Name: preparation and applications of organotypic thymic slice cultures
Uploaded: 2016-08-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures at JoVE.com

We would like to thank Marilaine Fournier for her comments on the manuscript and Jos&#233;e Tessier for technical assistance. C57BL/6-Tg (OT-I)-RAG1&lt;tmMom&gt; #4175 were obtained through the NIAID Exchange Program, NIH. Support for this research is provided by a grant from the SickKids Foundation and CIHR-IHDCYN (NI15-002), an operating grant from the CIHR-III (MOP-142254), and start-up funds from the FRQS (&#201;tablissement de jeunes chercheurs) and H&#244;pital Maisonneuve-Rosemont Foundation to HJM. HJM is a junior 1 scholar of the FRQS, a CIHR New Investigator (MSH-141967), and a Cole Foundation Early Career Transition award recipient.

Protokoller for alle dyrestudier ble godkjent av Animal Care utvalget ved Centre de recherche - Hôpital Maisonneuve-Mont. 1. Høsting Mouse Thymus for forberedelse av thymus Slices og enkelt celle utestengelse <ol><li> Avlive mus med CO 2 etterfulgt av halshugging. </li><li> I en laminær hette, pin musen ventral siden opp til en disseksjon bord. Spray mus med 70% etanol. Fjerne eventuelt overskudd av alkohol ved dabbing med gasbind for å forhindre etanol kommer inn i brysthulen og skade på vev. ...

Her beskriver vi en protokoll for fremstilling av tymiske skiver og representative resultater av effektiv positiv og negativ seleksjon av overleggspreseleksjon MHC klasse I-begrenset TCR-transgene thymocytter ved flowcytometri. Dette systemet har vært brukt med lignende suksess for å støtte positiv utvelgelse av MHC klasse II-begrenset CD4 + T-celler fra preseleksjon DP thymocytter 32, og, i nærvær av agonisten antigen, negativ seleksjon og thymus T reg utvikling 11,12, 36,38,3...

T-celler differensierer gjennom en rekke utviklingsmessige mellomprodukter i thymus i løpet av hvilken tid de støter på flere kontrollpunkter som sikrer dannelsen av en funksjonell, selv tolerant T-cellerepertoaret 1-3. Positiv utvelgelse fremmer overlevelsen av thymocyttene med T celle reseptorer (TCR) er i stand til å gjenkjenne, med lav til moderat affinitet, peptid presentert av store histocompatibility komplekse molekyler (MHC) på kortikale thymus epitelceller (cTEC) 2,3. Negativ seleksjon og regulatoriske T (T reg) celleutviklingen bidra til etablering av selvtoleranse via eliminering eller spredning av thymocytter som reagerer sterkt på selv peptid presentert av MHC 2,4. Umodne CD4 + CD8 + dobbel positive (DP) thymocytter uttrykker TCR som passerer utvelgelsesprosessen differensieres til modne T-celle subpopulasjoner, de fleste som er MHC klasse I-begrenset CD8 + cytotoksiskeeller MHC klasse II-begrenset CD4 + hjelpe enkle positive (SP) T-celler, før du avslutter thymus å utføre effektorfunksjoner i de sekundære lymfoide organer 1-3. Å legge til kompleksiteten av T-celle utvikling er den dynamiske migrasjon og cellulære møter for utvikling av thymocytter i løpet av stromal cellenettverket 5-9. Disse stromale celler spille forskjellige roller i thymocytt utvikling og er differensiert fordelt mellom thymus kortikale og marg regioner hvor positiv og negativ seleksjon forekommer 10. Selv om positiv utvelgelse skjer først og fremst i hjernebarken, det er vist at DP thymocytter migrere til medulla og fortsette å kreve TCR signaler før de differensieres til modne T-celler som tyder på at marg kan gi ytterligere signaler nødvendig for gjennomføring av positiv utvelgelse og avstamning differensiering 11,12. Lengre,til tross for tilstedeværelsen av spesialiserte marg thymus epitelceller (MTEC) som uttrykker og presentere vev-begrenset antigener tilrettelegging sletting av autoreaktive thymocytter 13,14, oppstår en stor andel av negativ seleksjon i hjernebarken som svar på allestedsnærværende uttrykt selv peptid presentert av dendrittiske celler 15,16. Således må nøyaktige modeller av T-celle utvikling tilveiebringe en høyt organisert thymus-mikromiljøet, med intakt kortikal og medullære regioner, som muliggjør interaksjon mellom thymocytter og stromaceller, og støtter thymocytt migrasjon som disse cellene gjennomgå positiv og negativ seleksjon. For å komplettere ex vivo-analyser av tymocytter som et middel til å studere positiv og negativ seleksjon, et antall in vitro, in situ, og in vivo-modeller for T-celle utvikling er blitt utviklet 17-22. Det har vært svært vanskelig å rekapitulerepositiv seleksjon in vitro, men coculture av stamcellepopulasjoner eller T-celle forløpere med stromale celler som uttrykker Notch ligand, særlig OP9-DL1 / 4 celler, har evnen til å støtte T avstamning engasjement og begrenset positiv utvelgelse som gjør det en uvurderlig in vitro modell for å studien T-celle utvikling 23-25. Begrensninger av dette systemet, innbefatter imidlertid det faktum at disse cellene mangler den unike peptidet behandling av maskiner som finnes i thymus stromale celler og den tredimensjonale tymisk mikromiljøet. Selv om mer teknisk tungvint, in situ og in vivo modeller av thymus utvalg kan overvinne noen av de barrierer knyttet til in vitro-systemer. Reaggregate thymus organkulturer (RTOC) inneholder definerte blandinger av thymocytter og thymus stromale celler 18,26,27. Disse thymus epiteliale celle reaggregates opprett MHC klasse I og II uttrykk og kan støtte development av både konvensjonelle T-celle undergrupper, men mangler fortsatt definert kortikale og marg strukturer. Fetal thymus organ kultur (FTOC) er en populær modell av T-celle utvikling som kan bli seedet med thymocytter via hengende dråpe kultur lymphodepleted thymus lapper eller via injeksjon av thymocytter inn lymphoreplete thymus lapper og støtte effektiv utvikling av CD4 + og CD8 + T celler over tid i kultur 18,28-31. Ved oppstart av kulturen i foster thymus lapper det er en mangelen av mTECs, men definerte kortikale og marg strukturer kan utvikle seg over tid avhengig av forholdene. Et viktig hensyn er at denne modellen kan fortrinnsvis understøtte føtalt versus voksen T-celleutvikling. Endelig er intrathymisk injeksjon av definerte thymus forløpere i voksen mus teknisk utfordrende, men klart gir et miljø for å støtte T-celleutviklingen in vivo. Disse in situ og in vivo-modeller er gode verktøy to studie T-celle utviklingen og bruken bør vurderes på et eksperiment-by-eksperiment basis. Thymus stykker har imidlertid nylig dukket opp som en allsidig, utfyllende modell for å studere tymisk utvalg in situ med mulighet for å få plass til unike, kompleks, og generelt høyere gjennomstrømning eksperimenter. Thymus skiver opprettholde integriteten av hjernebark og marg regioner og gir et rammeverk av stromale celler som støtter thymocytt migrasjon under utvikling samt effektive positiv og negativ seleksjon 11,32-39. Thymocytt undergrupper lagt oppå thymus skiver migrere inn i vevet og til deres passende microenvironmental nisje 34,37. De kledde thymocytter kan skilles fra thymus slice endogene celler via congenic markører eller fluorescerende etiketter og kan opprettholdes i kulturen i flere dager. Tymisk skive organotypiske kulturer kan anvendes for å studere forskjellige aspekterav T-celle utvikling, inkludert thymisk utvalg, thymocytt-atferd (migrering og cellulære reaksjoner), og thymocytt lokalisering, blant andre. Gitt muligheten til å generere ~ 20 thymus skiver per mus, skalerbarhet eksperimenter er generelt større enn andre in situ modeller av thymus utvalg. Selv om fremstillingen av tymiske skiver krever spesialisert utstyr, slik som vibratome, og levetiden av tymiske skiver i kultur er begrenset på grunn av tap av celler over tid via celledød og mangelen på et innkapslende membran, thymus skiver gir en utmerket modell for analyse av tymisk utvalg av synkroniserte populasjoner av tymocytter i en moden tymisk mikromiljøet. Her beskriver vi utarbeidelsen av thymus skiver (inkludert høsting av thymus, agarose innebygging av thymus lapper og vibratome seksjonering av den innebygde vev), isolasjon og overliggende av thymocytter, og dissosiasjon av thymus skiver for flowcytometrisk analyse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1000S&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuSieve GTG Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50080</td>
			<td>Low melting temperature agarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Mold (Truncated - T12)</td>
			<td>Polyciences</td>
			<td>18986</td>
			<td>22mm x 22mm square, truncated to 12mm x 12mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Edge Prep Blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td>74-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Adhesive</td>
			<td>3M&#160;</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4 &#181;m Cell Culture Inserts&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353090</td>
			<td>Of several brands tested, these maintained the cells atop the slices the best</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21600-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 with L-glutamine</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>350-000-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>080-110</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine, 200mM</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>609-065-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin, 100X</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-201-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A15890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Tenbroeck Tissue Grinders</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Filter</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>U-CMN-255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube Sample Pestle</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F19922-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Nylon Cell Strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Inox Tip</td>
			<td>Dumont&#160;</td>
			<td>RS-5047</td>
			<td>Fine tip curved forceps, size .17&#160;X .10mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Forceps</td>
			<td>Dumont&#160;</td>
			<td>RS-5090&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and applications of organotypic thymic slice cultures

Thymus utvalgs fortsetter i en unik og svært organisert thymus mikromiljø som resulterer i produksjon av en funksjonell, selv tolerant T celle repertoar. In vitro modeller for å studere T avstamning engasjement og utvikling har gitt verdifull innsikt i denne prosessen. Imidlertid er disse systemene mangler den komplette tredimensjonale tymisk miljø som er nødvendig for T-celle utvikling og derfor er ufullstendige tilnærmelser av in vivo tymisk valg. Noen av utfordringene knyttet til modellering T-celle utvikling kan overvinnes ved hjelp av in situ modeller som gir en intakt thymus mikromiljø som fullt ut støtter thymus utvalg for å utvikle T-celler. Thymus skive organotypiske kulturer utfylle eksisterende in situ teknikker. Thymus skiver bevare integriteten til thymus kortikale og marg regioner og gi en plattform for å studere utviklingen av overtrukket thymocytter av en definert utviklingsstadiet eller av endogen T calen innenfor en moden thymus mikromiljøet. Gitt muligheten til å generere ~ 20 skiver per mus, thymus skiver presentere en unik fordel med tanke på skalerbarhet for high throughput eksperimenter. Videre er relativt enkelt å generere thymus skiver og potensial til å legge på forskjellige thymus undergrupper eller andre cellepopulasjoner fra ulike genetiske bakgrunn øker allsidigheten til denne metoden. Her beskriver vi en protokoll for fremstilling av thymus-skiver, isolering og overlapping av thymocytter, og dissosiasjon av thymus-skiver for flowcytometrisk analyse. Dette systemet kan også tilpasses for å studere ikke-konvensjonelle T-celle utviklingen, så vel som å visualisere thymocytt-migrasjon, thymocytt-stromale celleinteraksjoner, og TCR-signaler i forbindelse med tymisk utvalg av to-foton mikroskopi.

Tymisk skiver støtte analyse av ulike aspekter av T-celle utvikling som positiv og negativ seleksjon. For vellykkede eksperimenter, kvaliteten på thymus skive er det viktigste. Således bør tymiske skiver undersøkes for å sikre integriteten av thymus-vev, og at den agarose som omgir thymisk skive er intakte (figur 1A). Overflatespenning kan bli skadet når den agarose er skadet forårsaker en betydelig reduksjon i antallet thymocytter som migrerer...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures at JoVE.com

Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures

Vi beskriver fremstillingen av thymus skiver som, i kombinasjon med flowcytometri, kan brukes til å modellere positiv og negativ seleksjon for utvikling av T-celler. Thymus-skiver kan også bli tilpasset for in situ-analysen av thymocytt-migrasjon, lokalisering, og signalering via immunfluorescens og to-foton mikroskopi.

Utarbeidelse og Anvendelser av organotypiske Thymus- skive kulturer

Thymic selection proceeds in a unique and highly organized thymic microenvironment resulting in the generation of a functional, self-tolerant T cell ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

Generering av Organotypic Raft Cultures fra primære humane keratinocytter

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Primær microglia Isolasjon fra Blandede glial cellekulturer fra Neonatal Rat hjernevev

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

Undersøkelse av thymus Positiv og negativ seleksjon av flowcytometri

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Isolasjon, Identifikasjon, og rensing av Muse thymisk Epitelceller

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

Isolasjon og Transplantasjon av forskjellige alderen Murine tymisk grafts.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...