Name: preparation and applications of organotypic thymic slice cultures
Uploaded: 2016-08-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures at JoVE.com

We would like to thank Marilaine Fournier for her comments on the manuscript and Jos&#233;e Tessier for technical assistance. C57BL/6-Tg (OT-I)-RAG1&lt;tmMom&gt; #4175 were obtained through the NIAID Exchange Program, NIH. Support for this research is provided by a grant from the SickKids Foundation and CIHR-IHDCYN (NI15-002), an operating grant from the CIHR-III (MOP-142254), and start-up funds from the FRQS (&#201;tablissement de jeunes chercheurs) and H&#244;pital Maisonneuve-Rosemont Foundation to HJM. HJM is a junior 1 scholar of the FRQS, a CIHR New Investigator (MSH-141967), and a Cole Foundation Early Career Transition award recipient.

Protocollen voor alle dierproeven werden goedgekeurd door de Animal Care Comite op het Centre de recherche - Hôpital Maisonneuve-Rosemont. 1. Oogsten Muis Thymus voor de bereiding van de thymus Slices en Single Cell Schorsingen <ol><li> Euthanaseren de muis met CO 2 gevolgd door cervicale dislocatie. </li><li> In een laminaire stroming kap, speld de muis buikzijde tot een dissectie board. Spuit de muis met 70% ethanol. Verwijder overtollig alcohol door deppen met een gaasje om te voorkomen dat etha...

Hier beschrijven we een protocol voor de bereiding van thymus segmenten en representatieve resultaten efficiënte positieve en negatieve selectie overlay preselectie MHC klasse-I beperkte TCR transgene thymocyten door flowcytometrie. Dit systeem is gebruikt met soortgelijke succes positieve selectie van MHC klasse II beperkte CD4 + T-cellen van voorselectie DP thymocyten 32 ondersteunen, en in aanwezigheid van agonist antigeen negatieve selectie en thymus T reg ontwikkeling 11,12, 3...

T-cellen differentiëren door een reeks van ontwikkelings tussenproducten in de thymus gedurende welke zij verschillende checkpoints dat het genereren van een functioneel, zelfverdraagzaam T cel repertoire 1-3 garanderen tegenkomen. Positieve selectie bevordert de overleving van thymocyten met T-cel receptoren (TCR) kunnen herkennen, met een lage tot matige affiniteit, peptide gepresenteerd door major histocompatibility complexe moleculen (MHC) op corticale thymus epitheelcellen (CTEC) 2,3. Negatieve selectie en regulatoire T (T reg) ontwikkeling cel bijdragen aan de totstandkoming van zelf-tolerantie via het wegnemen of misbruik van thymocyten die sterk reageren op self-peptide gepresenteerd door MHC 2,4. Onrijpe CD4 + CD8 + dubbel positieve (DP) thymocyten expressie TCRs die het selectieproces overgaan differentiëren in rijpe T-cel subpopulaties, waarvan de meeste zijn MHC klasse I-beperkte CD8 + cytotoxischeof MHC klasse II beperkte CD4 + helper enkel positieve (SP) T-cellen, voor het verlaten van de thymus tot effector functies in de secundaire lymfoïde organen 1-3. Wat de complexiteit van T cel ontwikkeling is de dynamische migratie en cellulaire ontmoetingen ontwikkelen thymocyten gehele stromale cel netwerk 5-9. Deze stromale cellen spelen verschillende rollen in thymocyten ontwikkeling en zijn verschillend verdeeld over de thymus corticale en medullaire regio&#39;s waar de positieve en negatieve selectie plaatsvinden 10. Hoewel positieve selectie vindt plaats in de eerste plaats in de cortex, er is een groeiend bewijs dat DP thymocyten migreren naar het merg en blijven TCR signalen voordat ze differentiëren in mature T-cellen suggereert dat het merg extra signalen kunnen verschaffen die nodig zijn voor de voltooiing van positieve selectie en lineage differentiatie 11,12. Verder,ondanks de aanwezigheid van gespecialiseerde medullaire thymus epitheelcellen (MTES) die expressie en huidige weefsel beperkte antigenen vergemakkelijken deletie van autoreactieve thymocyten 13,14, een groot deel van de negatieve selectie plaatsvindt in de cortex in reactie op alomtegenwoordig tot expressie zelf peptide door dendritische cellen 15,16. Zo moet nauwkeurige modellen van T-cel ontwikkeling een zeer georganiseerde thymus micromilieu te voorzien, met intacte corticale en medullaire regio&#39;s, dat de interactie tussen thymocyten en stromale cellen faciliteert en ondersteunt thymocyt migratie deze cellen ondergaan positieve en negatieve selectie. Als aanvulling ex vivo analyse van thymocyten als middel bestuderen positieve en negatieve selectie, een aantal in vitro, in situ en in vivo modellen van T cel ontwikkeling ontwikkeld 17-22. Het is altijd moeilijk recapitulerenpositieve selectie in vitro, maar co-cultuur van stamcelpopulaties of T cel voorlopers met stromale cellen die Notch-ligand, met name OP9-DL1 / 4 cellen, heeft de mogelijkheid om T lineage inzet en beperkte positieve selectie ondersteunen waardoor het een waardevol in vitro model studie T cel ontwikkeling 23-25. Beperkingen van dit systeem omvatten echter het feit dat deze cellen het unieke peptide machines gevonden in thymus stromale cellen en de driedimensionale thymus micromilieu. Hoewel technisch omslachtig, in situ en in vivo modellen van thymus selectie enkele obstakels met betrekking tot in vitro systemen te overwinnen. Reaggregate thymus orgel culturen (RTOC) bevatten gedefinieerde mengsels van thymocyten en thymus stromale cellen 18,26,27. Deze thymus epitheelcellen reaggregates behouden MHC klasse I en II expressie en kan Developme ondersteunennt van zowel conventionele T-cel subsets, maar nog steeds niet gedefinieerd corticale en medullaire structuren. Foetale thymus orgaankweek (FTOC) is een populair model T cel ontwikkeling die met thymocyten via hangende-druppel cultuur lymphodepleted thymus lobben of via injectie van thymocyten kan worden gezaaid in lymphoreplete thymus lobben en ondersteunen efficiënte ontwikkeling van CD4 + en CD8 + T cellen na verloop van tijd in cultuur 18,28-31. Aan het begin van de cultuur van de foetale thymus lobben is er een gebrek aan mTECs, maar gedefinieerd corticale en medullaire structuren kunnen ontwikkelen in de tijd afhankelijk van de omstandigheden. Een belangrijke overweging is dat dit model voorkeur kan ondersteunen foetale versus volwassen T cel ontwikkeling. Tenslotte intrathymic injectie van gedefinieerde thymus voorlopers in volwassen muizen is technisch uitdagend, maar geeft duidelijk een omgeving te steunen T cel ontwikkeling in vivo. Deze in situ en in vivo modellen zijn uitstekende hulpmiddelen to studie T cel ontwikkeling en het gebruik ervan moet worden beschouwd als een experiment-by-experiment basis. Thymus segmenten hebben echter onlangs ontwikkeld tot een veelzijdige complementair model thymus de selectie in situ met de mogelijkheid om unieke, complexe en algemeen hogere throughput experimenten tegemoet. Thymus plakjes handhaven van de integriteit van de corticale en medullaire regio&#39;s en bieden een kader van stromale cellen die thymocyten migratie ondersteunt tijdens de ontwikkeling en efficiënte positieve en negatieve selectie 11,32-39. Thymocyt subsets toegevoegd boven op de thymus plakjes migreren in het weefsel en hun geschikte micro-omgeving niche 34,37. De overlay thymocyten kan worden onderscheiden van de thymus segment endogene cellen via congenic merkers of fluorescente labels en kunnen in kweek gedurende enkele dagen worden gehandhaafd. Thymus slice organotypische kweken kan worden gebruikt om verschillende aspecten bestuderenT cel ontwikkeling zoals thymus keuze, thymocyten gedrag (migratie en cellulaire interacties) en thymocyten lokalisatie, onder anderen. De mogelijkheid krijgen om ~ 20 thymus segmenten per muis genereren, de schaalbaarheid van experimenten in het algemeen groter dan andere in situ modellen van thymus selectie. Hoewel de bereiding van thymus segmenten vereist gespecialiseerde apparatuur, zoals de vibratome en de levensduur van thymus segmenten in cultuur beperkt blijven door celverlies tijd via celdood en het ontbreken van een inkapselend membraan, thymus segmenten vormen een uitstekend model voor de analyse van thymus selectie van gesynchroniseerde populaties van thymocyten binnen een volwassen thymus micromilieu. Hier beschrijven we de voorbereiding van de thymus plakjes (met inbegrip van het oogsten van de thymus, agarose inbedding van thymus lobben en vibratome snijden van het ingebedde weefsel), isolatie en overdeksel thymocyten en dissociatie van thymus plakken voor flowcytometrische analyse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1000S&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuSieve GTG Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50080</td>
			<td>Low melting temperature agarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Mold (Truncated - T12)</td>
			<td>Polyciences</td>
			<td>18986</td>
			<td>22mm x 22mm square, truncated to 12mm x 12mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Edge Prep Blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td>74-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Adhesive</td>
			<td>3M&#160;</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4 &#181;m Cell Culture Inserts&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353090</td>
			<td>Of several brands tested, these maintained the cells atop the slices the best</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21600-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 with L-glutamine</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>350-000-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>080-110</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine, 200mM</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>609-065-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin, 100X</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-201-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A15890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Tenbroeck Tissue Grinders</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Filter</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>U-CMN-255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube Sample Pestle</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F19922-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Nylon Cell Strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Inox Tip</td>
			<td>Dumont&#160;</td>
			<td>RS-5047</td>
			<td>Fine tip curved forceps, size .17&#160;X .10mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Forceps</td>
			<td>Dumont&#160;</td>
			<td>RS-5090&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and applications of organotypic thymic slice cultures

Thymus selectie verloopt in een unieke en zeer georganiseerde thymus micromilieu resulteert in de vorming van een functioneel, zelfverdraagzaam T cel repertoire. In vitro modellen voor T lineage betrokkenheid en ontwikkeling te bestuderen hebben waardevolle inzichten in dit proces. Maar deze systemen niet de volledige driedimensionale thymus milieu noodzakelijk voor T cel ontwikkeling en derhalve onvolledig benaderingen van in vivo thymus selectie. Enkele problemen met betrekking tot modellering T cel ontwikkeling kan worden overwonnen door in situ modellen die een intact micro thymus die volledig achter de thymus ontwikkelen winkelwagentje T cellen. Thymus slice organotypische culturen aanvulling op bestaande in-situ technieken. Thymus segmenten de integriteit van de thymus corticale en medullaire gebieden en een platform voor de ontwikkeling van overlay thymocyten van een bepaald ontwikkelingsstadium of endogene Tc bestuderenells binnen een volwassen thymus micromilieu. Gezien de mogelijkheid om ~ 20 sneetjes per muis genereren, thymus plakjes presenteren een uniek voordeel in termen van schaalbaarheid voor high throughput experimenten. Verder is de relatieve gemak bij het genereren thymus plakjes en potentieel verschillende subsets thymus en andere celpopulaties overlappen van verschillende genetische achtergronden vergroot de veelzijdigheid van deze methode. Hier beschrijven we een protocol voor de voorbereiding van de thymus plakjes, isolatie en bekleding van thymocyten en dissociatie van thymus plakken voor flowcytometrische analyse. Dit systeem kan ook worden aangepast om onconventionele T cel ontwikkeling te bestuderen en thymocyten migratie thymocyt-stromale cel interacties en TCR signalen geassocieerd met thymus selectie door twee-foton microscopie te visualiseren.

Thymus plakjes ondersteuning analyse van de verschillende aspecten van de T-cel ontwikkeling, zoals positieve en negatieve selectie. Voor een succesvolle experimenten, de kwaliteit van de thymus slice staat voorop. Daarom moet thymus plakjes worden onderzocht om de integriteit van de thymusweefsel waarborgen en dat de agarose rond de thymus slice intact (Figuur 1A). Oppervlaktespanning kan worden aangetast wanneer de agarose beschadiging veroorzaakt ee...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures at JoVE.com

Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures

We beschrijven de bereiding van thymus segmenten die in combinatie met flowcytometrie, kan worden gebruikt om positieve en negatieve selectie van T-cellen ontwikkelen modelleren. Thymus segmenten kunnen ook worden aangepast voor de in situ analyse van thymocyten migratie, lokalisatie en signalering via immunofluorescentie en twee-foton microscopie.

Voorbereiding en Toepassingen van organotypische thymus Slice Culturen

Thymic selection proceeds in a unique and highly organized thymic microenvironment resulting in the generation of a functional, self-tolerant T cell ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Afleiding van thymus lymfoom T-cel-Lines uit Atm - / -</sup En P53 - / -</sup Muizen

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

Een 1,5 uur Procedure voor de identificatie van Enterococcus Soorten Rechtstreeks van bloedkweken

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Een eenvoudige en efficiënte methode om macrofagen Isolaat van Mixed primaire culturen van Adult levercellen

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field

Een snelle diagnose van aviaire influenza virus bij wilde vogels: Het gebruik van een Portable RRT-PCR en gevriesdroogd reagentia in het veld

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

De voorbereiding van Virale DNA van nucleocapsiden

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

Genereren van organotypische Raft Culturen van primaire humane keratinocyten

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Primaire Microglia Isolatie van Mixed gliale celculturen van neonatale rat hersenweefsel

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

Onderzoek van thymus positieve en negatieve selectie via flowcytometrie

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Isolatie, identificatie en zuivering van Muriene thymus epitheelcellen

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

Isolatie en Transplantatie van verschillende Aged Muriene Thymic Enten.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...