Name: preparation and applications of organotypic thymic slice cultures
Uploaded: 2016-08-06T15:00:00
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We would like to thank Marilaine Fournier for her comments on the manuscript and Jos&#233;e Tessier for technical assistance. C57BL/6-Tg (OT-I)-RAG1&lt;tmMom&gt; #4175 were obtained through the NIAID Exchange Program, NIH. Support for this research is provided by a grant from the SickKids Foundation and CIHR-IHDCYN (NI15-002), an operating grant from the CIHR-III (MOP-142254), and start-up funds from the FRQS (&#201;tablissement de jeunes chercheurs) and H&#244;pital Maisonneuve-Rosemont Foundation to HJM. HJM is a junior 1 scholar of the FRQS, a CIHR New Investigator (MSH-141967), and a Cole Foundation Early Career Transition award recipient.

Hôpital Maisonneuve-Rosemont - सभी जानवरों के अध्ययन के लिए प्रोटोकॉल केंद्र डे अति सूक्ष्म पर पशु की देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया। Thymic स्लाइस की तैयारी और एकल कक्ष निलंबन के लिए 1. कटाई माउस थाइमस <ol><li> ग्रीवा ?...

यहाँ हम थाइमिक स्लाइस और प्रवाह cytometry द्वारा मढ़ा पूर्व चयन MHC वर्ग मैं-प्रतिबंधित TCR ट्रांसजेनिक thymocytes के कुशल सकारात्मक और नकारात्मक चयन के प्रतिनिधि परिणाम की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। इस <...

टी कोशिकाओं थाइमस जो समय के दौरान वे कई चौकियों कि एक कार्यात्मक, आत्म-सहिष्णु टी सेल प्रदर्शनों की सूची 1-3 की पीढ़ी सुनिश्चित मुठभेड़ में विकास मध्यवर्ती की एक श्रृंखला के माध्यम से अलग। सकारात्मक चयन टी सेल रिसेप्टर्स (TCR), पहचानने में सक्षम कम से मध्यम आत्मीयता, पेप्टाइड को cortical थाइमिक उपकला कोशिकाओं (CTEC) 2,3 पर प्रमुख उतक अनुरूपता जटिल अणुओं (एमएचसी) द्वारा प्रस्तुत के साथ thymocytes के अस्तित्व को बढ़ावा देता है। नकारात्मक चयन और विनियामक टी (टी रेग) सेल के विकास उन्मूलन या thymocytes कि स्वयं पेप्टाइड एमएचसी 2,4 द्वारा प्रस्तुत करने के लिए दृढ़ता से जवाब के मोड़ के माध्यम से आत्म-सहिष्णुता की स्थापना के लिए योगदान करते हैं। अपरिपक्व सीडी 4 + सीडी 8 + डबल सकारात्मक (डीपी) TCRs कि चयन प्रक्रिया से गुजरती परिपक्व टी सेल उप-जनसंख्या में अंतर व्यक्त thymocytes, जिनमें से अधिकांश MHC वर्ग मैं-प्रतिबंधित सीडी 8 + साइटोटोक्सिक हैंया MHC वर्ग द्वितीय-प्रतिबंधित सीडी 4 + सहायक एकल सकारात्मक (सपा) टी कोशिकाओं, थाइमस बाहर निकलने माध्यमिक lymphoid अंगों में 1-3 प्रेरक कार्य करने के लिए पहले। टी सेल विकास की जटिलता को जोड़ना गतिशील प्रवास और stromal सेल नेटवर्क 5-9 भर thymocytes के विकास के सेलुलर मुठभेड़ों है। ये stromal कोशिकाओं thymocyte विकास में अलग भूमिका निभाते हैं और विभिन्न थाइमिक cortical और दिमाग़ी क्षेत्रों में जहां सकारात्मक और नकारात्मक चयन घटित 10 के बीच वितरित कर रहे हैं। सकारात्मक चयन मुख्य रूप से कोर्टेक्स में जगह लेता है, वहाँ जमते सबूत है कि डी पी thymocytes मज्जा की ओर पलायन और इससे पहले कि वे सुझाव है कि मज्जा सकारात्मक चयन और वंश के पूरा होने के लिए अतिरिक्त संकेतों आवश्यक प्रदान कर सकता है परिपक्व टी कोशिकाओं में अंतर TCR संकेतों की आवश्यकता होती है करने के लिए जारी है भेदभाव 11,12। आगे की,विशेष दिमाग़ी थाइमिक उपकला कोशिकाओं (mTEC) कि एक्सप्रेस और वर्तमान ऊतक प्रतिबंधित एंटीजन autoreactive thymocytes 13,14 का विलोपन की सुविधा की मौजूदगी के बावजूद, नकारात्मक चयन का एक बड़ा हिस्सा जवाब में कोर्टेक्स में होता सर्वत्र व्यक्त करने के लिए आत्म-पेप्टाइड वृक्ष के समान द्वारा प्रस्तुत कोशिकाओं 15,16। इस प्रकार, टी सेल के विकास की सही मॉडल, एक अत्यंत संगठित थाइमिक microenvironment प्रदान करनी चाहिए बरकरार cortical और दिमाग़ी क्षेत्रों, कि thymocytes और stromal कोशिकाओं के बीच बातचीत की सुविधा, और जैसा कि इन कोशिकाओं को सकारात्मक और नकारात्मक चयन से गुजरना thymocyte प्रवास का समर्थन करता है के साथ। पूर्व vivo पूरक करने के लिए बगल में, सकारात्मक और नकारात्मक चयन, इन विट्रो के एक नंबर का अध्ययन करने के लिए एक साधन के रूप में thymocytes के विश्लेषण करती है, और टी सेल के विकास के मॉडल में विवो 17-22 विकसित किया गया है। यह बेहद मुश्किल हो गया है पुनरावृत्ति करनाइन विट्रो में सकारात्मक चयन, लेकिन स्टेम सेल आबादी या stromal कोशिकाओं के साथ टी सेल व्यापारियों पायदान ligand व्यक्त करने का coculture, विशेष रूप से OP9-DL1 / 4 कोशिकाओं, के लिए इन विट्रो मॉडल में यह एक अमूल्य बनाने की क्षमता टी वंश प्रतिबद्धता और सीमित सकारात्मक चयन का समर्थन किया है अध्ययन टी सेल विकास 23-25। इस प्रणाली की सीमाओं, हालांकि, तथ्य यह है कि इन कोशिकाओं अद्वितीय पेप्टाइड प्रसंस्करण मशीनरी थाइमिक stromal कोशिकाओं में पाया जाता है और तीन आयामी थाइमिक microenvironment कमी शामिल है। अधिक तकनीकी रूप से बोझिल, सीटू और थाइमिक चयन की विवो मॉडल में इन विट्रो प्रणाली से संबंधित बाधाओं में से कुछ दूर कर सकते हैं हालांकि। Reaggregate थाइमिक अंग संस्कृतियों (RTOC) में परिभाषित thymocytes और थाइमिक stromal कोशिकाओं 18,26,27 का मिश्रण होते हैं। ये थाइमिक उपकला कोशिका reaggregates बनाए रखने के MHC वर्ग मैं और द्वितीय अभिव्यक्ति और विकास का समर्थन कर सकते हैंदोनों पारंपरिक टी सेल सबसेट के NT, अभी तक अभी भी cortical और दिमाग़ी संरचनाओं परिभाषित कमी। भ्रूण थाइमिक अंग संस्कृति (FTOC) कि lymphoreplete थाइमिक खण्डों में lymphodepleted थाइमिक पालियों की या thymocytes के इंजेक्शन के माध्यम से फांसी ड्रॉप संस्कृति के माध्यम से thymocytes के साथ वरीयता प्राप्त किया जा सकता है और सीडी 4 + और ​​सीडी 8 + टी के कुशल विकास का समर्थन टी सेल के विकास का एक लोकप्रिय मॉडल है संस्कृति 18,28-31 में समय के साथ कोशिकाओं। भ्रूण थाइमिक पालियों की संस्कृति की दीक्षा में वहाँ mTECs की कमी है, लेकिन परिभाषित cortical और दिमाग़ी संरचनाओं की स्थिति पर निर्भर करता है समय के साथ विकसित कर सकते हैं। एक महत्वपूर्ण विचार है कि इस मॉडल रियायत के बनाम वयस्क टी सेल विकास भ्रूण का समर्थन कर सकते है। अंत में, वयस्क चूहों में परिभाषित थाइमिक व्यापारियों की intrathymic इंजेक्शन तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, लेकिन स्पष्ट रूप से समर्थन करने के लिए एक वातावरण प्रदान करता है विवो में टी सेल विकास। सीटू और इन विवो मॉडल में इन उत्कृष्ट उपकरणों टी रहे हैंओ अध्ययन टी सेल के विकास और उनके उपयोग के लिए एक प्रयोग के द्वारा-प्रयोग के आधार पर विचार किया जाना चाहिए। Thymic स्लाइस, हालांकि, हाल ही संभावना के साथ बगल में thymic चयन का अध्ययन करने के लिए अद्वितीय, जटिल है, और आम तौर पर उच्च throughput प्रयोगों को समायोजित करने के लिए एक बहुमुखी, पूरक मॉडल के रूप में उभरा है। Thymic स्लाइस cortical और दिमाग़ी क्षेत्रों की अखंडता को बनाए रखने और stromal कोशिकाओं का एक ढांचा विकास के साथ ही कुशल सकारात्मक और नकारात्मक चयन 11,32-39 दौरान thymocyte प्रवास का समर्थन करता है कि प्रदान करते हैं। Thymocyte सबसेट थाइमिक स्लाइस के ऊपर जोड़ा ऊतक में और उनके उचित microenvironmental आला 34,37 की ओर पलायन। मढ़ा thymocytes congenic मार्करों या फ्लोरोसेंट लेबल के माध्यम से थाइमिक टुकड़ा अंतर्जात कोशिकाओं से प्रतिष्ठित किया जा सकता है और कई दिनों के लिए संस्कृति में बनाए रखा जा सकता है। Thymic टुकड़ा organotypic संस्कृतियों विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताथाइमिक चयन, thymocyte व्यवहार (माइग्रेशन और सेलुलर बातचीत), और thymocyte स्थानीयकरण, दूसरों के बीच में शामिल हैं टी सेल के विकास की। माउस प्रति ~ 20 थाइमिक स्लाइस उत्पन्न करने की क्षमता को देखते हुए, प्रयोगों के scalability आम तौर पर थाइमिक चयन के सीटू मॉडल में अन्य की तुलना में अधिक है। हालांकि थाइमिक स्लाइस की तैयारी ऐसे vibratome के रूप में विशेष उपकरण, और कोशिका मृत्यु के माध्यम से समय के साथ कोशिकाओं के नुकसान और एक encapsulating झिल्ली की कमी के कारण सीमित है संस्कृति में थाइमिक स्लाइस के जीवन समय की आवश्यकता है, थाइमिक स्लाइस एक शानदार मॉडल प्रदान एक परिपक्व थाइमिक microenvironment भीतर thymocytes के सिंक्रनाइज़ आबादी के थाइमिक चयन के विश्लेषण के लिए। यहाँ हम थाइमिक स्लाइस, अलगाव और thymocytes के मढ़े, और हदबंदी प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए थाइमिक स्लाइस की (थाइमस, थाइमस पालियों की agarose embedding और एम्बेडेड ऊतक के vibratome सेक्शनिंग कटाई सहित) की तैयारी का वर्णन है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1000S&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuSieve GTG Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50080</td>
			<td>Low melting temperature agarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Mold (Truncated - T12)</td>
			<td>Polyciences</td>
			<td>18986</td>
			<td>22mm x 22mm square, truncated to 12mm x 12mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Edge Prep Blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td>74-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Adhesive</td>
			<td>3M&#160;</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4 &#181;m Cell Culture Inserts&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353090</td>
			<td>Of several brands tested, these maintained the cells atop the slices the best</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21600-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 with L-glutamine</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>350-000-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>080-110</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine, 200mM</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>609-065-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin, 100X</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-201-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A15890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Tenbroeck Tissue Grinders</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Filter</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>U-CMN-255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube Sample Pestle</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F19922-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Nylon Cell Strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Inox Tip</td>
			<td>Dumont&#160;</td>
			<td>RS-5047</td>
			<td>Fine tip curved forceps, size .17&#160;X .10mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Forceps</td>
			<td>Dumont&#160;</td>
			<td>RS-5090&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and applications of organotypic thymic slice cultures

एक अद्वितीय और अत्यधिक आयोजित थाइमिक microenvironment एक कार्यात्मक, आत्म-सहिष्णु टी सेल प्रदर्शनों की सूची की पीढ़ी में जिसके परिणामस्वरूप में thymic चयन आय। इन विट्रो मॉडल में टी वंश प्रतिबद्धता और विकास का अध्ययन करने के लिए इस प्रक्रिया में बहुमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान की है। हालांकि, इन प्रणालियों पूरा तीन आयामी थाइमिक परिवेश टी सेल के विकास के लिए आवश्यक की कमी है और इसलिए, इन विवो थाइमिक चयन की अधूरी approximations हैं। मॉडलिंग टी सेल विकास से संबंधित चुनौतियों में से कुछ सीटू मॉडल है कि एक अक्षुण्ण थाइमिक microenvironment कि पूरी तरह से टी कोशिकाओं के विकास की थाइमिक चयन का समर्थन प्रदान करने में उपयोग करके दूर किया जा सकता है। Thymic टुकड़ा organotypic संस्कृतियों सीटू तकनीक में मौजूदा पूरक हैं। Thymic स्लाइस थाइमिक cortical और दिमाग़ी क्षेत्रों की अखंडता की रक्षा और एक परिभाषित विकास मंच के या अंतर्जात टी सी की मढ़ा thymocytes के विकास का अध्ययन करने के लिए एक मंच प्रदानएक परिपक्व थाइमिक microenvironment भीतर एल। माउस प्रति ~ 20 स्लाइस उत्पन्न करने की क्षमता को देखते हुए, थाइमिक स्लाइस उच्च throughput प्रयोगों के लिए scalability के मामले में एक अनूठा लाभ प्रस्तुत करते हैं। इसके अलावा, विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि से अलग थाइमिक सबसेट या अन्य सेल आबादी मढ़ी थाइमिक स्लाइस और संभावित पैदा करने में आसानी रिश्तेदार इस विधि की बहुमुखी प्रतिभा को बढ़ाता है। यहाँ हम थाइमिक स्लाइस, अलगाव और thymocytes के ओवरले, और प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए थाइमिक स्लाइस की हदबंदी की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। इस प्रणाली को भी गैर-परंपरागत टी सेल विकास का अध्ययन करने के साथ ही thymocyte प्रवास, thymocyte-stromal सेल बातचीत, और TCR दो photon माइक्रोस्कोपी द्वारा थाइमिक चयन के साथ जुड़े संकेतों कल्पना अनुकूलित किया जा सकता है।

इस तरह के सकारात्मक और नकारात्मक चयन के रूप में टी सेल के विकास के विभिन्न पहलुओं की Thymic स्लाइस समर्थन विश्लेषण। सफल प्रयोगों के लिए, थाइमिक टुकड़ा की गुणवत्ता सर्वोपरि है। इस प्रका?...

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Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures

हम थाइमिक स्लाइस कि, प्रवाह cytometry के साथ संयोजन में, टी कोशिकाओं के विकास के सकारात्मक और नकारात्मक चयन मॉडल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की तैयारी का वर्णन है। Thymic स्लाइस भी thymocyte प्रवास, स्थानीयकरण के बगल में विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, और immunofluorescence और दो ​​photon माइक्रोस्कोपी के माध्यम से संकेत।

तैयारी और Organotypic Thymic टुकड़ा संस्कृतियों के आवेदन

Thymic selection proceeds in a unique and highly organized thymic microenvironment resulting in the generation of a functional, self-tolerant T cell ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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