Name: measuring lactase enzymatic activity in the teaching lab
Uploaded: 2018-08-06T12:30:00
Duration: 4 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab at JoVE.com

חבר מומן על ידי בריטניה מחקר לאגודה פרקינסון (גרנט F1002). עבודה זו נתמכה על ידי MRC החדש החוקר במענק מחקר (מר/L010933/1), על-ידי תוכנית MRC להעניק מר/N026004/1 ל- PAL, ועל ידי BBSRC studentship BB/M017222/1 למטוס. אנו מודים על עוקבה 2014-15 של MPharm חלק 1 סטודנטים מאוניברסיטת רדינג עבור השתתפות איטרציה הראשון של גדודים הזה מעשי, ובעקבות משוב, קלט.

הערה: להלן הפרוטוקול פותחה שיתקיים במשך שעתיים (כולל השלמת גליונות עבודה ב- class) במעבדה הוראה בנוי למטרה. המדרגות ניסיוני היו בכוונה לשים יחד כדי לא לכלול ניתוח מפורט יותר של קינטיקה אנזימטית (המבוצע במסגרת קורס זה באמצעות מודל נתונים); עם זאת – כאמור בדיון – הפרוטוקול מספק תבנית עבור ניתוחים מתקדמים יותר בהתאם רמת הפרי זמן ומתקנים, סטודנט.
בטיחות: מעשית זו צריכה להתבצע על פי הכללים של טוב כימי מעבדת האימון (GCLP) — ציוד מגן אישי, כולל מעבדה מהודק מעיל, כפפות חד פעמיות, בטיחות משקפיים צריכים ללבוש כל הזמן במעבדה .
1. חילוץ האנזים
<ol><li>למחוץ לקטאז טבליה אחת, המכילה 200 מ ג של אנזים, אבקת אפילו באמצעות ומכתש.</li>
	<li>מקם את האבקה המתקבלת לתוך צינור 15 מ"ל מתויג"ההשעיה", resuspend ב- 10 מ ל תמיסת פוספט buffered (PBS) של 100 מ מ.</li>
	<li>מערבולת עבור 1 דקות למקסם את שאיבת אנזימים.</li>
	<li>להעביר 1 מ"ל מ ההשעיה לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 mL צנטריפוגה עבור 1 דקות ב x 10,000 ג'י לחלקיקים מוצקים משקעים.</li>
	<li>העברת µL 500 של תגובת שיקוע צינור נקי mL 1.5 מתויג "לקטאז להוצאת".</li>
</ol>2. התבוננות התגובה ערכי צבע מוחלטים
<ol><li>µL במקום 390 מ"מ PBS לתוך צינור 1.5 mL מתויג"תגובה A".</li>
	<li>להוסיף 100 µL של 5 מ מ ONPG פתרון, לערבב היטב על ידי vortexing. התראה: מעשית זו משתמשת אורתופדיה-Nitrophenol -beta-D-galactopyranoside (ONPG) כתחליף לקטוז. מאחר ONPG הוא מתחם בעל תאים פנוליים, זה צריך להיות מטופל בזהירות. במקרה של מגע עם העור עם ONPG העור חשוף צריך לרחוץ באופן מיידי. נשפך כל שצריך למחות מיד עם מגבות נייר כדי להיות מסולק לתוך זרם פסולת המתאים.</li>
	<li>להוסיף 10 µL של תמצית לתוך צינור התגובה A ו לערבב היטב על ידי vortexing.</li>
	<li>לצפות את תערובת התגובה למשך 5 דקות, הערה כל שינוי ערכי צבע מוחלטים לפתרון.</li>
</ol>3. מדידת פעילות אנזים
<ol><li>להגדיר את שני צינורות 1.5 mL: אחד מתויג "התגובה B", אחד שכותרתה "שליטה".</li>
	<li>להוסיף µL 390 מ"מ PBS התגובה B שפופרת, µL 400 מ"מ PBS אל הצינור שליטה ולאחר מכן להוסיף 100 µL של 5 מ מ ONPG כל שפופרת.</li>
	<li>מערבבים את התוכן על-ידי vortexing.</li>
	<li>להוסיף 10 µL של תמצית לקטאז הצינור התגובה B, לערבב על ידי vortexing ולאפשר את התגובה להמשיך עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>ברגע 1 דקות חלף, להוסיף 500 µL של 1 מ' סודיום קרבונט שני צינורות כדי לעכב את האנזים לקטאז על ידי הגדלת ה-pH, ובכך מסיימת את התגובה.</li>
	<li>העבר 500 µL כל שפופרת לתוך וואקום ספקטרופוטומטרים נקי ולמדוד את ספיגת-420 nm באמצעות ספקטרופוטומטרים את.</li>
	<li>הערה ספיגת עבור התגובה B ודגימות הבקרה ולאחר מכן לחסר את ערך הפקד מהערך תגובת להפיק בשינוי ספיגת עקב הידרוליזה של ONPG בנוכחות האנזים פעיל.</li>
</ol>4. השפעת הטמפרטורה על פעילות האנזים
<ol><li>להגדיר פקד שלושה צינורות וצינורות התגובה שלושה כמתואר בסעיף 3, תווית אלה "4 ° C", "חדר Temp" ו- "37 ° C".</li>
	<li>בעקבות תוספת של אנזים לחלץ, דגירה שפופרת אחת על קרח, אחד בטמפרטורת החדר, ואחד ב 37 מעלות צלזיוס (באמבט מים מחומם מראש).</li>
	<li>לאפשר את תגובות המשך עבור 1 דקות, ואז לסיים את התגובה על-ידי הוספת µL 500 של 1 מ' סודיום קרבונט כל שפופרת.</li>
	<li>למדוד את ספיגת-420 nm לכל שפופרת כמתואר בסעיף 3. להקליט את הערכים, לחסר את ערך הפקד מהערך התגובה בכל מקרה ומקרה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Berg, J. M., Tymoczko, J. L., Gatto, J. G., Stryer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biochemistry. , (2015).</li><li>Jittam, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+seaweed+enzyme-catalyzed+bromination+of+bromophenol+red:+An+inquiry-based+kinetics+laboratory+experiment+for+undergraduates.">Red seaweed enzyme-catalyzed bromination of bromophenol red: An inquiry-based kinetics laboratory experiment for undergraduates.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 37, 99-105 (2009).</li><li>Troelsen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult-type+hypolactasia+and+regulation+of+lactase+expression.">Adult-type hypolactasia and regulation of lactase expression.</a> Biochimica et biophysica acta. 1723, 19-32 (2005).</li><li>Juers, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+view+of+the+action+of+Escherichia+coli+(lacZ)+beta-galactosidase.">A structural view of the action of Escherichia coli (lacZ) beta-galactosidase.</a> Biochemistry. 40, 14781-14794 (2001).</li><li>Plimmer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+presence+of+lactase+in+the+intestines+of+animals+and+on+the+adaptation+of+the+intestine+to+lactose.">On the presence of lactase in the intestines of animals and on the adaptation of the intestine to lactose.</a> Journal of Physiology. 35, 20-31 (1906).</li><li>Krebs, H. A., Salvin, E., Johnson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+of+citric+and+alpha-ketoglutaric+acids+in+the+mammalian+body.">The formation of citric and alpha-ketoglutaric acids in the mammalian body.</a> The Biochemical journal. 32, 113-117 (1938).</li><li>Vesa, T. H., Marteau, P., Korpela, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactose+intolerance.">Lactose intolerance.</a> Journal of the American College of Nutrition. 19, 165S-175S (2000).</li><li>Robayo-Torres, C. C., Nichols, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+differentiation+of+congenital+lactase+deficiency+from+adult-type+hypolactasia.">Molecular differentiation of congenital lactase deficiency from adult-type hypolactasia.</a> Nutrition Reviews. 65, 95-98 (2007).</li><li>Swallow, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+lactase+persistence+and+lactose+intolerance.">Genetics of lactase persistence and lactose intolerance.</a> Annual Review of Genetics. 37, 197-219 (2003).</li><li>Enattah, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+introduction+of+two+lactase-persistence+alleles+into+human+populations+reflects+different+history+of+adaptation+to+milk+culture.">Independent introduction of two lactase-persistence alleles into human populations reflects different history of adaptation to milk culture.</a> American Journal of Human Genetics. 82, 57-72 (2008).</li><li>Lowe, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rapid+detection+of+lactose+fermentation+in+paracolon+organisms+by+the+demonstration+of+beta-D-galactosidase.">The rapid detection of lactose fermentation in paracolon organisms by the demonstration of beta-D-galactosidase.</a> Journal of Medical Laboratory Technology. 19, 21-25 (1962).</li><li>Russo, S. F., Moothart, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+study+of+the+Enzyme+Lactase.">Kinetic study of the Enzyme Lactase.</a> Journal of Chemical Education. 63, 242 (1986).</li></ol>

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

נתונים היסטוריים הידע וההבנה של אנזימים, תגובות אנזימטיות, קינטיקה אנזימטית נדרש עבור מגוון רחב של נושאים המתפרסות על-פני הביולוגיה, וההתערבות ו פרמקולוגיה. הפרוטוקול המתואר לעיל משתמש לקטאז כדוגמה של אנזים הרלוונטיים לבריאות האדם על הפגנת אנזימטיות, מתן מפתח מיומנויות שיכול לשמש בניסויים מבוסס מעבדה מתקדמים יותר.
פרוטוקול זה תוכנן בכוונה להיות הכי חזקים כמו אפשרי, דבר המאפשר לתלמידים עם מעט או ללא ניסיון מעבדה רטוב לתוצאות interpretable בזמן קצר של זמן. בשנת 2014/2015 הלימודים בביה ס מאוניברסיטת רדינג של בית מרקחת, סך של 144 סטודנטים, מאורגנת בקבוצות של 3, ביצעו את הניסוי "מדידת לקטאז", עם מסוגלים לזהות רמה מסוימת של פעילות אנזימטי של לקטאז tablet כל הקבוצות תמציות.
ישנם מספר צעדים קריטיים של פרוטוקול זה. קודם כל, זה חיוני כי החילוץ הראשוני הוא יעיל, ומאפשר solubilization של האנזים פעיל מספיק עבור ניתוחים שלאחר מכן. מניסיוננו, בשנה הראשונה סטודנטים ניתן להשיג זאת על-ידי ביצוע הפרוטוקול כמתואר; עם זאת הדרכה של מפגינים מעבדה נדרשה בשלב זה. למרות נראה נקודה מובנת מאליה, אחד מגורמי ההצלחה של פרוטוקול זה הוא היכולת למדוד באמצעי אחסון, כראוי בתווית צינורות ובזהירות ההוראות. בעוד רמה מסוימת של מיומנות ניתן להניח עבור סטודנטים רבים, פיקוח קפדני, בקשה ברורה לתלמידים לבקש סיוע בכל מקרה שבו הם בטוחים מה לעשות הבא מספק את הסבירות הגדולה ביותר של assay מוצלחת.
הערכת התלמיד יכול להתבצע על ידי ב- class בגליון העבודה (זמין כחומר משלים), מבקשים התלמידים לציין נתוני הניסויים, תגובה על התוצאות שלהם קישור לקריאת/רקע מידע מחומר ההרצאות, או יותר מפורט, מתוך הערכה בכיתה עם מודל נתונים שסופקו המאפשר ניתוח קינטי להיות ניסיון ולא מוערכים.
פרוטוקול שהוצגו במסמך זה הוא דוגמה פשוטה assay פעילות לקטאז תחת תנאי מעבדה מלמד, קואנקה כדי להגדיל את המורכבות של הניסוי כדי לאפשר ניתוח מתקדם יותר. בפרט, פרוטוקול שהוצגו מספקת מבוא לרעיון של קינטיקה אנזימטית אך אינו מאפשר ניתוח קינטי של נתוני הניסוי. ככזה, אנו ממליצים לצפייה הפרוטוקול המתואר כמו תבנית הראשוני עבור מחלקות, עם הפרטים המדויקים הותאם שיתאים את מטרות ספציפיות ואת כישוריו של קבוצה סטודנט התחייבות הניסויים. דוגמאות לניסויים המורחבת יכול לכלול: לחזור על המדידות בטמפרטורות שונות, באמצעות ריכוז סובסטרט שונים כדי לאפשר ניתוח סטטיסטי, קינטי ניתוח של נתונים (מתאים עבור סטודנטים ביוכימיה/מקצועות ראשיים), החל מספר לוחות שונים, המאפשר את התלמידים להעריך את פעילות שונים של האנזים בכל אחד (עם התוספת של שליטה טבליות, מתאים למדע פורנזי סטודנטים/מקצועות ראשיים), הערכת ההשפעה של חום דנטורציה או נושאת את המתחרים ניסויים על-ידי תוספת של לקטוז או מעכבים של לקטאז (טבלה 1). פרוטוקול מפורט לניתוח קינטי של לקטאז בעבר כבר פורסם12.
כוח חשוב של פרוטוקול זה הוא כי הוא משלב הקדמה בסיסי קינטיקה אנזימולוגיה, האנזים עם חקר מקרה אמיתי של אנזימולוגיה ברפואה. זה הופך את המעבדה. ניסוי הרלוונטיות לסטודנטים לרפואה, בית מרקחת, ביו ונושאים קשורים נוספים. חשוב מכך, העובדה כי יש בעיה רפואית רצינית וגם בעיית תזונה נפוצה יותר המשויכים לקטוז קטבוליזם מספק הזדמנות להעלות מגוון רחב של בעיות רפואיות ואתיות עם התלמידים. זה יכול לכלול את הנושאים בדיקה גנטית לטיפול בבעיות רפואיות, הקשורים דיונים הנוגעים ריפוי גנטי ייעוץ גנטי, כמו גם שימוש ואת מכירת צמחי מרפא תוספי מזון. מגבלה אחת גדולה היא כי הפרוטוקול אינו מאפשר הערכה מדויקת של ריכוז אנזים, עקב החומר ההתחלתי המשמש להפקת. שינוי להביא בחשבון זה, עם זאת, יהיה לשימוש ריאגנט כיתה אנזים וזמינותו. חשוב, זה יאפשר גם לחישוב מדויק יותר של קינטיקה של האנזים לקטאז.
לסיכום, assaying את הפעילות של לקטאז במעבדת ההוראה מספק סביבה חזקים, מרתק ומעניין הקדמה השדה של ביולוגיה אנזים בשלב מוקדם סטודנטים.

אנזימים הם סוג מיוחד של חלבון זה לשמש זרזים ביולוגיים עבור תגובות כימיות חי אורגניזמים1. הפעולה של אנזימים חיונית לחיים, לאספקת אנרגיה, סילוק פסולת, ומאפשר אורגניזמים לתפקד. ההבנה אנזימים, לפיכך, הוא קריטי עבור הבנה מלאה של החיים. ידע כזה חיוני עבור מגוון רחב של תוכניות ברמת תואר באוניברסיטה, החל מדעי הרפואה לביולוגיה. בעוד רקע מפורט ועד עקרונות זרז מודלים תיאורטיים של פעילות אנזים יכולה להינתן לתלמידים באמצעות הרצאות, חומר קריאה, המאפיינים של אנזים תגובות הכי מובנת על ידי ידיים על ניסיון מעשי של אנזימים בפעולה כאמור הפגינו2. פרוטוקול זה מספק פשוט לעקוב פרדיגמה נסיונית למדידת פעילות אנזים בתנאי מעבדה, לקטאז כדוגמא של אנזים עם פעילות הנוגעים לתזונה אנושית ובריאות.
ההידרולז glycosidic לקטאז (EC 3.2.1.23/26) הוא אנזים חשיבות התזונה מרכזית עבור יונקים3. הפעילות של לקטאז מאוד כולו דרך האבולוציה, ונגזרת ממשפחת בטא-galactosidase של אנזימים – משפחה מתנת Escherichia coli דרך הומו ספיינס (איור 1, PDB 1JZ8)4. חשיבות קריטית לקטאז באווירה התזונה האנושית נובעת תפקידה המאפשר פירוק של לקטוז למרכיביו בוחרים חד-סוכר, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש ליצירת אנרגיה בגוף. לקטאז ה מזרז הידרוליזה של קשר גליקוזידי ב דו-סוכר חלב (לקטוז), שחרור גלקטוז וגלוקוז (איור 2)5. Monosaccharides אלה משמשים אז בעיקר לדור של אדנוזין טריפוספט (ATP) דרך מעגל קרבס, זרחון חמצוני6. במהלך neonate והתפתחות תינוקות, לקטאז מתבטאת במיוחד מערכת העיכול האנושית, פירוק לקטוז קיבל חלב של לקטוז אילו הוא הרכיב העיקרי פחמימות, ואחד מקורות מרכזיים של תזונה במהלך השנים הראשונות 7. החשיבות הרפואית של לקטאז מודגשת על ידי מולדת לקטאז (המחלקה לחקירות), מצב נדיר הקרים autosomal נגרמת על ידי מוטציות בגן לקטאז (LCT) קידוד האנזים לקטאז8. תינוק בן יומו תינוקות עם המחלקה לחקירות להפגין מעט מאוד פעילות לקטאז, ובכך הם אינו ניתן להזנה על חלב אם, בכל סוג אחר של חלב, או נוסחה המכילה לקטוז.
במהלך הילדות, ביטוי לקטאז מוקטן בדרך כלל; עם זאת, הפחתה זו בעקבות הגמילה משתנה מבחינה גיאוגרפית, כ- 35% של מבוגרים ברחבי העולם ממשיכים להביע את האנזים9. ביטוי מתמשכת של לקטאז, המכונה התמדת לקטאז, מאפשר ליחידים להמשיך לעכל חלב ומוצרי חלב ממגוון מקורות. לעומת זאת, האובדן של לקטאז הביטוי יכול להוביל אי סבילות ללקטוז, המכונה גם למבוגרים hypolactasia (ATH), הנובע חוסר היכולת לפרק לקטוז בבטן. ATH מאופיין על ידי תהליך בנייה למעלה של לקטוז במעי הגס מבליעת לקטוז המכילה מוצרי מזון. במעי הגס, מותסס של לקטוז שנצבר על ידי החי והצומח מיקרוביאלית מעיים, שחרור גזים כולל מימן, מתאן, הפחמן הדו-חמצני. הייצור של גזים אלה אצל אנשים עם ליקויים האנזים לקטאז לקדם נפיחות בבטן, גזים מוגברת, כאב, בחילות, ו- borborygmi (הבטן מקרקרת)7. רמות גבוהות של לקטוז במערכת העיכול יכול גם להוביל שרפרפים רופף.
השליטה של ביטוי גנים LCT הוא מווסת על ידי פולימורפיזמים ממוקם ב אינטרונים של הגן MCM6 הסמוך. אנשים עם ביטוי מתמשכת של לקטאז לשאת פולימורפיזמים המתפקדים חזקה דיסטלי מרחיבי LCT ביטוי גנים, ובכך קיזוז הרגיל למטה רגולציה של שעתוק LCT במהלך הגמילה, וכתוצאה מכך ביטוי לקטאז מתפעל לבגרות3. משפר פולימורפיזמים שהוצעו חיובי שבחרו בעקבות הביות של בקר וגמלים במזרח התיכון לפני חמשת אלפים שנה9,10.
ניתן לנהל את הסימפטומים הנובעים ATH על-ידי הפחתת צריכת חלב (לקטוז), לדוגמה על-ידי הסרת מוצרי חלב בתזונה. גישה חלופית עבור ATH, הגישה של בחירה עבור המחלקה לחקירות, הוא השימוש של תוספי לקטאז, זמין נרחב מבתי מרקחת. תוספות אלה מספקים לקטאז מבודד ממגוון רחב של מקורות, כולל שמרים וחיידקים, בצורה נוזלית או מבוסס-הגלולה שניתן לקחת עם או להוסיף מזון המכיל לקטוז. תוספת hydrolyze שיעור של לקטוז נוכח המזון למוצרים גלוקוז, גלקטוז, ובכך יאפשר לקליטתם ומניעת הצטברות של לקטוז מעוכל המצע בבטן.
בהתבסס על השימוש של תוספי לקטאז כסיוע תזונתיים, פיתחנו ניסוי מעבדה אנזימולוגיה פשוט מתאים לתלמידי השנה הראשונה ביו המדע או בית מרקחת. בניסוי מעבדה מנצל תוספי לקטאז זמינים מסחרית, והשימושים אורתופדיה-nitrophenol -beta-D-galactopyranoside (ONPG) כדי לספק נקודת סיום ערכי צבע מוחלטים למדידת המחשוף של איגרות חוב glycosidic על ידי לקטאז ( איור 3)11. ONPG פועל על סובסטרט מלאכותי עבור? לקטאז, אשר כאשר נתון הידרוליזה על ידי אנזים זה מייצר D-גלקטוז אורתופדיה-nitrophenol. המוצר האחרון בעל צבע צהוב, קליטת אור באורך-גל של 420 ננומטר. מאת לכימות שינויים כלשהם ספיגת-420 nm הבאים חשיפת ONPG לקטאז, זה אפשרי להעריך את הפעילות של אנזים זה. בניסוי מעבדה מספק הפגנה של פעילות ההידרולז אנזימטיות. על ידי בבניין משכפל נוסף, בביצוע מבחני בתנאים שונים, זה ניתן לשלב ניתוח מתוחכמות יותר של קינטיקה אנזימטית, מתן דוגמה ממשית ערך של אנזימים בפעולה הרלוונטיים לבריאות האדם.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:796px;" width="797">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Lactase tablet</td>
			<td style="width:71px;">Lamberts</td>
			<td style="width:119px;">8511-60</td>
			<td style="width:392px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:215px;">Phosphate buffered saline (powdered)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3813</td>
			<td style="width:392px;">Dissolved in deionized water to a final concentration of 100 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">ONPG</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N1127</td>
			<td style="width:392px;">Dissolved in deionized water to a final concentration of 5 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sodium Carbonate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">451614</td>
			<td style="width:392px;">Dissolved in deionized water to a final concentration of 1 M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">De-ionized water</td>
			<td style="width:71px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:392px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Pestle and mortar</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:215px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:71px;">Jenway 6315</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Pipettes</td>
			<td style="width:71px;">Gilson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">15 mL tubes</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">1.5 mL tubes</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Spectrophotometer cuvettes</td>
			<td style="width:71px;">Jenway</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:215px;">Vortex</td>
			<td style="width:71px;">Vortex genie 2</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:71px;">Beckman</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Ice bucket</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:215px;">Water bath</td>
			<td style="width:71px;">Thermo-Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:215px;">Weighing scales</td>
			<td style="width:71px;">Thermo-Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring lactase enzymatic activity in the teaching lab

להבין איך עובדים אנזימים, הנוגעים זה דוגמאות בחיים האמיתיים, הינה קריטית מגוון רחב של דרגות לתואר ראשון במדעי ביולוגי וביו. זה קל לעקוב אחר הפרוטוקול פותחה עבור סטודנטים לתואר ראשון בית מרקחת בשנה הראשונה ומספק מבוא ברמה התחלתית אנזים תגובות ונהלים אנליטי עבור ניתוח האנזים. האנזים של הבחירה היא? לקטאז, כמו זה מייצג דוגמה של אנזים זמינים מסחרית הרלוונטיים לאימון המחלה האנושית/פרמצבטיקה. לקטאז מופק תוסף תזונה טבליות, העריך שימוש assay ערכי צבע מוחלטים בהתבסס על הידרוליזה של סובסטרט מלאכותי של לקטאז (אורתופדיה-nitrophenol -beta-D-galactopyranoside, ONPG). שחרורו של אורתופדיה-nitrophenol בעקבות את המחשוף hydrolytic של ONPG על ידי לקטאז נמדד על ידי שינוי ספיגת-420 ננומטר, ואת השפעת הטמפרטורה על התגובה אנזימטי מוערך על-ידי ביצוע התגובה על קרח, בטמפרטורת החדר ו- 37 מעלות צלזיוס. ניתוח מתקדם יותר ניתן ליישום בעזרת פרוטוקול זה על ידי הערכת הפעילות אנזים בתנאים שונים באמצעות נוגדנים שונים.

נציג תוצאות בסעיף 2 של הפרוטוקול מוצגים באיור 4A. התגובה שליטה, בהיעדרו של האנזים לקטאז, נשארת ברורה בזמן הפתרון התגובה, המכיל תמצית מן הלוח? לקטאז, הופך צהוב כמו ONPG hydrolyzed שחרור אורתופדיה- nitrophenol. איור 4B מראה כימות באמצעות יחידות שרירותי של סעיף 4 של הפרוטוקול, הניתוח הבא דוגמאות שימוש ספקטרופוטומטרים. הייצור של אורתופדיה-nitrophenol הוא כאשר התגובה מודגרת על קרח, הגבוהים והנמוכים ביותר כאשר התגובה מתבצע ב- 37 מעלות צלזיוס.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig1.jpg"> איור 1 : E. coli בטא-galactosidase. (א) מבנה גבישי של בטא-galactosidase מ- Escherichia coli, מציג את המבנה tetrameric של הפעילים מורכבים. Allolactose (B) (מוצג באדום) מאוגדים האתר הפעיל של בטא-galactosidase. תמונות שנוצרו PDB 1JZ84. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig2.jpg"> איור 2 : פעולה אנזימטי של לקטאז. הידרוליזה של לקטוז על ידי לקטאז לייצר beta-D-גלקטוז, beta-D-גלוקוז. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig3.jpg"> איור 3 : הידרוליזה מאורתופדיה-nitrophenol - בטא -D-galactopyranoside. ONPG הידרוליזה על ידי לקטאז לייצר beta-D-גלקטוז, אורתופדיה-nitrophenol (שהוא בצבע צהוב), המאפשר להערכת הפעילות לקטאז על ידי מדידה של ספיגת-420 ננומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig4.jpg"> איור 4 : הידרוליזה ONPG. התוצאות נציג של הידרוליזה ONPG, מציג צינורות שליטה ותגובה (A), נציג נתונים בסעיף 4 של הפרוטוקול שנרשם בגליונות ב- class, מציג raw ספיגת ביחידות שרירותי-420 nm, מתוקנות על רקע ו בטמפרטורות שלוש שונות (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>תנאי ניסיוני</td>
			<td>משתני הניסוי</td>
		</tr>
<tr>
<td>טמפרטורה</td>
			<td>0 ° צלזיוס, 10 ° C, 20 ° C, 30 מעלות צלזיוס, 50 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>ריכוז המצע</td>
			<td>מ מ 0, 1 מ"מ, 5 מ"מ, 10 מ מ ONPG</td>
		</tr>
<tr>
<td>עיכוב תחרותי</td>
			<td>לקטוז ONPG פלוס מ מ 0, 1 מ"מ, 5 מ"מ או 10 מ מ 5 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>התלות בזמן</td>
			<td>0 s, 15 s, 30 s, 1 דקות, 5 דקות, 10 דקות, 20 דקות</td>
		</tr>
<tr>
<td>דנטורציה בחום</td>
			<td>תמצית לקטאז מחומם ל 100 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות לפני כדי assay</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: פוטנציאל מורחב התנאי ניסיוני. הציע ניסויים מורחבת, יבוצע שהפקידים, חוקרת היבטים ספציפיים של לקטאז הביולוגיה.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab at JoVE.com

Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

הפעילות האנזימטית מתרחשת של לקטאז חיוני קטבולי עיבוד דו-סוכר חלב (לקטוז). כאן, הפעילות של לקטאז נמצאו ב תוספי מזון הוא לבדיקה באמצעות וזמינותו של ערכי צבע מוחלטים. הדבר מספק לתלמידים פלטפורמה ניסיוני להבנת הפעילות של קינטיקה לקטאז, אנזים.

מדידת פעילות אנזימטי לקטאז במעבדת ההוראה

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...

Education

Research

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Biology

Analytical Chemistry

Anatomy and Physiology

Unit 1

Biochemistry of the Cell

Fundamentals of Chemistry

Energy and Catalysis

Chemical Applications of Statistical Analyses

SCIENTISTS IN ACTION

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

השתלת עדשה של דג הזברה Application שלה ניתוח של מוטאנטים העין

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Assay למדידת פעילות Escherichia coli ועין מתנהלת ליזין Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

מדידת Caenorhabditis elegans חיים טווח של 96 צלחות microtiter טוב

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

מדידת אוסמוטי המים החדירות מקדם (P<sub&gt; F</sub&gt;) של תאים כדוריים: Protoplasts צמח מבודד כדוגמה

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

ניסיוני וביואינפורמטיקה פרוטוקול לניתוח RNA-seq של Photoperiodic דיאפאוזה באסיה טייגר נגד יתושים,<em&gt; אדס המפוספס</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

מדידת תגובת האכלה מושרה גלוטתיון בהידרה

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

מדידה של הזחל פעילות ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; צג פעילות

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

שיטה למדידת הפעילות של אנזימי Deubiquitinating בשורות תאים ודגימות רקמה

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

Measuring Pressure Volume Loops in the Mouse

מדידת לולאות נפח לחץ העכבר

Understanding the causes and progression of heart disease presents a significant challenge to the biomedical community. The genetic flexibility of the ...

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

מדידה<em&gt; במבחנה</em&gt; פעילות ATPase עבור אנזימתי אפיון

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate ...