Name: preparation and applications of organotypic thymic slice cultures
Uploaded: 2016-08-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures at JoVE.com

We would like to thank Marilaine Fournier for her comments on the manuscript and Jos&#233;e Tessier for technical assistance. C57BL/6-Tg (OT-I)-RAG1&lt;tmMom&gt; #4175 were obtained through the NIAID Exchange Program, NIH. Support for this research is provided by a grant from the SickKids Foundation and CIHR-IHDCYN (NI15-002), an operating grant from the CIHR-III (MOP-142254), and start-up funds from the FRQS (&#201;tablissement de jeunes chercheurs) and H&#244;pital Maisonneuve-Rosemont Foundation to HJM. HJM is a junior 1 scholar of the FRQS, a CIHR New Investigator (MSH-141967), and a Cole Foundation Early Career Transition award recipient.

تمت الموافقة على بروتوكولات لجميع الدراسات على الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوان في مركز البحوث - المسمى Hôpital ميزونوف-روسيمونت. 1. حصاد ماوس الغدة الصعترية لإعداد التوتة شرائح وتعليق خلية واحدة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direct...

نحن هنا وصف بروتوكول لإعداد شرائح الغدة الصعترية ونتائج ممثل اختيار الإيجابية والسلبية كفاءة مضافين الاختيار معقد التوافق النسيجي الكبير المقيدة أنا TCR thymocytes المعدلة وراثيا عن طريق التدفق الخلوي. وقد استخدم هذا النظام مع نجاح مماثل لدعم اختيار الإيجابية للMHC من الد...

خلايا T تفرق من خلال سلسلة من وسيطة التنموية في الغدة الصعترية وهي الفترة التي كانت تواجه عدة نقاط التفتيش التي تضمن توليد وظيفية، متسامح النفس مرجع الخلايا التائية 1-3. اختيار إيجابية تعزز بقاء thymocytes مع مستقبلات الخلايا التائية (TCR) قادرة على الاعتراف، مع انخفاض في تقارب المعتدل، الببتيد التي قدمها الجزيئات الرئيسية في أنسجة الجسم المعقدة (MHC) على الخلايا القشرية الغدة الصعترية الظهارية (CTEC) 2،3. اختيار السلبية وتنمية الخلايا التائية التنظيمية (T ريج) تساهم في إنشاء التسامح مع الذات عن طريق القضاء أو تحويل thymocytes التي تستجيب بقوة لالببتيد الذاتي التي قدمها MHC 2،4. غير ناضجة CD4 + CD8 + إيجابية المزدوج (DP) thymocytes معربا عن TCRs التي تمر عملية اختيار تفرق في القطعان الخلايا التائية الناضجة، والغالبية العظمى منها MHC الصف الأول المقيدة CD8 + السامة للخلاياأو MHC من الدرجة الثانية المقيدة CD4 + المساعد (SP) خلايا إيجابية واحدة T، قبل أن تغادرها الغدة الصعترية لأداء وظائف المستجيب في الأجهزة اللمفاوية الثانوية 1-3. إضافة إلى تعقيد تطوير الخلايا التائية هي الهجرة ديناميكية واللقاءات الخلوية تطوير thymocytes في جميع أنحاء شبكة خلية انسجة 5-9. هذه الخلايا اللحمية تلعب أدوارا متميزة في تطوير خلية توتية ويتم توزيعها بشكل مختلف بين المناطق القشرية والنخاعية الغدة الصعترية حيث الايجابية والسلبية اختيار تحدث 10. على الرغم من أن اختيار إيجابية تجري في المقام الأول في القشرة، وهناك أدلة تتراكم أن موانئ دبي thymocytes تهاجر إلى النخاع ولا تزال بحاجة إلى إشارات TCR قبل أن تتمايز إلى خلايا T ناضجة مما يشير إلى أن النخاع قد توفر إشارات إضافية ضرورية لاستكمال اختيار الإيجابية ونسب التمايز 11،12. وعلاوة على ذلك،على الرغم من وجود خلايا متخصصة النخاعية الغدة الصعترية الظهارية (MTEC) التي تعبر عن ومولدات المضادات المقيدة الأنسجة موجودة تسهيل حذف thymocytes autoreactive 13،14، تحدث نسبة كبيرة من اختيار السلبية في القشرة ردا على أعرب بتواجد مطلق الببتيد الذاتي قدمت من قبل شجيري الخلايا 15،16. وبالتالي، يجب نماذج دقيقة للتطوير الخلايا التائية توفر المكروية الغدة الصعترية درجة عالية من التنظيم، مع القشرية سليمة والمناطق النخاعية، التي تسهل التفاعل بين thymocytes والخلايا اللحمية، وتدعم الهجرة خلية توتية كما تخضع هذه الخلايا اختيار الإيجابية والسلبية. لتكمل خارج الحي تحليلات thymocytes كوسيلة لدراسة اختيار الإيجابية والسلبية، وعدد من في المختبر، في الموقع، وفي النماذج الحية للتنمية الخلايا التائية وضعت 17-22. فقد كان من الصعب بمكان أن ألخصاختيار إيجابية في المختبر، ولكن coculture من السكان الخلايا الجذعية أو السلائف الخلايا التائية مع خلايا انسجة التعبير عن الشق يجند، ولا سيما OP9-DL1 / 4 خلايا، لديها القدرة على دعم التزام نسب T واختيار إيجابية محدودة مما يجعله لا يقدر بثمن في نموذج المختبر ل دراسة T نمو الخلايا 23-25. قيود من هذا النظام، ومع ذلك، تشمل حقيقة أن هذه الخلايا تفتقر إلى المعدات اللازمة لتصنيع الببتيد فريدة من نوعها وجدت في خلايا انسجة الغدة الصعترية والمكروية الغدة الصعترية ثلاثية الأبعاد. وإن كان أكثر تعقيدا من الناحية الفنية، في الموقع والنماذج الحية من اختيار الغدة الصعترية يمكن التغلب على بعض العقبات المتعلقة بنظم في المختبر. Reaggregate الثقافات الجهاز الغدة الصعترية (RTOC) تحتوي على تعريف خليط من thymocytes والخلايا اللحمية الغدة الصعترية 18،26،27. هذه reaggregates الخلايا الظهارية التوتة الحفاظ MHC من الدرجة الأولى والثانية والتعبير يمكن أن تدعم الإنمائية للالإقليم الشمالي على حد سواء التقليدية فرعية الخلايا التائية، ومع ذلك لا تزال تفتقر إلى تعريف المنشآت القشرية والنخاعية. الجنين الثقافة الجهاز الغدة الصعترية (FTOC) هو نموذج شعبية للتنمية الخلايا التائية التي يمكن المصنف مع thymocytes عبر ثقافة شنقا الإفلات من فصوص الغدة الصعترية lymphodepleted أو عن طريق الحقن من thymocytes إلى lymphoreplete فصوص الغدة الصعترية ودعم التنمية الفعالة للCD4 + و CD8 + T الخلايا مع مرور الوقت في الثقافة 18،28-31. في بدء ثقافة فصوص الغدة الصعترية الجنين هناك ندرة في mTECs، ولكن الهياكل القشرية والنخاعية محددة قد تتطور بمرور الوقت اعتمادا على الظروف. وهو عامل مهم هو أن هذا النموذج قد دعم تفضيلي الجنين مقابل تطوير خلية بالغة تي. وأخيرا، حقن intrathymic السلائف التوتة المحددة في فئران بالغة يمثل تحديا تقنيا ولكنها توفر بوضوح بيئة لدعم تطوير خلايا T في الجسم الحي. هذه في الموقع والنماذج الحية هي أدوات ممتازة رo يجب النظر في مسألة التنمية خلية الدراسة تي واستخدامها على أساس التجربة تلو التجربة. شرائح الغدة الصعترية، ومع ذلك، فقد ظهرت مؤخرا كنموذج تنوعا، مكملة لدراسة اختيار الغدة الصعترية في الموقع مع إمكانية استيعاب فريدة من نوعها، ومعقدة، والتجارب التي مرت أعلى عموما. شرائح الغدة الصعترية الحفاظ على سلامة المناطق القشرية والنخاعية وتوفر إطارا الخلايا اللحمية التي تدعم الهجرة خلية توتية خلال التنمية، فضلا عن كفاءة الإيجابية والسلبية اختيار 11،32-39. مجموعات فرعية خلية توتية أضاف فوق شرائح الغدة الصعترية تهاجر إلى الأنسجة وعلى النحو المناسب microenvironmental المتخصصة 34،37. وthymocytes مضافين يمكن تمييزها عن الخلايا الذاتية شريحة الغدة الصعترية عبر علامات مسانج أو العلامات الفلورية ويمكن حافظت في الثقافة لعدة أيام. الثقافات الغدة الصعترية شريحة عضوي النمط يمكن استخدامها لدراسة الجوانب المختلفةالتنمية الخلايا التائية بما في ذلك اختيار التوتة، والسلوك خلية توتية (الهجرة والتفاعلات الخلوية)، وتوطين خلية توتية، من بين أمور أخرى. نظرا لقدرتها على توليد ~ 20 شرائح الغدة الصعترية في الماوس، وقابلية للتجارب أكبر عموما من غيرها في نماذج الموقع من اختيار الغدة الصعترية. على الرغم من أن إعداد شرائح الغدة الصعترية يتطلب معدات متخصصة، مثل vibratome، والوقت حياة شرائح الغدة الصعترية في الثقافة محدودة بسبب فقدان الخلايا مع مرور الوقت عن طريق موت الخلايا وعدم وجود غشاء تغليف، توفر شرائح الغدة الصعترية نموذجا ممتازا لتحليل اختيار الغدة الصعترية السكان متزامنة من thymocytes ضمن المكروية الغدة الصعترية ناضجة. نحن هنا وصف إعداد شرائح الغدة الصعترية (بما في ذلك حصاد الغدة الصعترية، تضمين الاغاروز من فصوص الغدة الصعترية وvibratome باجتزاء الأنسجة جزءا لا يتجزأ)، والعزلة وتغشية thymocytes، وتفكك شرائح الغدة الصعترية لتحليل تدفق cytometric.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1000S&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuSieve GTG Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50080</td>
			<td>Low melting temperature agarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Mold (Truncated - T12)</td>
			<td>Polyciences</td>
			<td>18986</td>
			<td>22mm x 22mm square, truncated to 12mm x 12mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Edge Prep Blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td>74-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Adhesive</td>
			<td>3M&#160;</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4 &#181;m Cell Culture Inserts&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353090</td>
			<td>Of several brands tested, these maintained the cells atop the slices the best</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21600-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 with L-glutamine</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>350-000-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>080-110</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine, 200mM</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>609-065-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin, 100X</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-201-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A15890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Tenbroeck Tissue Grinders</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Filter</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>U-CMN-255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube Sample Pestle</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F19922-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Nylon Cell Strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Inox Tip</td>
			<td>Dumont&#160;</td>
			<td>RS-5047</td>
			<td>Fine tip curved forceps, size .17&#160;X .10mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Forceps</td>
			<td>Dumont&#160;</td>
			<td>RS-5090&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and applications of organotypic thymic slice cultures

وقد وفرت عائدات اختيار الغدة الصعترية في المكروية الغدة الصعترية فريدة وعالية التنظيم مما يؤدي إلى توليد وظيفية، مرجع خلية T-متسامح النفس. في المختبر نماذج لدراسة التزام نسب T والتنمية رؤى قيمة حول هذه العملية. ومع ذلك، فإن هذه النظم تفتقر إلى كامل محيط الغدة الصعترية ثلاثي الأبعاد ضروري للتنمية الخلايا التائية، وبالتالي، هي تقريبية غير مكتملة في الجسم الحي اختيار الغدة الصعترية. بعض التحديات المتعلقة بالتنمية خلية النمذجة تي يمكن التغلب عليها باستخدام النماذج في الموقع التي توفر المكروية الغدة الصعترية سليمة التي تؤيد تأييدا كاملا اختيار الغدة الصعترية من تطوير خلايا تي. الغدة الصعترية الثقافات شريحة عضوي النمط تكمل القائمة في تقنيات الموقع. شرائح الغدة الصعترية الحفاظ على سلامة المناطق القشرية والنخاعية الغدة الصعترية وتوفر منبرا لدراسة تطوير thymocytes مضافين لمرحلة تنموية محددة أو الذاتية T جملتعلمي اللغة اإلنكليزية في المكروية الغدة الصعترية ناضجة. نظرا لقدرتها على توليد ~ 20 شرائح في الماوس، وشرائح الغدة الصعترية تقدم ميزة فريدة من نوعها من حيث قابلية للتجارب إنتاجية عالية. وعلاوة على ذلك، السهولة النسبية في توليد شرائح الغدة الصعترية والقدرة على تراكب فرعية التوتة مختلفة أو السكان الخلية الآخرين من خلفيات وراثية متنوعة تعزز براعة هذا الأسلوب. نحن هنا وصف بروتوكول لإعداد شرائح الغدة الصعترية، والعزلة، وتراكب thymocytes، وتفكك شرائح الغدة الصعترية لتحليل تدفق cytometric. ويمكن أيضا أن تتكيف هذا النظام لدراسة تطوير الخلايا التائية غير التقليدية وكذلك تصور الهجرة خلية توتية، التفاعلات خلية خلية توتية اللحمية، وإشارات TCR المرتبطة اختيار الغدة الصعترية بواسطة المجهر ثنائي الفوتون.

تحليل شرائح دعم الغدة الصعترية من الجوانب المختلفة للتنمية الخلايا التائية مثل اختيار الإيجابية والسلبية. لالتجارب الناجحة، ونوعية شريحة الغدة الصعترية أمر بالغ الأهمية. وبالتالي، يجب فحص شرائح الغدة الصعترية لضمان سلامة الأنسجة الغدة...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures at JoVE.com

Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures

وصفنا إعداد شرائح الغدة الصعترية التي، جنبا إلى جنب مع التدفق الخلوي، ويمكن استخدامها لنموذج اختيار الإيجابية والسلبية لتطوير خلايا تي. ويمكن أيضا شرائح الغدة الصعترية يمكن تكييفها لفي الموقع تحليل الهجرة خلية توتية، التعريب، وإشارات عبر المناعي واثنين من الفوتون المجهري.

إعداد وتطبيقات الثقافات عضوي التوتة شريحة

Thymic selection proceeds in a unique and highly organized thymic microenvironment resulting in the generation of a functional, self-tolerant T cell ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

اشتقاق خطوط التوتة تي خلية سرطان الغدد الليمفاوية من أجهزة الصراف الآلي -- / --</sup و البروتين p53 -- / --</sup الفئران

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

إجراء 1.5 ساعة لتحديد معوي أنواع الثقافات مباشرة من الدم

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

وهناك طريقة بسيطة وفعالة لعزل تقوم البلاعم من الثقافات الابتدائية المختلطة من خلايا الكبد الكبار

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field

التشخيص السريع لفيروس انفلونزا الطيور في الطيور البرية : استخدام لPCR - RRT المحمولة والكواشف تجميد المجفف في الميدان

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

إعداد الحمض النووي الفيروسي من Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

جيل من الثقافات الطوافة عضوي النمط من الخلايا الكيراتينية الإنسان الأساسية

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

عزل الخلايا الدبقية الصغيرة الابتدائية المختلطة من زراعات الخلايا الغروية من المواليد الجدد الجرذ أنسجة المخ

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

دراسة التوتة اختيار الإيجابية والسلبية من قياس التدفق الخلوي

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

العزلة، تحديد الهوية، وتنقية خلايا الفئران التوتة طلائي

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

العزل وزرع مختلفة المسنين الفئران التوتة الطعوم.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...