Name: layered alginate constructs: a platform for co-culture of heterogeneous cell populations
Uploaded: 2016-08-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations at JoVE.com

This work was funded by the National Science Foundation (CBET 0845754, AHH).

1. הכנה להרכבת דיסקים אלגינט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 4% (w / v) פתרון אלגינט ב בופר פוספט של 1x Dulbecco ללא סידן כלורי הוסיף או מגנזיום כלוריד ומקום באמבט המים 37 מעלות צלזיוס. ריכוזים של פתרון אלגינט יכולים להשתנות, אבל 1 - 4% (w / v) פתרונות אלגינט מומל...

<ol>
	<li>Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Basic+Science+of+Articular+Cartilage.">The Basic Science of Articular Cartilage.</a> Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).</li><li>Neidlinger-Wilke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+loading+of+the+intervertebral+disc:+from+the+macroscopic+to+the+cellular+level.">Mechanical loading of the intervertebral disc: from the macroscopic to the cellular level.</a> Eur. Spine J. 23 (3), 333-343 (2013).</li><li>Klein, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+of+stratified+articular+cartilage+from+chondrocyte+subpopulations.">Tissue engineering of stratified articular cartilage from chondrocyte subpopulations.</a> Osteoarth. Cartilage. 11 (8), 595-602 (2003).</li><li>Han, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-free+Grafts+for+Articular+Cartilage+Defects.">Scaffold-free Grafts for Articular Cartilage Defects.</a> Clin. Orthop. Relat. R. 466 (8), 1912-1920 (2008).</li><li>Ng, K. W., Ateshian, G. A., Hung, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zonal+chondrocytes+seeded+in+a+layered+agarose+hydrogel+create+engineered+cartilage+with+depth-dependent+cellular+and+mechanical+inhomogeneity.">Zonal chondrocytes seeded in a layered agarose hydrogel create engineered cartilage with depth-dependent cellular and mechanical inhomogeneity.</a> Tissue Eng. A. 15 (9), 2315-2324 (2009).</li><li>Ng, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+layered+agarose+approach+to+fabricate+depth-dependent+inhomogeneity+in+chondrocyte-seeded+constructs.">A layered agarose approach to fabricate depth-dependent inhomogeneity in chondrocyte-seeded constructs.</a> J. Orthop. Res. 23 (1), 134-141 (2005).</li><li>Nguyen, L. H., Kudva, A. K., Saxena, N. S., Roy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+articular+cartilage+with+spatially-varying+matrix+composition+and+mechanical+properties+from+a+single+stem+cell+population+using+a+multi-layered+hydrogel.">Engineering articular cartilage with spatially-varying matrix composition and mechanical properties from a single stem cell population using a multi-layered hydrogel.</a> Biomaterials. 32 (29), 6946-6952 (2011).</li><li>Leone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+multilayered+composite+hydrogel+as+osteochondral+substitute.">Continuous multilayered composite hydrogel as osteochondral substitute.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 103 (8), 2521-2530 (2015).</li><li>Lai, J. H., Kajiyama, G., Smith, R. L., Maloney, W., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+catalyze+cartilage+formation+by+neonatal+articular+chondrocytes+in+3D+biomimetic+hydrogels.">Stem cells catalyze cartilage formation by neonatal articular chondrocytes in 3D biomimetic hydrogels.</a> Sci. Rep. 3, (2013).</li><li>Vigf&#250;sd&#242;ttir, &. #. 1. 9. 3. ;. T., Pasrija, C., Thakore, P. I., Schmidt, R. B., Hsieh, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Pericellular+Matrix+in+Mesenchymal+Stem+Cell+Deformation+during+Chondrogenic+Differentiation.">Role of Pericellular Matrix in Mesenchymal Stem Cell Deformation during Chondrogenic Differentiation.</a> Cell. Mol. Bioeng. 3 (4), 387-397 (2010).</li><li>Lee, C. S. D., Gleghorn, J. P., Won Choi, N., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+layered+chondrocyte-seeded+alginate+hydrogel+scaffolds.">Integration of layered chondrocyte-seeded alginate hydrogel scaffolds.</a> Biomaterials. 28 (19), 2987-2993 (2007).</li><li>Gleghorn, J. P., Lee, C. S. D., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+properties+of+laminated+alginate+gels+for+tissue+engineering+of+layered+structures.">Adhesive properties of laminated alginate gels for tissue engineering of layered structures.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 85 (3), 611-618 (2008).</li><li>Gharravi, A. M., Orazizadeh, M., Ansari-Asl, K., Banoni, S., Izadi, S., Hashemitabar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+Fabrication+of+Anatomical+Bioreactor+Systems+Containing+Alginate+Scaffolds+for+Cartilage+Tissue+Engineering.">Design and Fabrication of Anatomical Bioreactor Systems Containing Alginate Scaffolds for Cartilage Tissue Engineering.</a> Avicenna J. Med. Biotechnol. 4 (2), 65-74 (2012).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+Differentiation+of+Human+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Three-Dimensional+Alginate+Gels.">Chondrogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells in Three-Dimensional Alginate Gels.</a> Tissue Eng. A. 14 (5), 667-680 (2008).</li><li>Yeatts, A. B., Gordon, C. N., Fisher, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+an+aggregated+alginate+construct+in+a+tubular+perfusion+system.">Formation of an aggregated alginate construct in a tubular perfusion system.</a> Tissue Eng. C, Methods. 17 (12), 1171-1178 (2011).</li></ol>

כאן אנו מתארים פרוטוקול ליצירת תקליטורי הידרוג&#39;ל אלגינט שכבתיים ללימוד שיתוף תרבויות של אוכלוסיות תאים מרובות, כגון אלה ברקמות שכבתיות פיסיולוגי, למשל, סחוס. מבנים שכבתיים, כגון פלטפורמת התרבות המתוארת, יכולים לשמש כדי לבחון את יחסי הגומלין בין שתי אוכלוסיות ...

לטעון דחיסת נושאות ברקמות כגון סחוס במפרק או לדיסקים מורכבות אזורי רקמות הטרוגנית כי הם קריטיים עבור שניהם הפונקציה ביומכנית ו-התמר mechano המתאים בתוך הרקמה. לא רק ארגון הסלולר לתפקד ברור באזורים שונים, אך המטריצות התאיות (ECM) הן מגוונים גם בהרכב וארגון. לדוגמא, סחוס במפרק מורכב משלושה אזורים עיקריים עם מורפולוגיה תאים שונה, פונקציה מכאנית, ECM. הבדלים בעופרת ECM שלהם דיפרנציאלי אחריות נושאי העומס; השכבה השטחית מעורבת בעיקר לצורך מתן המענה המתיח לטעון, בעוד האזורים באמצע והעמוקים אחראים בעיקר בתגובת הדחיסה 1. בדומה לכך, הדיסק הבין חולייתי, pulposus גרעין דמוי ג&#39;ל מוקף סיסטיק שבשבת annulus והתאים בתוך שני אלה תחומים ברורים לחוות סוגים שונים של גירויים biophysical2. בסוגים אלה של רקמות, תאים ואת המטריצות התאיות בתוך שכבות הרקמה לתקשר אחד עם השני כמו הרקמה עוברת ומגיבה כוחות מכאניים. חזרה על מבנים רקמות הטרוגנית כזה עדיין מהווה אתגר בהנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית, ואת הבנתנו המשמעות הביולוגית שלהם מוגבל. יש צורך culturing פלטפורמות לניתוח רקמות מרובדת כמו גם שיתוף תרבויות של אוכלוסיות שונות של תאים בתוך מבנה אחד. בהנדסת רקמות סחוס במפרק, פיגום פחות שכבתי מבנים נבנו על ידי רתימת היכולת של כונדרוציטים אזורים להפקיד ECM המגוונת לחקות את השכבות השונות של רקמה זו 3,4. עם זאת, בונת הידרוג&#39;ל שכבתית לספק הזדמנות לחקור את האינטראקציה של סוגים שונים של אוכלוסיות תאים חסרות היכולת ליצור רקמות חזקות באופן עצמאי. לדוגמה, פופ שונהulations של בתאי גזע mesenchymal יכול להיות שיתוף תרבותי בתוך מבנים שכבתיים. פיגומים שכבתיים כאלה שמשו בשני chondrocytes ומבדל בתאי גזע mesenchymal עבור הנדסת רקמות משופרת 5. לא רק יכולים אוכלוסיות תאים שונות להיות שיתוף תרבותי בשכבות הידרוג&#39;ל דומות, אבל סוג תא בודד יכול גם להיות מתורבת בתוך שכבות כי נפלו קורבן למניפולציות יש קשיחות משתנית או תוכן ביוכימיים לעורר תגובות שונות מתאי 6,7. הידרוג ביולוגי שונה רב שנוצל שכבת אוכלוסיות תאים עבור הנדסת רקמות סחוס כגון אלה באמצעות פוליאתילן גליקול או בסיסים ויניל אלכוהול פולי 7-9. עם זאת, הידרוג אלגינט אחד biomaterials הפשוטה שממנו ניתן ליצור פיגומים שכבתיים ללימוד אוכלוסיות תאי הטרוגנית שיתוף התרבות. בעוד הידרוג agarose גם נוצר בקלות, הידרוג אלגינט יש ערך המוסף של שמאפשר קלolation של תאים מן המבנה 3-D לניתוח של תאים בודדים, כמו תוארה בעבר 10. במחקרים קודמים, הידרוג אלגינט דו-שכבתי נוצר בסדינים דקים מגיליונות אלה, סעיפים היו פרוסים (למשל., באמצעות אגרוף ביופסיה) עבור יישומים מסוימים כגון ניתוח התוכן ביוכימיים או נכסי גזירת interfacial 11,12. שיטה נוספת להרכבת גליונות אלגינט דק תוארה עם פוטנציאל ריבוד לתוך שכבות מרובות, אך עדיין ידרוש שינוי אל הידרוג&#39;ל לשימוש לבדיקות מכניות 13. כאן, אנו מציגים שיטה ליצירת reproducibly דו-שכבתי דיסקים הידרוג&#39;ל אלגינט לשימוש באוכלוסיות שונות-culturing שיתוף של תאים. פלטפורמת דיסק אלגינט זה הוא בעל מספר יתרונות. בראש ובראשונה, את הצורה לשחזור וגודל קטן הוא מסיע עבור גירוי מכני של תאים משובצים ללא צורך בביופסיה puNCH ​​או שינוי פיזי אחר אל הידרוג&#39;ל עבור יישומים רבים. בנוסף, כדאיויות תא נותרות גבוהות במהלך תהליך השכבות, ולאחר היווצרות קריש הפרדה ברורה של שתי אוכלוסיות התאים בתוך הג&#39;ל גלויה ללא באזור חופפים ראשוני.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="808">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Alginic Acid sodium salt</td>
			<td style="width:180px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A1112</td>
			<td style="width:295px;">Solution made in wt% using DPBS (-/-)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">1x Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (-/-)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">1x Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (+/+)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">11965</td>
			<td>Example. Use desired medium type</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Syringe Filters (0.02um Nylon)</td>
			<td style="width:180px;">FisherBrand</td>
			<td style="width:119px;">0979C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:119px;">BP510</td>
			<td>Prepare solution in sterile water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Criterion Blotter Filter Paper</td>
			<td style="width:180px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1704085</td>
			<td>Cut to size of endplates for mold formation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Cell Microsieve Membrane (10um pore size)</td>
			<td style="width:180px;">Biodesign Inc of New York</td>
			<td style="width:119px;">N10R</td>
			<td>Cut to size of endplates for mold formation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">0.25% Trypsin-EDTA (1x), phenol red</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">25200</td>
			<td>Thaw in 37&#7506;C water bath</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sodium citrate dihydrate</td>
			<td style="width:180px;">FisherScience</td>
			<td style="width:119px;">S93364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td style="width:180px;">FisherBioreagent</td>
			<td style="width:119px;">BP121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">26140</td>
			<td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Penicilin/Streptomycin (10000 U/ml)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">15140</td>
			<td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">L-Glutamine (200mM)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">25030081</td>
			<td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Non-essential Amino Acids (100x)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">11140050</td>
			<td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

layered alginate constructs: a platform for co-culture of heterogeneous cell populations

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

איור 1 מתאר את היווצרות שכבות של הידרוג אלגינט. הושלם דו-שכבתי ג&#39;לים להפגין הפרדה ראשונית מלאה של אוכלוסיות תאים כפי שמוצג באיור 2. כדאיויות תא של אדם בתאי גזע mesenchymal) מוטבעות בתוך הידרוג אלה שכבתיות נותרת גבוהות להשוות את הידרוג ב...

Watch this Scientific Journal Video about Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations at JoVE.com

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

בונה אלגינט Layered: פלטפורמה עבור Co-תרבות של אוכלוסיות תאים הטרוגניות

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

אלגינט microcapsule כפלטפורמה 3D עבור ריבוי והתמיינות של בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC) כדי שושלות שונות

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

דפוסי שיתוף תרבות נייד באמצעות מערכות מימיות שני שלבים

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

פלטפורמה אוטומטית צדדי לניסויים בגירוי תא מיקרו בקנה מידה

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

לוחץ תא כחזק, Microfluidic תאית פלטפורמה להצגה

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

הנדסת רקמות: בנייה תאית 3D פיגום למשלוח גיליונות סלולריים שכבות

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

פלטפורמה חדשני מתיחה עבור יישומים בתאים והרקמות mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

כדאיות של מבנים ניידים Bioprinted באמצעות מדפסת הקרטזיאני Dispenser שלוש

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

פלטפורמת Microfluidic עבור בידוד תפוקה גבוהה מתא בודד ותרבות

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel

אנקפסולציה תא יונקים ב Alginate חרוזים באמצעות כלי פשוט מתערבל

Cell encapsulation in alginate beads has been used for immobilized cell culture in vitro as well as for immunoisolation in vivo. Pancreatic islet ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

פלטפורמת Microarray Cell תפוקה גבוהה עבור ניתוח גומל של התמיינות תאי כוחות המתיחה

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...