Name: preparation and applications of organotypic thymic slice cultures
Uploaded: 2016-08-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures at JoVE.com

We would like to thank Marilaine Fournier for her comments on the manuscript and Jos&#233;e Tessier for technical assistance. C57BL/6-Tg (OT-I)-RAG1&lt;tmMom&gt; #4175 were obtained through the NIAID Exchange Program, NIH. Support for this research is provided by a grant from the SickKids Foundation and CIHR-IHDCYN (NI15-002), an operating grant from the CIHR-III (MOP-142254), and start-up funds from the FRQS (&#201;tablissement de jeunes chercheurs) and H&#244;pital Maisonneuve-Rosemont Foundation to HJM. HJM is a junior 1 scholar of the FRQS, a CIHR New Investigator (MSH-141967), and a Cole Foundation Early Career Transition award recipient.

פרוטוקולים לכל במחקרים בבעלי החיים אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים בבית המשוכלל והנדיר de המרכז - Hôpital Maisonneuve-Rosemont. 1. קציר עכבר קורנית עבור הכנת הרתי פרוסה השעיות תא בודדות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכב?...

כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת פרוסות הרתי ותוצאות נציג מבחר חיובי ושלילי היעיל של הגבלה אני בכיתת MHC מראש מבחר המעולף thymocytes המהונדס TCR ידי cytometry זרימה. מערכת זו נוצל בעבר בהצלחה דומה לתמוך סלקציה חיובית של הכיתה MHC II-מוגבל CD4 + T תאים thymocytes העקורים מראש מבחר 32,</sup...

T תאים להבדיל באמצעות סדרה של ביניים התפתחותיים התימוס במהלכן הם נתקלים בכמה מחסומים המבטיחים בדור של רפרטואר תא T פונקציונלי, עמיד בפני עצמי 1-3. סלקציה חיובית מקדמת את ההישרדות של thymocytes עם קולטנים של תאי T (TCR) מסוגלים להכיר, עם נמוך הזיקה מתונה, פפטיד שהציגו מולקולות מורכבות histocompatibility גדולות (MHC) על תאי אפיתל הרתי קליפת מוח (cTEC) 2,3. סלקציה שלילית ו- T רגולטוריים התפתחות התא (T reg) לתרום להקמת סובלנות עצמית באמצעות חיסול או הסטת thymocytes שמגיבים בחריפות-פפטיד עצמי שהציג MHC 2,4. בשלה CD4 + CD8 + חיובית כפולה (DP) thymocytes להביע TCRs שעוברים תהליך הבחירה להתמיין תת-אוכלוסיות של תאי T בוגרים, שרובם הם מהשורה MHC-מוגבל ואני ציטוטוקסיות CD8 +או בכיתת MHC II-מוגבל CD4 + עזר יחיד חיובי (SP) ותאי T, לפני היציאה התימוס כדי לבצע פעולות מפעיל באיברים הלימפה משני 1-3. מה שמוסיף למורכבות של פיתוח תאי T, ההגירה הדינמית ומפגשים הסלולר לפתח thymocytes ברחבי רשת תא סטרומה 5-9. בתאי סטרומה אלה ממלאים תפקידים ברורים בפיתוח thymocyte ומופצים באופן דיפרנציאלי בין האזורים קורטיקליים מדולריים הרתי שבו חיובי סלקציה שלילית להתרחש 10. למרות סלקציה חיובית מתרחשת בעיקר בקליפת המוח, יש ראיות מצטבר thymocytes העקור נודד אל הלשד ולהמשיך לדרוש אותות TCR לפני שהם להתמיין לתאי T בוגרים דבר המצביעים על כך הלשד עשוי לספק אותות נוספים הדרושים להשלמת מבחר חיובי שושלת בידול 11,12. נוסף,למרות נוכחותם של תאי אפיתל הרתי מדולרי מיוחדים (Mtec) מבטאים ו אנטיגנים הנוכחי מוגבל רקמות הקלת מחיקה של thymocytes אוטוריאקטיבים 13,14, חלק גדול של סלקציה שלילית מתרחש בקליפה בתגובה הביע בכל מקום בגוף-פפטיד עצמי שהציג הדנדריטים תאים 15,16. לפיכך, מודלים מדויקים של פיתוח תאי T חייב לספק microenvironment הרתי מאורגן, עם קליפת המוח ללא פגע ואזורים מדולרי, המאפשר אינטראקציה בין thymocytes ותאי סטרומה, ותומך הגירה thymocyte כמו תאים אלה עוברים סלקציה חיובית ושלילית. כדי להשלים vivo לשעבר מנתח של thymocytes כאמצעי לימוד מבחר חיובי ושלילי, מספר במבחנה, באתרו, ו במודלי vivo של התפתחות תאי T פותח 17-22. זה כבר ידוע לשמצה קשה לשחזרבחירה במבחנה חיובית, אבל coculture של אוכלוסיות תא גזע או מבשרי תא T עם תאי סטרומה להביע ליגנד Notch, בעיקר OP9-DL1 / 4 תאים, יש לו את היכולת לתמוך במחויבות שושלת T ו סלקציה חיובית מוגבלת מה שהופך אותו לא יסולא בפז במודל חוץ גופייה כדי מחקר תאי T פיתוח 23-25. מגבלות של מערכת זו, עם זאת, כוללים את העובדה כי תאים אלה חסרים את מכונות עיבוד פפטיד ייחודי המצוי בתאי סטרומה הרתי ואת microenvironment הרתי תלת ממדי. למרות שלמעלה טכנית מסורבלת, באתרו במודלים vivo של מבחר הרתי יכול להתגבר על מחסומים הקשורים למערכות במבחנה. תרבויות איבר Reaggregate הרתי (RTOC) מכילים מוגדר תערובות של thymocytes ותאי סטרומה הרתי 18,26,27. reaggregates תא אפיתל הרתי אלה לשמור הביטוי שהייתי בכיתה MHC ו- II והוא יכול לתמוך developmeNT של שני תת התא הקונבנציונלי T, אך עדיין חסרת מוגדר מבנים קורטיקליים מדולריים. תרבות איבר הרתי עוברית (FTOC) היא מודל פופולרי של פיתוח תאי T שניתן זורע עם thymocytes באמצעות תרבות תליית טיפת אונות הרתי lymphodepleted או באמצעות זריקה של thymocytes לתוך lymphoreplete אונות הרתי ולתמוך בפיתוח יעיל של CD4 + ו- CD8 + T תאים לאורך זמן בתרבות 18,28-31. ב החניכה של התרבות של אונות הרתי העובר יש מחסור של mTECs, אך מוגדר מבנים קורטיקליים מדולריים עלולים לפתח לאורך זמן בהתאם לתנאים. שיקול חשוב הוא כי מודל זה עשוי לתמוך עוברי מועדף לעומת פיתוח תא הבוגר T. לבסוף, הזרקת intrathymic של מבשרי הרתי מוגדר בעכברים בוגרים הוא מאתגר מבחינה טכנית אך ברור מספקת סביבה לתמיכה פיתוח תאי T in vivo. אלו באתרו במודלים vivo הם לא כלים מצויניםo מחקר T תא הפיתוח והשימוש שלהם צריך להיחשב על בסיס ניסוי אחר ניסוי. פרוסות הרתי, לעומת זאת, צמחו לאחרונה כמודל צדדי, משלים ללמוד בחירה הרתי באתרו עם האפשרות להכיל ייחודי, מורכב, ובדרך כלל ניסויי תפוקה גבוהים יותר. פרוסות הרתי לשמור על השלמות של האזורים קורטיקליים מדולריים ולספק מסגרת של תאי סטרומה שתומכת גירת thymocyte במהלך פיתוח, כמו גם מבחר חיובי ושלילי יעיל 11,32-39. תת thymocyte הוסיף גבי פרוסות הרתי נודדים לתוך רקמות נישת microenvironmental המתאימה שלהם 34,37. Thymocytes המעולף ניתן להבחין בין תאי אנדוגני פרוסה הרתי באמצעות סמני congenic או תוויות ניאון והוא יכול להישמר בתרבות במשך כמה ימים. תרבויות organotypic פרוסה הרתי יכול לשמש כדי לחקור היבטים שוניםההתפתחות של תאי T כולל מבחר הרתי, התנהגות thymocyte (הגירה אינטראקציות הסלולר), ולוקליזציה thymocyte, בין היתר. בהינתן היכולת ליצור ~ 20 פרוסות הרתי לכל עכבר, את יכולת ההרחבה של ניסויים היא בדרך כלל גדולה יותר מאשר אחרים במודלים באתרו של מבחר הרתי. למרות הכנת פרוסות הרתי דורשת ציוד מיוחד, כגון vibratome, ואת זמן החיים של פרוסות הרתי בתרבות מוגבלת בשל אובדן של תאים לאורך זמן באמצעות מוות של תאים וחוסר קרום encapsulating, פרוסות הרתי לספק מודל מצוין לניתוח של מבחר הרתי של אוכלוסיות מסונכרנות של thymocytes בתוך microenvironment הרתי בוגר. כאן אנו מתארים את הכנת פרוסות הרתי (כולל קצירת התימוס, הטבעת agarose של אונות התימוס vibratome חתך של הרקמות המוטבעות), בידוד שכיסה של thymocytes, הניתוק של פרוסות הרתי עבור ניתוח התזרים cytometric.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1000S&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuSieve GTG Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50080</td>
			<td>Low melting temperature agarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Mold (Truncated - T12)</td>
			<td>Polyciences</td>
			<td>18986</td>
			<td>22mm x 22mm square, truncated to 12mm x 12mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Edge Prep Blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td>74-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Adhesive</td>
			<td>3M&#160;</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4 &#181;m Cell Culture Inserts&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353090</td>
			<td>Of several brands tested, these maintained the cells atop the slices the best</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21600-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 with L-glutamine</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>350-000-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>080-110</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine, 200mM</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>609-065-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin, 100X</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-201-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A15890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Tenbroeck Tissue Grinders</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Filter</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>U-CMN-255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube Sample Pestle</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F19922-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Nylon Cell Strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Inox Tip</td>
			<td>Dumont&#160;</td>
			<td>RS-5047</td>
			<td>Fine tip curved forceps, size .17&#160;X .10mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Forceps</td>
			<td>Dumont&#160;</td>
			<td>RS-5090&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and applications of organotypic thymic slice cultures

התמורה מבחר הרתי בתוך microenvironment הרתי ייחודי מאוד מאורגנת וכתוצאה מכך הדור של רפרטואר תא T פונקציונלי, עמיד בפני עצמי. מודלים חוץ גופית ללמוד מחויבות השושלת T ופיתוח סיפקו תובנות חשובות לגבי התהליך הזה. עם זאת, מערכות אלו חסרים את המילייה הרתי תלת ממדים המלאות נחוצה להתפתחות תאי T, ולכן הם קירובים שלמים של in vivo מבחר הרתי. כמה מן האתגרים הקשורים לפיתוח תא דוגמנות T ניתן להתגבר באמצעות במודלים באתרו המספקים microenvironment הרתי שלם שתומך מבחר הרתי מלא לפתח תאי T. תרבויות organotypic פרוסת הרתי משלימים קיימים טכניקות באתרו. פרוסות הרתי לשמור על שלמות של אזורים קורטיקליים מדולרי הרתי ולספק פלטפורמה ללמוד פיתוח של thymocytes כיסו של שלב התפתחותי מוגדר או של ג T אנדוגניאמות בתוך microenvironment הרתי בוגר. בהינתן היכולת ליצור ~ 20 פרוסות לכל עכבר, פרוסות הרתי להציג יתרון ייחודי במונחים של מדרגיות לניסויי קצב העברת נתונים גבוהות. יתר על כן, הקלות היחסית ביצירת פרוסות הרתי ופוטנציאל כיסוי תת הרתי שונה או אוכלוסיות תאים אחרות מרקע גנטי מגוונים משפרת את הרבגוניות של שיטה זו. כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת פרוסות הרתי, בידוד כיסוי של thymocytes, ניתוק של פרוסות הרתי עבור ניתוח תזרים cytometric. מערכת זו יכולה גם להיות מותאמת ללמוד פיתוח תאי T בלתי קונבנציונלי וכן לדמיין גירת thymocyte, אינטראקציות תא-סטרומה thymocyte, ואותות TCR הקשורים בחירה הרתי על ידי מיקרוסקופ שני פוטונים.

ניתוח תמיכת פרוסות הרתי של היבטים שונים של פיתוח תא T כגון מבחר חיובי ושלילי. עבור ניסויים מוצלחים, איכות הפרוסה הרתי היא בעל חשיבות עליונה. לפיכך, פרוסות הרתי צריך להיבדק כדי להבטיח את שלמות הרקמה הרתי וכי agarose סביב פרוסה הרתי הוא תמים ...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures at JoVE.com

Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures

אנו מתארים את הכנת פרוסות הרתי, בשילוב עם cytometry זרימה, יכול לשמש מודל בחירה חיובית ושלילית לפתח תאי T. פרוסות הרתי ניתן להתאים גם לניתוח באתרו של הגירה thymocyte, לוקליזציה, ואיתות באמצעות immunofluorescence ושני פוטון מיקרוסקופית.

הכנה ויישומים של תרבויות Organotypic הרתי Slice

Thymic selection proceeds in a unique and highly organized thymic microenvironment resulting in the generation of a functional, self-tolerant T cell ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

גזירת הרתי T-cell לימפומה קווים מ כספומט - / -</sup ו P53 - / -</sup עכברים

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

נוהל 1.5 שעה עבור זיהוי אנטרוקוקוס מינים ישירות מתרבויות דם

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

שיטה פשוטה ויעילה על מנת לבודד המקרופאגים מתרבויות ראשי מעורבות של תאים בכבד למבוגרים

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field

אבחון מהיר של וירוס שפעת העופות בעופות בר: שימוש ניידים rRT-PCR ו מיובשים בהקפאה ריאגנטים בתחום

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

ההכנה של ה-DNA ויראלי של Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

הדור של תרבויות רפסודות Organotypic של קרטינוציטים אדם מן המעלה הראשונה

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

בידוד ראשי microglia מ מעורבים בתרביות תאים גליה של רקמת מוח החולדה ילודים

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

בחינה של בחירה חיובית ושלילית הרתי ידי זרימת cytometry

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

בידוד, זיהוי, וטיהור של תאי Murine הרתי אפיתל

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

בידוד והשתלה של שתלי הרתי Murine בני שונים.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...