Name: preparation and applications of organotypic thymic slice cultures
Uploaded: 2016-08-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures at JoVE.com

We would like to thank Marilaine Fournier for her comments on the manuscript and Jos&#233;e Tessier for technical assistance. C57BL/6-Tg (OT-I)-RAG1&lt;tmMom&gt; #4175 were obtained through the NIAID Exchange Program, NIH. Support for this research is provided by a grant from the SickKids Foundation and CIHR-IHDCYN (NI15-002), an operating grant from the CIHR-III (MOP-142254), and start-up funds from the FRQS (&#201;tablissement de jeunes chercheurs) and H&#244;pital Maisonneuve-Rosemont Foundation to HJM. HJM is a junior 1 scholar of the FRQS, a CIHR New Investigator (MSH-141967), and a Cole Foundation Early Career Transition award recipient.

Протоколы для всех исследований на животных были одобрены Комитетом по уходу за животными в Центре де Recherche - Hôpital Maisonneuve-Шиллер. 1. Заготовка мыши Thymus по подготовке тимуса Ломтики и одноклеточных суспензий <ol><li> Эвтаназии мышь с CO 2 с последующим смещением шейных позвонков. </li>...

Здесь мы опишем протокол для подготовки тимуса срезов и репрезентативных результатов эффективной позитивной и негативной селекции накладным предварительного отбора I-ограниченный TCR трансгенных тимоцитов класса MHC с помощью проточной цитометрии. Эта система была использована с таки...

Т - клетки дифференцируются через ряд промежуточных развития в тимусе , во время которого они сталкиваются несколько контрольно - пропускных пунктов , которые обеспечивают формирование функциональной, само толерантные Т - клеточного репертуара 1-3. Положительный отбор способствует выживанию тимоцитов с рецепторами Т - клеток (TCR) , способных распознавать, с низкой до умеренной аффинностью, пептида , представленные главного комплекса гистосовместимости (MHC молекул) на корковых тимуса эпителиальных клеток (CTEC) 2,3. Отрицательный отбор и развитие клеток регуляторных Т (Т р) способствовать созданию аутотолерантности через ликвидацию или утечки тимоцитов , которые сильно реагируют на само-пептида , представленного MHC 2,4. Незрелые CD4 + CD8 + двойной положительный (DP) тимоцитов выражения ТКО , которые проходят процесс отбора дифференцируются в зрелые субпопуляции Т - клеток, большинство из которых являются MHC класса I-ограниченный CD8 + цитотоксическихили МНС класса II с ограничением CD4 + хелперов одиночных положительных (SP) Т - клетки, перед выходом из тимуса выполнять эффекторные функции во вторичных лимфоидных органах 1-3. Добавление к сложности развития Т - клеток является динамическая миграция и клеточные столкновения развивающихся тимоцитов в рамках всей сети стромальных клеток 5-9. Эти стромальные клетки играют различные роли в развитии тимоцитов и дифференциально распределены между тимуса коркового и мозгового регионов , где положительные и отрицательные отбор происходят 10. Хотя положительный отбор происходит в основном в коре головного мозга, есть накопление доказательств того, что DP тимоциты мигрируют в костный мозг и продолжают требовать сигналов TCR, прежде чем они дифференцируются в зрелые Т-клетки, предполагающих, что продолговатый может предоставлять дополнительные сигналы, необходимые для завершения положительного отбора и линии дифференциация 11,12. В дальнейшем,несмотря на наличие специализированных медуллярных тимуса эпителиальных клеток (Mtec) , которые выражают и присутствующих тканей с ограничением антигенов , способствующих удаления аутореактивных тимоцитов 13,14, большая часть негативной селекции происходит в коре головного мозга в ответ на Повсеместно выражали себя пептид , представленный дендритные клетки 15,16. Таким образом, точные модели развития Т-клеток должны обеспечивать высокоорганизованной тимуса микросреду, с неповрежденной коркового и мозгового областей, что облегчает взаимодействие между тимоцитов и стромальных клеток, а также поддерживает миграцию тимоцитов, как эти клетки подвергаются позитивной и негативной селекции. В дополнение к экс виво анализ тимоцитов в качестве средства изучения позитивной и негативной селекции, ряд ин витро, на месте, и в естественных условиях модели развития Т - клеток, были разработаны 17-22. Это было известно, трудно резюмироватьположительный выбор в пробирке, но сокультивирования популяций стволовых клеток или предшественников Т - клеток с стромальных клеток , экспрессирующих лиганд Notch, в частности OP9-DL1 4 клеток /, имеет возможность поддерживать T коммитирование и ограниченный положительный выбор делает его незаменимым в пробирке модель для исследование развития Т - клеток 23-25. Ограничения этой системы, однако, включают в себя тот факт, что эти клетки лишены уникальной обработки пептидный машины нашли в вилочковой стромальных клеток и трехмерную тимуса микросреду. Хотя технически более громоздким, на месте и в естественных условиях модели тимуса отбора могут преодолеть некоторые из барьеров , связанных с системами в пробирке. Перегруппировываться тимуса культуры органов (РИПЦ) содержат определенные смеси тимоцитов и тимуса стромальных клеток 18,26,27. Эти тимуса эпителиальные reaggregates клеток поддерживать экспрессию класса I и II MHC и может поддерживать developmeнт как обычных подмножеств Т-клеток, но все еще не имеют определенные коркового и мозгового структур. Эмбрионального тимуса органной культуры (FTOC) является популярной моделью развития Т - клеток , которые могут быть посеяны с тимоцитов через висячей капле культуры lymphodepleted тимуса долей или через инъекции тимоцитов в lymphoreplete тимуса долей и поддерживать эффективное развитие CD4 + и CD8 + T клетки с течением времени в культуре 18,28-31. В начала культивирования эмбриональных тимуса долей существует недостаток mTECs, но определенные коркового и мозгового структуры могут развиваться с течением времени в зависимости от условий. Важным моментом является то, что эта модель может преимущественно поддерживать плода по сравнению с развитием взрослых Т-клеток. Наконец, внутритимусной инъекция определенных предшественников тимуса у взрослых мышей является технически сложной задачей, но очевидно, обеспечивает среду для поддержки Развитие Т - клеток в естественных условиях. Они на месте и в естественных условиях модели являются отличными инструментами то развитии исследования Т-клеток и их использование должно рассматриваться на основе эксперимента, по-эксперимента. Тимуса ломтики, тем не менее, в последнее время появились в качестве универсального, комплементарной модели для исследования тимуса выбор на месте с возможностью размещения уникальной, сложной и в целом выше экспериментов пропускной способности . Тимуса ломтики сохранить целостность коркового и мозгового вещества регионов и обеспечить основу для стромальных клеток , которая поддерживает миграцию тимоцитов в процессе развития, а также эффективной позитивной и негативной селекции 11,32-39. Тимоцитов подмножества добавлены на вершине тимуса ломтиками мигрируют в ткани и их соответствующей нише микросреды 34,37. Накладываемого тимоцитов можно отличить от тимуса срезов эндогенных клеток с помощью конгенных маркеров или флуоресцентных меток и может поддерживаться в культуре в течение нескольких дней. Тимуса срез органотипической культуры могут быть использованы для изучения различных аспектовразвития Т-клеток, включая отбор тимуса, поведение тимоцитов (миграция и клеточных взаимодействий), а также локализации тимоцитов, среди других. Учитывая способность генерировать ~ 20 тимуса ломтиков на мышь, масштабируемость экспериментов , как правило , больше , чем другие в моделях натурных тимуса селекции. Хотя подготовка тимуса срезов требует специального оборудования, такого как vibratome, а срок службы тимуса срезов в культуре ограничено из-за потери клеток с течением времени через гибель клеток и отсутствие инкапсулирования мембраны, тимуса срезы обеспечивают отличную модель для анализа тимуса выбора синхронизированных популяций тимоцитов в зрелом тимуса микросреды. Здесь мы опишем приготовление тимуса срезов (включая заготовки тимус, агароза вложение тимуса долей и vibratome секционирования внедренного ткани), выделение и наложение тимоцитов и диссоциации тимуса срезов для анализа проточной цитометрии.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1000S&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuSieve GTG Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50080</td>
			<td>Low melting temperature agarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Mold (Truncated - T12)</td>
			<td>Polyciences</td>
			<td>18986</td>
			<td>22mm x 22mm square, truncated to 12mm x 12mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Edge Prep Blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td>74-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Adhesive</td>
			<td>3M&#160;</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4 &#181;m Cell Culture Inserts&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353090</td>
			<td>Of several brands tested, these maintained the cells atop the slices the best</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21600-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 with L-glutamine</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>350-000-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>080-110</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine, 200mM</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>609-065-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin, 100X</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-201-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A15890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Tenbroeck Tissue Grinders</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Filter</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>U-CMN-255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube Sample Pestle</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F19922-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Nylon Cell Strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Inox Tip</td>
			<td>Dumont&#160;</td>
			<td>RS-5047</td>
			<td>Fine tip curved forceps, size .17&#160;X .10mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Forceps</td>
			<td>Dumont&#160;</td>
			<td>RS-5090&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and applications of organotypic thymic slice cultures

Тимуса продолжается отбор в уникальной и высоко организованной тимуса микросреды приводит к генерации функционального, само толерантные Т - клеточного репертуара. В пробирке модели для изучения T коммитирование и развития предоставили ценную информацию в этом процессе. Тем не менее, эти системы не имеют полную трехмерную тимуса среду , необходимую для развития Т - клеток и, следовательно, являются неполными аппроксимации тимуса селекции в естественных условиях. Некоторые из проблем , связанных с развитием моделирования Т - клеток может быть преодолена путем использования в моделях на места , которые обеспечивают интактного тимуса микросреду , который полностью поддерживает тимуса выбор развивающихся Т - клеток. Тимуса культуры ломтик органотипической дополнение к существующим методам в точке. Тимуса ломтики сохранить целостность тимуса коркового и мозгового регионов и обеспечить платформу для изучения развития накладными тимоцитах определенной стадии развития или эндогенного Т сгезов внутри зрелого тимуса микросреды. Учитывая способность генерировать ~ 20 срезов на мышь, тимуса ломтики представляют собой уникальное преимущество с точки зрения масштабируемости для высокопроизводительных экспериментов. Кроме того, относительная легкость в создании тимуса срезов и потенциал для наложения различных подмножеств тимуса или других клеточных популяций из разных генетических фонов повышает универсальность этого метода. Здесь мы опишем протокол для подготовки тимуса срезов, изоляции и наложения тимоцитов и диссоциации тимуса срезов для анализа проточной цитометрии. Эта система также может быть адаптирована для изучения развития нетрадиционного Т-клеток, а также визуализировать тимоцитов миграции, тимоцитов-стромальных взаимодействий клеток и TCR сигналов, связанных с вилочковой селекции с помощью двухфотонной микроскопии.

Тимуса анализ поддержки ломтиков различных аспектов развития Т-клеток, таких как позитивной и негативной селекции. Для успешных экспериментов, качество тимуса среза имеет первостепенное значение. Таким образом, тимуса срезы следует изучить , чтобы гаранти?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures at JoVE.com

Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures

Описано получение тимуса срезов, которые, в сочетании с проточной цитометрии, могут быть использованы для моделирования позитивной и негативной селекции развития Т-клеток. Тимуса ломтики также могут быть адаптированы для на месте анализа тимоцитов миграции, локализации и сигнализации с помощью иммунофлуоресценции и двухфотонной микроскопии.

Приготовление и применение Органотипической тимуса срез культуры

Thymic selection proceeds in a unique and highly organized thymic microenvironment resulting in the generation of a functional, self-tolerant T cell ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Вывод тимуса лимфомы Т-клеточных линий из Atm - / -</sup И Р53 - / -</sup Мыши

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

1,5 час порядок идентификации Enterococcus Виды Непосредственно из культуры крови

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Простой и эффективный способ изолировать Макрофаги из смешанного первичных культурах клеток взрослого организма Печень

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field

Экспресс-диагностики вируса птичьего гриппа у диких птиц: Использование портативных-ПЦР и сублимированные реагенты в поле

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Подготовка вирусных ДНК из нуклеокапсидов

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

Генерация органотипической культур Плот из первичных кератиноцитов человека

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Первичная изоляция Микроглия из смешанного глиальных клеточных культур из тканей новорожденных мозга крысы

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

Экспертиза тимуса позитивной и негативной селекции с помощью проточной цитометрии

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Выделение, идентификация, и очистка мышиного тимуса эпителиальных клеток

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

Выделение и Трансплантация различных престарелых мышиных тимуса трансплантатов.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...