Name: preparation and applications of organotypic thymic slice cultures
Uploaded: 2016-08-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures at JoVE.com

We would like to thank Marilaine Fournier for her comments on the manuscript and Jos&#233;e Tessier for technical assistance. C57BL/6-Tg (OT-I)-RAG1&lt;tmMom&gt; #4175 were obtained through the NIAID Exchange Program, NIH. Support for this research is provided by a grant from the SickKids Foundation and CIHR-IHDCYN (NI15-002), an operating grant from the CIHR-III (MOP-142254), and start-up funds from the FRQS (&#201;tablissement de jeunes chercheurs) and H&#244;pital Maisonneuve-Rosemont Foundation to HJM. HJM is a junior 1 scholar of the FRQS, a CIHR New Investigator (MSH-141967), and a Cole Foundation Early Career Transition award recipient.

Protokoll för alla djurstudier godkändes av Animal Care kommittén vid Centre de recherche - Hôpital Maisonneuve-Rosemont. 1. Skörd Mouse Thymus för framställning av tymus skivor och enkelcellsuspensioner <ol><li> Avliva musen med CO2 följt av cervikal dislokation. </li><li> I en huv med laminärt flöde, stift musen ventrala sidan upp till en dissektion kortet. Spraya musen med 70% etanol. Ta bort överflödigt alkohol genom att badda med gasväv för att förhindra etanol från att komma in...

Här beskriver vi ett protokoll för beredning av tymiska skivor och representativa resultat av effektiv positiv och negativ selektion av överlagrade urvals MHC klass I-begränsad TCR transgena tymocyter med flödescytometri. Detta system har använts med liknande framgång för att stödja positiv selektion av MHC klass II-begränsade CD4 + T-celler från förvals DP tymocyter 32, och, i närvaro av agonist-antigen, negativ selektion och tymisk T reg utveckling 11,12, 36,38,39,43,...

T-celler differentierar genom en serie av utvecklingsmässiga mellanprodukter i tymus under vilken tid de stöter på flera kontrollpunkter som säkerställer alstringen av en funktionell, självtoleranta T-cellrepertoar 1-3. Positiv selektion gynnar överlevnaden av tymocyter med T-cellreceptorer (TCR) förmåga att känna igen, med låg till måttlig affinitet, peptid som presenteras av MHC molekyler (MHC) på kortikala tymiska epitelceller (CTEC) 2,3. Negativ selektion och regulatoriska T (T reg) cell utveckling bidra till upprättandet av självtolerans genom att undanröja eller avledning av tymocyter som svarar starkt själv peptid presenteras av MHC 2,4. Omogna CD4 + CD8 + dubbel positiv (DP) tymocyter uttrycker TCR som passerar urvalsprocessen differentierar till mogna T-cellspopulationer, varav de flesta är MHC klass I-begränsade CD8 + cytotoxiskaeller MHC klass II-begränsade CD4 + hjälpar enstaka positiva (SP) T-celler, innan du lämnar tymus att utföra effektorfunktioner i sekundära lymfoida organ 1-3. Lägga till komplexiteten i T-cellutveckling är den dynamiska migration och cellulära möten att utveckla tymocyter hela stromaceller nätet 5-9. Dessa stromaceller spelar olika roller i tymocyt utveckling och differentiellt fördelade mellan tymiska kortikala och medullära regioner där positiva och negativa urval förekommer 10. Även positiv selektion sker främst i hjärnbarken finns ackumulerande bevis för att DP tymocyter migrera till märgen och fortsätta att kräva TCR signaler innan de differentierar till mogna T-celler tyder på att märgen kan ge ytterligare signaler som är nödvändiga för slutförandet av positiv selektion och härstamning differentiering 11,12. Ytterligare,trots närvaron av specialiserade märg tymiska epitelceller (MTEC) som uttrycker och nuvarande vävnadsbegränsade antigener underlättar radering av autoreaktiva tymocyter 13,14, sker en stor del av negativ selektion i hjärnbarken som svar på ubiquitously uttryckt själv peptid presenteras av dendritiska celler 15,16. Således måste noggranna modeller av T-cellsutveckling ger en mycket organiserad tymus mikro, med intakt kortikala och medullära regioner, som underlättar samverkan mellan tymocyter och stromaceller och stöder tymocyt migration dessa celler genomgå positiv och negativ selektion. Att komplettera ex vivo-analyser av tymocyter som ett sätt att studera positiva och negativ selektion, ett antal in vitro, in situ, och in vivo-modeller av T-cellutveckling har utvecklats 17-22. Det har varit notoriskt svårt att sammanfattapositiv urvals in vitro, men samodling av stamcellspopulationer eller T-cellsföregångare med stromala celler som uttrycker Notch-ligand, särskilt OP9-DL1 / 4-celler, har förmågan att stödja T härstamning engagemang och begränsad positiv selektion gör det en ovärderlig in vitro modell studien T-cellutveckling 23-25. Begränsningar i detta system omfattar dock det faktum att dessa celler saknar den unika peptidbearbetning maskiner som finns i tymus stromaceller och tredimensionella tymus mikromiljö. Även mer tekniskt besvärligt, in situ och in vivo-modeller av tymus val kan övervinna några av de hinder i samband med in vitro-system. Reaggregate tymiska organkulturer (RTOC) innehåller definierade blandningar av tymocyter och tymus stromaceller 18,26,27. Dessa tymiska epitelceller reaggregates upprätthålla MHC klass I och II uttryck och kan stödja development av både konventionella cellgrupper T, men ändå saknar definierade kortikala och medullära strukturer. Fetal tymus organkultur (FTOC) är en populär modell av T-cellutveckling som kan ympas med tymocyter via hängande-droppe kultur lymphodepleted tymiska lober eller via injektion av tymocyter i lymphoreplete thymic lober och stödja en effektiv utveckling av CD4 + och CD8 + T celler över tiden i kultur 18,28-31. Vid initiering av kulturen i foster tymiska lober finns en brist på mTECs, men definierade kortikala och medullära strukturer kan utvecklas över tiden beroende på förhållandena. En viktig faktor är att denna modell företrädesvis kan stödja foster kontra vuxen T-cellsutveckling. Slutligen är intratymisk injektion av definierade thymic prekursorer i vuxna möss tekniskt utmanande men klart ger en miljö för att stödja T-cellutveckling in vivo. Dessa in situ och in vivo-modeller är utmärkta verktyg to studie T-cellutveckling och deras användning bör övervägas på ett experiment-by-försök tillämpa. Tymiska skivor, men har nyligen dykt upp som en mångsidig, kompletterande modell för att studera tymus urval in situ med möjlighet att rymma unik, komplex och generellt högre genomströmning experiment. Tymiska skivor bibehålla integriteten av kortikala och medullära regioner och ger en ram för stromaceller som stöder tymocyt migration under utveckling samt effektiv positiv och negativ selektion 11,32-39. Tymocyt grupper läggs ovanpå tymiska skivor vandrar in i vävnaden och deras lämplig microenvironmental nisch 34,37. De överlagrade tymocyter kan skiljas från tymus skiva endogena celler via kongena markörer eller fluorescerande märkningar och kan upprätthållas i odling under flera dagar. Tymisk slice organotypiska kulturer kan användas för att studera olika aspekterav T-cellutveckling inklusive tymus urval, tymocyt beteende (migration och cellulära interaktioner) och tymocyt lokalisering, bland andra. Ges möjlighet att generera ~ 20 tymiska skivor per mus, är skalbarheten experiment i allmänhet större än andra in situ modeller av tymus val. Även om framställningen av tymiska skivor kräver specialiserad utrustning, såsom vibratome, och livslängden hos tymiska skivor i kultur är begränsad på grund av förlust av celler över tiden via celldöd och avsaknaden av ett inkapslingsmembran, tymiska skivor ger en utmärkt modell för analys av tymus urval av synkroniserade populationer av tymocyter inom en mogen tymus mikromiljö. Här beskriver vi framställningen av tymiska skivor (inklusive skörd tymus, agaros inbäddning av tymus lober och vibratome sektionering av den inbäddade vävnaden), isolering och överdrogos tymocyter, och dissociation av tymiska skivor för flödescytometrisk analys.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1000S&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuSieve GTG Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50080</td>
			<td>Low melting temperature agarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Mold (Truncated - T12)</td>
			<td>Polyciences</td>
			<td>18986</td>
			<td>22mm x 22mm square, truncated to 12mm x 12mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Edge Prep Blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td>74-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Adhesive</td>
			<td>3M&#160;</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4 &#181;m Cell Culture Inserts&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353090</td>
			<td>Of several brands tested, these maintained the cells atop the slices the best</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21600-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 with L-glutamine</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>350-000-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>080-110</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine, 200mM</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>609-065-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin, 100X</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-201-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A15890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Tenbroeck Tissue Grinders</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Filter</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>U-CMN-255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube Sample Pestle</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F19922-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Nylon Cell Strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Inox Tip</td>
			<td>Dumont&#160;</td>
			<td>RS-5047</td>
			<td>Fine tip curved forceps, size .17&#160;X .10mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Forceps</td>
			<td>Dumont&#160;</td>
			<td>RS-5090&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and applications of organotypic thymic slice cultures

Tymus urval fortskrider i en unik och mycket organiserad tymus mikroresulterar i genereringen av en funktionell, själv tolerant T-cellrepertoar. In vitro-modeller för att studera T härstamning engagemang och utveckling har gett värdefulla insikter i denna process. Emellertid är dessa system saknar den fullständiga tredimensionella tymisk milieu nödvändig för T-cellsutveckling och, därför, är ofullständiga approximationer av in vivo tymus urval. Några av utmaningarna i samband med cellutveckling modellering T kan övervinnas genom att använda in situ-modeller som ger en intakt tymus mikro som fullt ut stöder tymus val att utveckla T-celler. Tymus skiva organotypic kulturer komplettera befintlig in situ tekniker. Tymiska skivor bevara integriteten av tymiska kortikala och medullära regioner och tillhandahålla en plattform för att studera utvecklingen av överlagrade tymocyter av en definierad utvecklingsstadiet eller av endogena T ^alnar inom en mogen tymus mikromiljö. Ges möjlighet att generera ~ 20 skivor per mus, tymiska skivor presentera en unik fördel när det gäller skalbarhet för hög genomströmning experiment. Vidare, den relativa lätthet att generera tymiska skivor och potential att överlagra olika tymiska grupper eller andra cellpopulationer från olika genetiska bakgrunder ökar mångsidigheten hos denna metod. Här beskriver vi ett protokoll för framställning av tymus skivor, isolering och överlagring av tymocyter och dissociation av tymiska skivor för flödescytometrisk analys. Detta system kan också anpassas för att studera icke-konventionella T-cellutveckling samt visualisera tymocyt migration, tymocyt-stromal cellinteraktioner, och TCR signaler som är associerade med tymus urval av två-foton mikroskopi.

Tymus skivor stöd analys av olika aspekter av T-cellsutveckling som positiv och negativ selektion. För lyckade experiment, är kvaliteten på den tymus-skiva av största vikt. Därför bör tymiska skivor granskas för att säkerställa integriteten för tymusvävnad och att agarosen omger tymus skiva är intakt (Figur 1A). Ytspänning kan äventyras när agarosen skadas vilket orsakar en signifikant minskning av antalet tymocyter som migrerar in i v...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures at JoVE.com

Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures

Vi beskriver framställningen av tymiska segment som, i kombination med flödescytometri, kan användas för att modellera positiv och negativ selektion av att utveckla T-celler. Tymiska skivor kan även anpassas för in situ-analys av tymocyt migration, lokalisering, och signalering via immunofluorescens och två-foton mikroskopi.

Förberedelse och tillämpningar av Organotypic Thymic Slice kulturer

Thymic selection proceeds in a unique and highly organized thymic microenvironment resulting in the generation of a functional, self-tolerant T cell ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Härledning av thymic Lymfom T-cellinjer från Atm - / -</sup Och P53 - / -</sup Möss

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

Ett 1,5 timme Förfarande för identifikation av Enterococcus Arter Direkt från blododlingar

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

En enkel och effektiv metod att isolera Makrofager från Blandad Primär Cultures of Adult leverceller

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field

Snabb diagnos av aviär influensavirus hos vilda fåglar: Användning av en bärbar RRT-PCR och Frystorkad reagenser i Field

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Beredning av viral DNA från Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

Generering av Organotypiska Raft kulturer från Primary humana keratinocyter

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Primär Mikroglia Isolering från Blandade gliaceller Kulturer av nyfödda råttor Brain Tissue

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

Undersökning av thymus Positiv och negativ selektion genom flödescytometri

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Isolering, identifiering och rening av murina Thymic epitelceller

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

Isolering och transplantation av olika Aged Murina tymisk ympkvistar.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...