Name: measuring lactase enzymatic activity in the teaching lab
Uploaded: 2018-08-06T12:30:00
Duration: 4 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab at JoVE.com

ومولت بال باركنسون "زمالة بحثية في المملكة المتحدة" (منحة F1002). هذا العمل أيدته "لجنة نهر الميكونج الجديد المحقق منحة بحثية" (MR/L010933/1) وعن طريق "برنامج لجنة نهر الميكونج" منح السيد/N026004/1 على بال، وسنهم BBSRC BB/M017222/1 لطائرة. ونحن نشكر فوج 2014-15 من طلاب الصيدلة جزء 1 في جامعة ريدينغ لتشارك في التكرار الأول من هذه الأفواج العملي، واللاحقة لتلك التعليقات والمدخلات.

ملاحظة: وضعت البروتوكول أدناه التي ستعقد على مدى ساعتين (بما في ذلك الانتهاء من أوراق العمل في الفئة) في مختبر لتدريس بنيت لهذا الغرض. الخطوات التجريبية التي كانت عن عمد وضع معا لاستبعاد تحليل أكثر تفصيلاً لحركية إنزيم (نفذت في سياق هذا بالطبع استخدام نموذج البيانات)؛ ومع ذلك-كما لوحظ في المناقشة – ينص البروتوكول على قالب تحليلات متقدمة أكثر اعتماداً على مستوى تحقيق الطالب والوقت والتسهيلات.
سلامة: هذه العملية ينبغي أن يتم وفقا للقواعد لحسن الكيميائية المختبرية الممارسة (جكلب) – ينبغي أن ترتديه معدات الحماية الشخصية، بما في ذلك معطف المختبر يثبت والمتاح القفازات ونظارات السلامة في جميع الأوقات في المختبر .
1-استخراج الإنزيم
<ol><li>سحق قرص اللاكتاز واحد، تحتوي على 200 ملغ إنزيم، إلى مسحوق حتى استخدام مدافع الهاون والمدقة.</li>
	<li>ضع مسحوق الناتجة في أنبوب 15 مل المسمى "تعليق" وريسوسبيند في 10 مل من 100 ملم الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).</li>
	<li>دوامة لمدة 1 دقيقة لتعظيم استخراج الإنزيم.</li>
	<li>نقل 1 مل من التعليق إلى 1.5 مل أنبوبة الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 10,000 س ز للرواسب الجسيمات الصلبة.</li>
	<li>نقل 500 ميليلتر من المادة طافية في أنبوب نظيف 1.5 مل المسمى "استخراج اللاكتاز".</li>
</ol>2-مراقبة رد فعل اللونية
<ol><li>ميليلتر مكان 390 ملم 100 برنامج تلفزيوني في أنبوب 1.5 مل المسمى "برد الفعل".</li>
	<li>إضافة 100 ميليلتر لحل أونبج 5 مم ومزيج جيد من قبل فورتيكسينج. تنبيه: هذه العملية يستخدم اورثو-نيتروفينول-بيتا-د-جالاكتوبيرانوسيدي (أونبج) كبديل اللاكتوز. منذ أونبج مركب الفينولية، فإنه يجب التعامل مع توخي الحذر. في حالة ملامسة الجلد أونبج، يجب غسلها الجلد فورا. يجب أن تمحى أي انسكابات فورا مع مناشف ورقية التخلص منها في مجرى النفايات المناسبة.</li>
	<li>إضافة 10 ميليلتر لاستخراج إلى رد الفعل بالانبوب ومزيج جيد من قبل فورتيكسينج.</li>
	<li>مراقبة رد فعل الخليط لمدة 5 دقائق وملاحظة أية تغييرات اللونية للحل.</li>
</ol>3-قياس نشاط الإنزيم
<ol><li>إعداد أنبوبين 1.5 مل: واحدة تسمى رد فعل "B"، المسمى "عنصر تحكم واحد".</li>
	<li>إضافة ميليلتر 390 ملم 100 برنامج تلفزيوني لرد فعل ب أنبوب، 400 ميليلتر من 100 ملم برنامج تلفزيوني لأنبوب التحكم ثم قم بإضافة 100 ميليلتر من 5 مم أونبج لكل أنبوبة.</li>
	<li>خلط المحتويات من فورتيكسينج.</li>
	<li>إضافة 10 ميليلتر لاستخراج اللاكتاز إلى الأنبوب ب رد فعل، ومزيج من فورتيكسينج والسماح برد فعل على المضي قدما لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>بمجرد انقضاء المدة 1 دقيقة إضافة 500 ميليلتر من كربونات الصوديوم 1 م لكل الأنابيب لكبح إنزيم اللاكتاز بزيادة درجة الحموضة، وبالتالي إنهاء رد فعل.</li>
	<li>نقل 500 ميليلتر من كل أنبوبة في الترعة نظيف جهاز المطياف الضوئي وقياس امتصاص في 420 نانومتر باستخدام جهاز المطياف الضوئي في.</li>
	<li>ملاحظة امتصاص رد فعل ب وعينات مراقبة ومن ثم طرح قيمة عنصر التحكم من قيمة رد الفعل لاشتقاق التغيير في امتصاص سبب التحلل أونبج حضور نشاط إنزيم.</li>
</ol>4-تأثير درجة الحرارة على نشاط الإنزيم
<ol><li>إعداد التحكم ثلاثة أنابيب وأنابيب رد فعل ثلاثة كما هو موضح في القسم 3 وتسمية هذه "4 درجات مئوية"، "غرفة Temp"، و "37 درجة مئوية".</li>
	<li>وبعد إضافة الإنزيم استخراج، احتضان أنبوب واحد على الجليد، وواحدة في درجة حرارة الغرفة، وواحد في 37 درجة مئوية (في حمام مائي ساخن مسبقاً).</li>
	<li>السماح لردود الفعل على المضي قدما لمدة 1 دقيقة وثم إنهاء رد فعل بإضافة 500 ميليلتر من كربونات الصوديوم 1 م لكل أنبوبة.</li>
	<li>قياس امتصاص في 420 نانومتر لكل أنبوبة كما هو موضح في القسم 3. تسجيل القيم، طرح قيمة عنصر التحكم من قيمة رد الفعل في كل حالة على حدة.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Berg, J. M., Tymoczko, J. L., Gatto, J. G., Stryer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biochemistry. , (2015).</li><li>Jittam, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+seaweed+enzyme-catalyzed+bromination+of+bromophenol+red:+An+inquiry-based+kinetics+laboratory+experiment+for+undergraduates.">Red seaweed enzyme-catalyzed bromination of bromophenol red: An inquiry-based kinetics laboratory experiment for undergraduates.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 37, 99-105 (2009).</li><li>Troelsen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult-type+hypolactasia+and+regulation+of+lactase+expression.">Adult-type hypolactasia and regulation of lactase expression.</a> Biochimica et biophysica acta. 1723, 19-32 (2005).</li><li>Juers, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+view+of+the+action+of+Escherichia+coli+(lacZ)+beta-galactosidase.">A structural view of the action of Escherichia coli (lacZ) beta-galactosidase.</a> Biochemistry. 40, 14781-14794 (2001).</li><li>Plimmer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+presence+of+lactase+in+the+intestines+of+animals+and+on+the+adaptation+of+the+intestine+to+lactose.">On the presence of lactase in the intestines of animals and on the adaptation of the intestine to lactose.</a> Journal of Physiology. 35, 20-31 (1906).</li><li>Krebs, H. A., Salvin, E., Johnson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+of+citric+and+alpha-ketoglutaric+acids+in+the+mammalian+body.">The formation of citric and alpha-ketoglutaric acids in the mammalian body.</a> The Biochemical journal. 32, 113-117 (1938).</li><li>Vesa, T. H., Marteau, P., Korpela, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactose+intolerance.">Lactose intolerance.</a> Journal of the American College of Nutrition. 19, 165S-175S (2000).</li><li>Robayo-Torres, C. C., Nichols, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+differentiation+of+congenital+lactase+deficiency+from+adult-type+hypolactasia.">Molecular differentiation of congenital lactase deficiency from adult-type hypolactasia.</a> Nutrition Reviews. 65, 95-98 (2007).</li><li>Swallow, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+lactase+persistence+and+lactose+intolerance.">Genetics of lactase persistence and lactose intolerance.</a> Annual Review of Genetics. 37, 197-219 (2003).</li><li>Enattah, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+introduction+of+two+lactase-persistence+alleles+into+human+populations+reflects+different+history+of+adaptation+to+milk+culture.">Independent introduction of two lactase-persistence alleles into human populations reflects different history of adaptation to milk culture.</a> American Journal of Human Genetics. 82, 57-72 (2008).</li><li>Lowe, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rapid+detection+of+lactose+fermentation+in+paracolon+organisms+by+the+demonstration+of+beta-D-galactosidase.">The rapid detection of lactose fermentation in paracolon organisms by the demonstration of beta-D-galactosidase.</a> Journal of Medical Laboratory Technology. 19, 21-25 (1962).</li><li>Russo, S. F., Moothart, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+study+of+the+Enzyme+Lactase.">Kinetic study of the Enzyme Lactase.</a> Journal of Chemical Education. 63, 242 (1986).</li></ol>

الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.

على معرفة مفصلة وفهم الإنزيمات، التفاعلات الانزيمية وحركية إنزيم مطلوب لمجموعة واسعة من المواضيع التي تغطي مجالات البيولوجيا والطب الحيوي والصيدلة. يستخدم البروتوكول المذكورة أعلاه اللاكتاز كمثال لأنزيم ذات الصلة بصحة الإنسان لما أبدته من التفاعلات الانزيمية، توفير المهارات الأساسية التي يمكن استخدامها في التجارب المستندة إلى مختبر أكثر تقدما.
قد صمم هذا البروتوكول عمدا أن تكون قوية كالطلاب تجربة مختبر مبللة قليلاً أو لا ممكن، مما يسمح لنتائج التفسير في فترة قصيرة من الزمن. في العام الدراسي 2014/2015 في كلية الصيدلة جامعة ريدينغ، نفذت مجموعة طلاب 144، نظمت مجموعات من 3، التجربة "قياس اللاكتاز"، مع كافة المجموعات قادرة على الكشف عن مستوى معين من النشاط الأنزيمي من الكمبيوتر اللوحي اللاكتاز مقتطفات.
وهناك عدد من الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول. أولاً، من الضروري أن الاستخراج الأولى كفاءة، والسماح سولوبيليزاتيون كافية إنزيم نشط للتحاليل اللاحقة. في تجربتنا، السنة الأولى الطلاب الجامعيين يمكن تحقيق ذلك باتباع البروتوكول كما هو مبين؛ لكن بعض التوجيهات من المتظاهرين مختبر كان المطلوب في هذه المرحلة. على الرغم من أن يبدو أن نقطة بديهية، عاملاً أساسيا في نجاح هذا البروتوكول هو القدرة على بدقة قياس وحدات التخزين، بشكل صحيح تسمية أنابيب واتبع الإرشادات. بينما يمكن افتراض مستوى معين من الكفاءة للعديد من الطلاب، والرصد الدقيق وطلب واضح للطلاب إلى طلب المساعدة في حالة ما إذا كانوا غير متأكدين من ما يجب فعله التالية توفر احتمال أكبر مقايسة ناجحة.
ويمكن إجراء تقييم الطالب في فئة ورقة العمل (متاحة كمواد تكميلية)، يسأل الطلاب ملاحظة البيانات من التجارب، التعليق على النتائج ووصلة إلى خلفية المعلومات/القراءة من المواد محاضرة، أو أكثر مفصلة، من تقييم الدرجة مع نموذج البيانات المقدمة والسماح للتحاليل الحركية وحاول وتقييمها.
البروتوكول المعروضة هنا مثال بسيط للمقايسة نشاط اللاكتاز تحت الظروف المختبرية التدريس، وهناك فرصة كبيرة لزيادة تعقيد التجربة للسماح بإجراء تحليلات أكثر تقدما. على وجه الخصوص، البروتوكول قدم مدخلاً إلى مفهوم حركية إنزيم، لكنه لا يسمح بتحليل البيانات التجريبية الحركية. على هذا النحو، أننا نوصي بعرض البروتوكول وصف كقالب أولية للطبقات، مع تفاصيل دقيقة تكييفها لتتناسب مع أهداف محددة ومواهب الطالب الفوج القيام بالتجارب. ويمكن أن تشمل الأمثلة من تجارب موسعة: تكرار القياسات في درجات حرارة مختلفة، باستخدام تركيزات مختلفة الركيزة للسماح للتحليل الإحصائي وتحليل الحركية للبيانات (مناسبة لطلاب الكيمياء الحيوية/الكبرى)، بدءاً من عدة أقراص مختلفة والسماح للطلاب لتقييم مختلف نشاط إنزيم في كل (بالإضافة إلى أقراص التحكم، مناسبة لطلاب العلم الشرعي/التخصصات) تقييم تأثير الحرارة تمسخ أو الاضطلاع بالمنافسة التجارب بالإضافة اللاكتوز أو مثبطات اللاكتاز (الجدول 1). بروتوكول مفصل لتحليل الحركية من اللاكتاز قد سبق نشر12.
قوة هامة لهذا البروتوكول أنه يجمع بين مقدمة أساسية لعلم الإنزيمات وإنزيم حركية مع دراسة حالة واقع الحياة لعلم الإنزيمات في الطب. وهذا ما يجعل هذا المختبر التجربة من أهمية خاصة بالنسبة لطلاب الطب والصيدلة، والعلوم الطبية الحيوية والمواضيع ذات الصلة. الأهم من ذلك، حقيقة أن هناك حالة طبية خطيرة وقضية غذائية أكثر انتشارا المرتبطة بتقويض اللاكتوز يوفر الفرصة لجمع طائفة واسعة من المسائل الطبية والأخلاقية مع الطلاب. هذا ويمكن أن تشمل المسائل المحيطة بالاختبارات الجينية للظروف الطبية، وترتبط المناقشات المتصلة بالعلاج الجيني والمشورة الوراثية، وكذلك استخدام وبيع المكملات الدوائية. قيد رئيسي واحد أن البروتوكول لا تسمح بتقدير دقيق لتركيز الإنزيم، بسبب انطلاق المواد المستخدمة للاستخراج. ومع ذلك، تعديل لمراعاة هذا، سيكون استخدام إنزيم الصف كاشف للفحص. الأهم من ذلك، سيسمح أيضا لحساب أدق لحركية لأنزيم اللاكتاز.
في الختام، المعايرة النشاط اللاكتاز في مختبر تدريس البيئة يوفر مقدمة قوية وجذابة ومثيرة للاهتمام في الميدان البيولوجيا إنزيم لمرحلة مبكرة طلاب الجامعة.

الإنزيمات هي نوع متخصصة من البروتينات التي تعمل كمحفزات بيولوجية للتفاعلات الكيميائية في معيشة الكائنات الحية1. عمل الإنزيمات أمر بالغ الأهمية للحياة، وتوفير الطاقة، والتخلص من النفايات والسماح للكائنات الحية العمل. عليه، فهم الإنزيمات ذات أهمية حاسمة لفهم كامل للحياة. هذه المعرفة أمر أساسي لمجموعة متنوعة من برامج درجة مستوى الجامعة، بدءاً من العلوم الطبية لعلم الأحياء. بينما يمكن أن توفر خلفية مفصلة بدءاً من مبادئ الحفز للنماذج النظرية لنشاط إنزيم للطلاب باستخدام المحاضرات ومواد للقراءة، خصائص الإنزيم ردود الفعل هي أفضل استوعب أيدي على الخبرة العملية من كما سبق أثبت الإنزيمات في الإجراء2. يوفر هذا البروتوكول بسيطة اتباع نموذج تجريبي لقياس نشاط الإنزيم تحت ظروف المختبر، استخدام اللاكتاز كمثال لأنزيم مع نشاط ذات صلة بالتغذية البشرية والصحة.
اللاكتاز glycosidic هيدرولاز (المفوضية الأوروبية 3.2.1.23/26) إنزيم الأهمية الغذائية للثدييات3. نشاط اللاكتاز هو المحافظة عليها درجة عالية من خلال تطور، ومستمد من عائلة الإنزيمات بيتا-جالاكتوسيداسي-عائلة الحالية من الإشريكيّة القولونية عن طريق الإنسان العاقل (الشكل 1، PDB 1JZ8)4. الأهمية الحاسمة اللاكتاز في وضع تغذية بشرية تنبع من دورها في السماح بانهيار اللاكتوز إلى مكونات أحادي التأسيسية، التي يمكن أن تستخدم بعد ذلك لتوليد الطاقة في الجسم. اللاكتاز يحفز التحلل المائي للسندات glycosidic في اللاكتوز ديساكهارايد، الإفراج عن اللبن والسكر (الشكل 2)5. ثم يتم استخدام هذه السكريات الأحادية أساسا لتوليد الادينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) عن طريق دورة حمض الستريك والفسفره6. خلال الوليد والرضع التنمية، أعرب اللاكتاز هو عاليا في الجهاز الهضمي البشري، تحطيم اللاكتوز الواردة من حليب الثدي من اللاكتوز الذي هو عنصر أساسي من الكربوهيدرات، وواحدا من المصادر الرئيسية للتغذية خلال السنوات الأولى 7-هو إبراز أهمية طبية اللاكتاز بعوز اللاكتاز الخلقي (CLD)، حالة نادرة في جسمية مقهورة الناجم عن الطفرات في جين اللاكتاز (LCT) الترميز ل إنزيم اللاكتاز8. معرض حديثي مع مركز نشاط اللاكتاز القليل جداً، وبالتالي لا يمكن أن يتم تغذيتها على لبن الأم، أي نوع آخر من الحليب، أو الصيغة التي تحتوي على اللاكتوز.
خلال مرحلة الطفولة، ينخفض عادة التعبير اللاكتاز؛ ومع ذلك، يختلف هذا الحد بعد الفطام جغرافيا، مع حوالي 35 في المائة من البالغين في جميع أنحاء العالم تواصل التعبير عن إنزيم9. التعبير المطرد من اللاكتاز، المعروف باستمرار اللاكتاز، يسمح للأفراد أن يواصل هضم الحليب ومنتجات الألبان من مجموعة من المصادر. على العكس من ذلك، يمكن أن يؤدي فقدان التعبير اللاكتاز إلى اللاكتوز، المعروف أيضا بالغ من نوع هيبولاكتاسيا (ATH)، الناتجة عن عدم قدرة على كسر اللاكتوز في الأمعاء. اته تتميز ببنية أعلى من اللاكتوز في القولون بعد تناول المنتجات الغذائية التي تحتوي على اللاكتوز. في القولون، هو المخمرة اللاكتوز المتراكمة بالقناة الهضمية الحيوانات الميكروبية، إطلاق الغازات، بما في ذلك الهيدروجين والميثان وثاني أكسيد الكربون. تشجيع إنتاج هذه الغازات في الأفراد المصابين بنقص إنزيم اللاكتاز الإنتفاخ البطن وزيادة انتفاخ البطن والألم، والغثيان و borborygmi (المعدة الهادر)7. زيادة مستويات اللاكتوز في الجهاز الهضمي يمكن أن يؤدي أيضا إلى البراز فضفاضة.
يتم التحكم في التعبير الجيني LCT عن طريق مجمع الأشكال المتعددة الموجودة في introns الجينات MCM6 القريبة التضمين. حمل الأفراد مع التعبير المطرد من اللاكتاز مجمع الأشكال المتعددة التي تعمل معززات القاصي قوية للتعبير الجيني LCT ، وبالتالي التعويض العادي إلى أسفل لائحة نسخ LCT أثناء الفطام، ونتيجة لذلك الحفاظ على التعبير اللاكتاز في مرحلة البلوغ3. قد اقترح محسن مجمع الأشكال المتعددة اختير إيجابيا بعد تدجين الماشية والجمال في الشرق الأوسط منذ ما يزيد على خمسة آلاف سنة9،10.
يمكن إدارة الأعراض الناتجة عن البعث بتقليل كمية اللاكتوز، على سبيل المثال عن طريق إزالة منتجات الألبان من النظام الغذائي. وثمة نهج بديل للبعث، والنهج المفضل لمركز التنمية المحلية، هو استخدام مكملات اللاكتاز، متاحة على نطاق واسع من الصيدليات. وتوفر هذه الملاحق اللاكتاز معزولة من مجموعة متنوعة من المصادر، بما في ذلك الخميرة والبكتيريا، في شكل سائل أو القائم على حبوب منع الحمل التي يمكن اتخاذها مع أو إضافتها إلى اللاكتوز التي تحتوي على الأغذية. وسوف يتحلل الملحق نسبة من اللاكتوز الموجودة في الطعام إلى منتجات السكر واللبن، ومن ثم تسمح امتصاص ومنع تراكم الركيزة اللاكتوز عسر الهضم في الأمعاء.
استناداً إلى استخدام مكملات اللاكتاز المعونة غذائية، قمنا بتطوير تجربة مختبر علم الإنزيمات بسيطة مناسبة لطلاب السنة الأولى الطب الحيوي والعلوم أو الصيدلة. هذه التجربة المعملية يستفيد من مكملات اللاكتاز المتاحة تجارياً، واستخدامات اورثو-نيتروفينول-بيتا-د-جالاكتوبيرانوسيدي (أونبج) توفير نقطة نهاية اللونية لقياس الانقسام وسندات glycosidic من اللاكتاز ( الشكل 3)11. أونبج الأعمال الركيزة اصطناعية اللاكتاز، التي عندما تتعرض للتحلل من هذا الإنزيم ينتج د-اللبن واورثو-نيتروفينول. المنتج الأخير بلون أصفر، امتصاص الضوء عند طول موجي 420 نانومتر. بالتحديد الكمي لأي تغييرات في امتصاص 420 نانومتر بعد تعرض أونبج إلى اللاكتاز، فمن الممكن لتقدير نشاط هذا الإنزيم. ويقدم هذه التجربة المعملية مظاهرة للنشاط الأنزيمي هيدرولاز. بناء في replicates إضافية والقيام بفحوصات في ظروف مختلفة، فمن الممكن لإدراج تحليلات أكثر تطورا من حركية إنزيم، توفير مثال قيمة الحياة الحقيقية للإنزيمات في العمل ذات الصلة بصحة الإنسان.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:796px;" width="797">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Lactase tablet</td>
			<td style="width:71px;">Lamberts</td>
			<td style="width:119px;">8511-60</td>
			<td style="width:392px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:215px;">Phosphate buffered saline (powdered)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3813</td>
			<td style="width:392px;">Dissolved in deionized water to a final concentration of 100 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">ONPG</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N1127</td>
			<td style="width:392px;">Dissolved in deionized water to a final concentration of 5 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sodium Carbonate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">451614</td>
			<td style="width:392px;">Dissolved in deionized water to a final concentration of 1 M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">De-ionized water</td>
			<td style="width:71px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:392px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Pestle and mortar</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:215px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:71px;">Jenway 6315</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Pipettes</td>
			<td style="width:71px;">Gilson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">15 mL tubes</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">1.5 mL tubes</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Spectrophotometer cuvettes</td>
			<td style="width:71px;">Jenway</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:215px;">Vortex</td>
			<td style="width:71px;">Vortex genie 2</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:71px;">Beckman</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Ice bucket</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:215px;">Water bath</td>
			<td style="width:71px;">Thermo-Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:215px;">Weighing scales</td>
			<td style="width:71px;">Thermo-Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring lactase enzymatic activity in the teaching lab

فهم كيفية عمل الإنزيمات، وتتصل هذه الأمثلة على الحياة الحقيقية، حاسمة بالنسبة لمجموعة واسعة من درجة البكالوريوس في العلوم البيولوجية والطبية الحيوية. هذا من السهل متابعة بروتوكول تم تطويره لطلاب الصيدلة الجامعية السنة الأولى ويوفر مقدمة المبتدئين لأنزيم ردود الفعل والإجراءات التحليلية لتحليل الإنزيم. الإنزيم للاختيار هو اللاكتاز، كما يمثل هذا مثال إنزيم المتاحة تجارياً ذات صلة بالممارسات البشرية المرض/الصيدلانية. اللاكتاز يستخرج من أقراص مكملة للوجبات الغذائية، وتقييم باستخدام مقايسة اللونية استناداً إلى التحلل من الركيزة الاصطناعية اللاكتاز (اورثو-نيتروفينول-د-بيتا-جالاكتوبيرانوسيدي، أونبج). إطلاق سراح اورثو-نيتروفينول عقب انشقاق هيدروليكي من ONPG اللاكتاز يقاس بإجراء تغيير في امتصاص في 420 نانومتر، وتأثير درجة الحرارة على رد فعل الانزيمية يتم تقييمه بالقيام برد فعل على الجليد، في درجة حرارة الغرفة وفي 37 درجة مئوية. التحليل الأكثر تقدما يمكن تنفيذها باستخدام هذا البروتوكول بتقييم نشاط إنزيم تحت ظروف مختلفة واستخدام كواشف مختلفة.

ويبين الشكل 4Aنتائج تمثيلية للقسم 2 من البروتوكول. مراقبة رد فعل، في غياب إنزيم اللاكتاز، لا يزال واضحا حين حل رد فعل، تتضمن مقتطفات من قرص اللاكتاز، يتحول إلى اللون الأصفر كما هو تحلل ONPG الإفراج اورثو-نيتروفينول. ويبين الشكل 4 باء الكمي باستخدام وحدات التعسفي من القسم 4 من البروتوكول، وتحليل العينات باستخدام جهاز المطياف الضوئي التالي. إنتاج اورثو-نيتروفينول أدنى عند رد فعل المحتضنة على الجليد، وأعلى عندما يتم الاضطلاع رد فعل على 37 درجة مئوية.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig1.jpg"> الشكل 1 : كولاي بيتا-جالاكتوسيداسي- (أ) هيكل الكريستال من بيتا-جالاكتوسيداسي من الإشريكيّة القولونية، يبين هيكل النشط تيتراميريك المعقدة. (ب) اللولكتس (يظهر باللون الأحمر) منضمة إلى موقع نشط لبيتا-جالاكتوسيداسي. الصور التي تم إنشاؤها من PDB 1JZ84. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig2.jpg"> الشكل 2 : العمل الأنزيمي من اللاكتاز- التحلل لاكتوز من اللاكتاز لإنتاج اللبن-د-بيتا وبيتا-د-الجلوكوز. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig3.jpg"> الشكل 3 : التحلل من اورثو-نيتروفينول- بيتا جالاكتوبيرانوسيدي-د. التحلل المائي أونبج اللاكتاز لإنتاج بيتا-د-اللبن واورثو-نيتروفينول (وصفراء اللون)، مما يتيح تقدير نشاط اللاكتاز بقياس امتصاص في 420 نانومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig4.jpg"> الشكل 4 : التحلل المائي أونبج. عرض مراقبة ورد فعل أنابيب (A) وبيانات تمثيلية من المادة 4 من البروتوكول سجلت نتائج التحلل ONPG الممثل، على أوراق العمل في الفئة، تظهر امتصاص الخام في وحدات التعسفي في 420 نانومتر، تصحيح للخلفية و في ثلاث درجات حرارة مختلفة (ب). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>حالة تجريبية</td>
			<td>المتغيرات التجريبية</td>
		</tr>
<tr>
<td>درجة الحرارة</td>
			<td>0 درجة مئوية، 10 درجة مئوية، 20 درجة مئوية، 30 درجة مئوية، 50 درجة مئوية</td>
		</tr>
<tr>
<td>تركيز الركيزة</td>
			<td>0 مم، 1 مم، 5 مم، 10 مم أونبج</td>
		</tr>
<tr>
<td>تثبيط المنافسة</td>
			<td>5 مم اللاكتوز ONPG زائد 0 ملم أو 1 ملم، 5 ملم أو 10 ملم</td>
		</tr>
<tr>
<td>الاعتماد على الوقت</td>
			<td>0 s، 15 ق، ق 30، 1 دقيقة، 5 دقائق، 10 دقيقة، 20 دقيقة</td>
		</tr>
<tr>
<td>تمسخ الحرارة</td>
			<td>استخراج اللاكتاز تسخينها إلى 100 درجة مئوية للاعتداء قبل 10 دقيقة</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: احتمال تمديد حالة تجريبية. واقترح تجارب موسعة، الاضطلاع بها في ثلاث نسخ، التحقيق في جوانب محددة من اللاكتاز علم الأحياء.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab at JoVE.com

Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

النشاط الأنزيمي من اللاكتاز الضروري لتجهيز تقويضي اللاكتوز ديساكهارايد. هنا، هو جزيئي نشاط اللاكتاز الموجودة في المكملات الغذائية مقايسة اللونية باستخدام. وهذا يوفر للطلاب مع منصة تجريبية لفهم نشاط اللاكتاز وإنزيم حركية.

قياس النشاط الأنزيمي اللاكتاز في مختبر التدريس

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...

Education

Research

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Biology

Analytical Chemistry

Anatomy and Physiology

Unit 1

Biochemistry of the Cell

Fundamentals of Chemistry

Energy and Catalysis

Chemical Applications of Statistical Analyses

SCIENTISTS IN ACTION

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

زرع عدسة في اسماك الزرد وتطبيقاتها في تحليل المسوخ العين

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

على الفحص لقياس نشاط القولونية محرض يسين Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

قياس انواع معينة ايليجانس الحياة سبان في 96 لوحات Microtiter حسنا

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

قياس معامل نفاذية المياه الأسموزي (P<sub&gt; و</sub&gt;) من خلايا كروية: Protoplasts محطة معزولة كمثال

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

والتجريبية وبروتوكول المعلوماتية الحيوية لتحليل-RNA وما يليها من دور التعرض للضوء الكمون في النمر الآسيوي البعوض،<em&gt; بحمى الضنك</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

قياس الاستجابة التغذية الناجم عن الجلوتاثيون في حيدرة

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

قياس اليرقات آخر في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مراقبة النشاط

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

طريقة لقياس آخر من Deubiquitinating الانزيمات في خطوط الخلايا وعينات الأنسجة

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

Measuring Pressure Volume Loops in the Mouse

قياس حجم حلقات الضغط في الماوس

Understanding the causes and progression of heart disease presents a significant challenge to the biomedical community. The genetic flexibility of the ...

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

قياس<em&gt; في المختبر</em&gt; أتباز آخر لالأنزيمية توصيف

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate ...