfluidic प्रवाह चैनल है कि कम से कम नमूना खपत सुनिश्चित जबकि एसयूवी की एक निरंतर घनत्व की आपूर्ति का उपयोग करता है। फ्यूजन के दौरान एसबीएल करने के लिए एसयूवी से लिपिड लेबल के हस्तांतरण पर तेजी से संकेत वृद्धि शोषण, लिपिड डाई हस्तांतरण के कैनेटीक्स नजर रखी है। TIRF माइक्रोस्कोपी की संवेदनशीलता को एक फ्लोरोसेंट लिपिड लेबल, जिसमें से लिपिड diffusivity और एसयूवी आकार हर संलयन घटना के लिए deduced जा सकता है पर नज़र रखने की अनुमति देता है। लिपिड डाई रिहाई बार बहुत लंबे समय तक हो सकता है स्थायी रूप से खुले छिद्रों के माध्यम से बेरोक पारित होने के लिए उम्मीद की तुलना में। एक मॉडल है कि मानता लिपिड रिहाई की मंदता चंचल ताकना की वजह से है, एक ताकना &quot;खुलापन&quot;, समय के अंश ताकना संलयन के दौरान खुला रहता है का उपयोग करना, अनुमान लगाया जा सकता है। एक घुलनशील मार्कर लिपिड और घुलनशील माल रिहाई के एक साथ निगरानी के लिए एसयूवी में समझाया जा सकता है। इस तरह के मापन से संकेत मिलता है कि कुछ pores घुलनशील माल का एक अंश खोने के बाद reseal सकता है।

एसबीएल गुणवत्ता यह संलयन प्रयोग करने से पहले गुणवत्ता और एसबीएल की तरलता को सत्यापित करने के लिए महत्वपूर्ण है। एक microfluidic चैनल के नीचे, कांच के पक्ष में प्रतिद?...

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SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

यहाँ, हम liposomes और microfluidic चैनलों में समर्थित bilayers ध्रुवीकृत TIRFM उपयोग कर के बीच एकल, जाल की मध्यस्थता संलयन घटनाओं, एक अणु संवेदनशीलता और ~ 15 मिसे समय संकल्प के साथ पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। लिपिड और घुलनशील माल रिहाई एक साथ पता लगाया जा सकता है। Liposome आकार, लिपिड diffusivity, और फ्यूजन ताकना गुण मापा जाता है।

एक microfluidic प्रवाह सेल में सीमित समर्थित bilayers फूट डालना TIRF माइक्रोस्कोपी द्वारा निगरानी के साथ एकल Proteoliposomes के जाल की मध्यस्थता फ्यूजन

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Single Cell Measurement of Dopamine Release with Simultaneous Voltage-clamp and Amperometry

युगपत वोल्टेज दबाना और Amperometry साथ dopamine जारी की एकल कोशिका मापन

After its release into the synaptic cleft, dopamine exerts its biological properties via its pre- and post-synaptic targets1. The dopamine signal is ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

प्रतिगामी फ्लोरोसेंट लेबलिंग पहचाने गए न्यूरॉन्स से लक्षित कोशिकी एकल इकाई रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देता है<em&gt; विवो में</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

एकल कोशिका और एकल कील संकल्प के साथ suprathreshold तंत्रिका गतिविधि के ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

त्वचा में एकल तंत्रिका अंत के vivo दो photon माइक्रोस्कोपी में

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

सिंगल सेल प्रेसिजन साथ Neuronal सह संस्कृति की तैयारी

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Neuronal फायरिंग दरों के हेरफेर से astrocytic रिसेप्टर्स की Plasticity उत्प्रेरण

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

A Simple Flight Mill for the Study of Tethered Flight in Insects

कीड़ों में सीमित उड़ान के अध्ययन के लिए एक सरल फ्लाइट मिल

Flight in insects can be long-range migratory flights, intermediate-range dispersal flights, or short-range host-seeking flights. Previous studies have ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

एकल Sciatic नसों में प्रतिरक्षा कोशिकाओं का विश्लेषण और एक एकल माउस से पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रंथि प्रवाह का उपयोग कर Cytometry

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers

लिपिड Bilayer प्रयोगों के साथ संपर्क बुलबुला Bilayers के लिए पैच-clampers

Lipid bilayers provide a unique experimental platform for functional studies of ion channels, allowing the examination of channel-membrane interactions ...

Three-dimensional Navigation-guided, Prone, Single-position, Lateral Lumbar Interbody Fusion Technique

त्रि-आयामी नेविगेशन-निर्देशित, प्रवण, एकल-स्थिति, पार्श्व काठ का इंटरबॉडी संलयन तकनीक

Lateral interbody fusion provides a significant biomechanical advantage over the traditional transforaminal lumbar interbody fusion due to the large ...