Name: sample preparation for mass cytometry analysis
Uploaded: 2017-04-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis at JoVE.com

Work in the Barton lab was supported by a grant from the Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT RP110471). This research was supported in part, by a training grant fellowship for Ryan L. McCarthy from the National Institutes of Health Training Program in Molecular Genetics 5 T32 CA009299. The core facility that maintains and runs the mass cytometry machine is supported by CPRIT grant (RP121010) and NIH core grant (CA016672).

1. Celle Høst <ol><li> Høst celler fra primært væv BEMÆRK: Den for høst af celler fra primært væv proces er specielt anvendelig til muse brysttumorvæv og kan ikke være anvendelige som er til primære væv fra andre kilder. <ol><li> Forberede digestionspuffer ved at opløse 5 mg hyaluronidase og 30 mg collagenase i 10 ml DMEM / F12-medium per gram væv, der skal behandles. Filter sterilisere digestionspuffer. </li><li> Isoler primær mælkekirtel tumor fra mus og optage tumorvægt. </l...

<ol>
	<li>Leipold, M. D., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+protocol+for+daily+tuning+and+running+cell+samples+on+a+CyTOF+mass+cytometer.">Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer.</a> J Vis Exp. , e4398 (2012).</li><li>Leipold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Another+step+on+the+path+to+mass+cytometry+standardization.">Another step on the path to mass cytometry standardization.</a> Cytometry A. 87, 380-382 (2015).</li><li>Newell, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+tetramer+staining+and+mass+cytometry+analysis+facilitate+T-cell+epitope+mapping+and+characterization.">Combinatorial tetramer staining and mass cytometry analysis facilitate T-cell epitope mapping and characterization.</a> Nat Biotechnol. 31, 623-629 (2013).</li><li>Leong, M. L., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Peptide-MHC+Tetramer+Staining+with+Mass+Cytometry.">Multiplexed Peptide-MHC Tetramer Staining with Mass Cytometry.</a> Methods Mol Biol. 1346, 115-131 (2015).</li><li>Zunder, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palladium-based+mass+tag+cell+barcoding+with+a+doublet-filtering+scheme+and+single-cell+deconvolution+algorithm.">Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm.</a> Nat Protoc. 10, 316-333 (2015).</li><li>Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CD45-based+barcoding+approach+to+multiplex+mass-cytometry+(CyTOF).">A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF).</a> Cytometry A. 87, 369-374 (2015).</li><li>Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barcoding+of+live+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+multiplexed+mass+cytometry.">Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry.</a> J Immunol. 194, 2022-2031 (2015).</li><li>Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+platinum-based+covalent+viability+reagent+for+single-cell+mass+cytometry.">A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry.</a> Cytometry A. 81, 467-475 (2012).</li><li>Krutzik, P. O., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+cell+barcoding+in+flow+cytometry+allows+high-throughput+drug+screening+and+signaling+profiling.">Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling.</a> Nat Methods. 3, 361-368 (2006).</li><li>Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+adapted+to+measurements+of+the+cell+cycle.">Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle.</a> Cytometry A. 81, 552-566 (2012).</li><li>Edgar, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+hypoxic+cells+using+an+organotellurium+tag+compatible+with+mass+cytometry.">Identification of hypoxic cells using an organotellurium tag compatible with mass cytometry.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 53, 11473-11477 (2014).</li><li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum.">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li><li>Horowitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+environmental+determinants+of+human+NK+cell+diversity+revealed+by+mass+cytometry.">Genetic and environmental determinants of human NK cell diversity revealed by mass cytometry.</a> Sci Transl Med. 5, 208ra145 (2013).</li><li>Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+molecular+roadmap+to+iPSC+reprogramming+through+progression+analysis+of+single-cell+mass+cytometry.">A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of single-cell mass cytometry.</a> Cell Stem Cell. 16, 323-337 (2015).</li><li>Han, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+reveals+intracellular+survival/proliferative+signaling+in+FLT3-ITD-mutated+AML+stem/progenitor+cells.">Single-cell mass cytometry reveals intracellular survival/proliferative signaling in FLT3-ITD-mutated AML stem/progenitor cells.</a> Cytometry A. 87, 346-356 (2015).</li><li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+trajectory+detection+uncovers+progression+and+regulatory+coordination+in+human+B+cell+development.">Single-cell trajectory detection uncovers progression and regulatory coordination in human B cell development.</a> Cell. 157, 714-725 (2014).</li><li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE.">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).</li><li>Amir el, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia.">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nat Biotechnol. 31, 545-552 (2013).</li><li>Behbehani, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+partial+permeabilization+with+saponin+enables+cellular+barcoding+prior+to+surface+marker+staining.">Transient partial permeabilization with saponin enables cellular barcoding prior to surface marker staining.</a> Cytometry A. 85, 1011-1019 (2014).</li><li>Finck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards.">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83, 483-494 (2013).</li><li>Chester, C., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Algorithmic+Tools+for+Mining+High-Dimensional+Cytometry+Data.">Algorithmic Tools for Mining High-Dimensional Cytometry Data.</a> J Immunol. 195, 773-779 (2015).</li><li>Diggins, K. E., Ferrell, P. B., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+discovery+and+characterization+of+cell+subsets+in+high+dimensional+mass+cytometry+data.">Methods for discovery and characterization of cell subsets in high dimensional mass cytometry data.</a> Methods. 82, 55-63 (2015).</li><li>Leelatian, N., Diggins, K. E., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+Phenotypes+and+Signaling+Networks+of+Single+Human+Cells+by+Mass+Cytometry.">Characterizing Phenotypes and Signaling Networks of Single Human Cells by Mass Cytometry.</a> Methods Mol Biol. 1346, 99-113 (2015).</li><li>van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizaing+Data+using+t-SNE.">Visualizaing Data using t-SNE.</a> J. Mach. Learn. Res. 9, 2431-2456 (2008).</li><li>Kling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometry:+Measure+for+measure.">Cytometry: Measure for measure.</a> Nature. 518, 439-443 (2015).</li><li>Gregori, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperspectral+cytometry.">Hyperspectral cytometry.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 377, 191-210 (2014).</li><li>Chattopadhyay, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brilliant+violet+fluorophores:+a+new+class+of+ultrabright+fluorescent+compounds+for+immunofluorescence+experiments.">Brilliant violet fluorophores: a new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments.</a> Cytometry A. 81, 456-466 (2012).</li><li>Rieger, A. M., Havixbeck, J. J., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-FISH:+Analysis+of+cellular+RNA+expression+patterns+using+flow+cytometry.">X-FISH: Analysis of cellular RNA expression patterns using flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 423, 111-119 (2015).</li><li>Frei, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+simultaneous+detection+of+RNAs+and+proteins+in+single+cells.">Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells.</a> Nat Methods. 13, 269-275 (2016).</li></ol>

Protokollen præsenteres her er med held blevet anvendt til behandling af forskellige dyrkede cellelinier (H1 og H9 hESCs, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10A) og vævsprøver primære (mus knoglemarv, muse embryonale lever, muse voksen lever, musetumor). Uanset kilden, ethvert væv, der kan dissocieres i enkeltceller samtidig bevare den cellulære tilstand bør være modtagelige for analyse efter masse cytometri, men kan kræve nogen protokol optimering. Det er vigtigt at bemærke, at nogle epitoper kan blive påv...

Cytometri muliggør samtidig måling af flere antistofmål på en enkelt celle niveau i store populationer af celler. I traditionel fluorescens-baserede flowcytometri, er antallet af parametre, som kan kvantificeres begrænset af spektral overlapning mellem emissionsspektret af flere fluoroforer, som kræver mere komplekse kompensationsberegninger som antallet af parametre stiger. Disse begrænsninger er rettet efter masse cytometri, når der konstateres tungmetalfrie konjugerede antistoffer og kvantificeres ved flyvetid (TOF) massespektrometri i høj grad at udvide antallet af parametre, der er indsamlet samtidigt og give en høj dimensionel protein-overflod profil for hver individuel celle. En grundlæggende forståelse af arbejdet i massen cytometri instrument er til gavn for brugeren og kan være afgørende for fejlfinding. For en mere grundig beskrivelse af tuning og kører en masse cytometri maskine,under det relaterede manuskript 1. Kort beskrevet en celleprøve mærket med et panel af metal konjugerede antistoffer rettet celleoverflademarkører, cytoplasmatiske proteiner, kerneproteiner, kromatin-bundne proteiner eller andre epitoper af interesse (Figur 1i). De mærkede celler fyldt på maskinen, enten en ad gangen ved manuel injektion eller ved hjælp af en autosampler at prøver fra en 96-brønds plade. De fyldte celler injiceres gennem en forstøver, som frembringer en spray af små væskedråber, der indkapsler cellerne (Figur 1ii). Denne spray er anbragt således, at cellerne ioniseres af en argon plasmabrænderen. Denne ionisering frembringer en partikel sky består af alle de indgående atomer i hver celle (figur 1iii). Da denne partikel sky bevæger til detektoren, er lave atommasse- atomer adskilt fra de høje masse ioner ved en kvadrupol filter. De resterende høje masse ioner fortsætter til detektoren, hvor abundstemmelse af hver isotop kvantificeres (fig 1iv). De rå data indsamlet af detektoren, analyseres ved massen cytometri instrument software til at identificere celle begivenheder. For hver identificeret celle omstændigheder er detekteret i hver kanal signal kvantificeres og gemmes til en udgang .fcs fil. Massen kanaler, der anvendes til detektering af de tungmetal konjugerede antistoffer udviser minimal spektral overlapning, der spænder fra 0-4% med de fleste bidrag under 1%. På grund af denne lave krydstale mellem kanalerne, er det generelt unødvendigt at transformere dataene med en kompensation matrix før analyse 2. Imidlertid bør man være omhyggelig under udformningen af ​​den eksperimentelle panel af antistoffer for at sikre, at et antistof med en høj forekomst epitop ikke er tildelt en masse kanal, der bidrager signal til en kanal tildelt til en lav overflod antistof, da dette kan skabe et kunstigt højt befolkning i kanalen modtager signalet bidrag. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Den nøjagtige fremstilling af prøver til massen cytometrianalyse er stærkt afhængig af de typer prøver indsamles og den eksperimentelle hypotese, der testes. Vi giver eksempler på to protokoller til høst forskellige typer af celler (humane embryonale stamceller) og primære celler (muse brysttumor epitelcelle afsondring). Når der begynder en masse cytometri undersøgelse, er det tilrådeligt først at foretage en lille pilotforsøg for at sikre, at alle protokoller og antistoffer, der skal anvendes fungerer godt i undersøgerens hænder. Dette er især vigtigt, når der skal anvendes brugerdefinerede konjugerede antistoffer som den delvise reduktion reaktion under antistofkonjugation har potentialet til at forstyrre antistofaffinitet; derfor skal valideres empirisk for at sikre nøjagtigheden af ​​data hver tilpasset antistof. Andre overvejelser indbefatter bestemmelse om celleoverflade antistoffer, der skal anvendes i assayet vil erkende deres epitoper efter fiksering eller hvis de Need, der skal anvendes til levende celler. Nogle fiksering kan forhindre korrekt farvning med celleoverflade antistoffer som vides at forekomme med peptid-MHC-farvning 3, 4. Udførelse celleoverfladen antistoffarvning på levende celler kan være nødvendigt for nogle antistoffer, men dette udelukker muligheden for barcoding før antistofmærkning som de fleste Stregkodeprodukter metoder udføres efter fiksering 5 selvom antistofbaseret stregkoder 6, 7 er en undtagelse. Ved bestemmelse af antallet af celler, der skal fremstilles til analyse, er det vigtigt at vide, at vil blive opdaget kun en brøkdel af cellerne læsset på maskinen og producerer data. Dette tab skyldes primært ineffektivitet når forstøveren sprøjter prøven ved brænderen. Den nøjagtige procent tab afhænger af massen cytometri setup maskine og celletype, men kan variere fra 50-85% og bør væreovervejes ved udformningen af ​​forsøget. Denne protokol er blevet optimeret til 2x10 6 celler per prøve, men kan tilpasses til forarbejdning mindre eller større prøvestørrelser. Denne protokol kan anvendes med minimale modifikationer til prøvestørrelser fra 1 x 10 6 til 4 x 10 6, men det er kritisk, at prøvens størrelse holdes konsistente inden et eksperiment. Ændringer i celleantal kan påvirke intensiteten af ​​stregkoder og antistoffarvning og bør holdes nogenlunde konsistent mellem prøver, der skal sammenlignes direkte. Nogle procedurer, såsom døde celle mærkning og DNA-mærkning, skal udføres i langt de fleste, hvis ikke alle eksperimentelle design. Mærkningen af ​​døde celler i eksperimenter analyse kun overflademarkører kan opnås ved anvendelse Rh103, men Rh103 bør undgås i eksperimenter, hvor permeabilisering er påkrævet da det resulterer i farvning tab. For eksperimenter, der involverer permeabilisering, er det tilrådeligt at udnytte cisplatin <sop class = &quot;xref&quot;&gt; 8 og, når det er muligt, at et antistof, der genkender spaltet PARP eller spaltes Caspase påvise apoptotiske og døde celler. Stregkodning prøver kan reducere antistof forbrug, mindske erhvervelse tid og fjerne prøve-til-prøve variabilitet 9. Processen med barcoding involverer påføring af en unik prøve-specifik kode til alle celler, som anvendes til at tildele hver celle til sin prøve af oprindelse. Efter stregkodning prøverne kan samles forud for antistoffarvning, en proces, der sikrer alle prøver er plettet ligeligt. For at minimere eksperimentelle fejl, er det klogt at stregkode og samle eventuelle prøver, der skal direkte i forhold til hinanden. Øjeblikket findes der flere metoder til stregkodning prøver til massen cytometrianalyse 5, 6, 7, hvoraf to er vist her (se nedenfor). Med i øjeblikket tilgængelig reagents er det muligt at kvantificere den overflod af 38 antistofmål, identificere celler i S-fase 10, skelne levende og døde celler 8 og måle cellulære niveauer af hypoxi 11 i en multiplekset eksperiment af multiple prøver. Denne evne til at indsamle høj parameter enkelt celle data for store cellepopulationer giver bedre profilering af meget heterogene cellepopulationer og har allerede givet en række hidtil ukendte biologiske indsigter 12, 13, 14, 15, 16. Destillation af den resulterende kompleks data til fortolkelige oplysninger har krævet anvendelse af beregningsmæssige algoritmer herunder Spanning Tree Progression af Density Normaliseret Events (SPADE) 17 og visne 18. Denne artikel præsenterer en tilgængeligoverblik over, hvordan man designer og gennemfører en masse cytometri eksperiment og introducerer grundlæggende analyse af masse-cytometri data.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>mTeSR1 medium kit</td>
			<td>Stem Cell technologies</td>
			<td>05850</td>
			<td>Warm at room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F-12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11330-032</td>
			<td>Warm at 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Stem Cell technologies</td>
			<td>07920</td>
			<td>Warm at 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Equitech</td>
			<td>BAH62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell ID Pt194</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td></td>
			<td>Provided at 1mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell ID Pt195</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td></td>
			<td>Provided at 1mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell ID Pt196</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td></td>
			<td>Provided at 1mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-400-040-M250</td>
			<td>Soluble to 25mg/ml in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Iodo-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7125</td>
			<td>Soluble to 74mg/ml in 0.2N NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodium 103 intercelating agent</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201103A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1105-4</td>
			<td>Chill at -20&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml round bottom tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml 35um filter cap tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQ four element calibration beads</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase Type I-S</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel #10</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z69239</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for mass cytometry analysis

Mass cytometri benytter antistoffer konjugeret med tungmetal etiketter, en tilgang, der i høj grad har øget antallet af parametre og muligheder for dyb analyse langt ud over hvad der er muligt med konventionelle fluorescens-baserede flowcytometri. Som med enhver ny teknologi, der er kritiske trin, der hjælper sikre en pålidelig generation af data af høj kvalitet. Præsenteres her, er en optimeret protokol, der inkorporerer flere teknikker til forarbejdning af celleprøver til masse-cytometri-analyse. De her beskrevne metoder vil hjælpe brugeren undgå almindelige faldgruber og opnå ensartede resultater ved at minimere variabilitet, hvilket kan føre til ukorrekte oplysninger. At informere forsøgsdesign, er rationalet bag valgfrie eller alternative trin i protokollen og deres effektivitet i at afdække nye resultater i biologi af systemet blive undersøgt dækket. Endelig er repræsentativ data for at illustrere forventede resultater fra teknikker presented her.

Protokollen præsenteres her kan bredt anvendes til en bred vifte af dyrkede og primære celleprøver med kun mindre modifikationer. Afhængig af kravene til forsøget, kan den udføres i en modulær måde, når visse elementer, såsom stregkoder eller celleoverfladefarvning, er ikke nødvendige. Anvendes i sin helhed denne protokol muliggør fremstillingen af ​​multiplekserede masse cytometri prøver mærket til døde udelukkelse celle, S-fase population identifikation og farvet til...

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis at JoVE.com

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Prøvefremstilling til Mass cytometrianalyse

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Prøve forberedelse til single virion Atomic Force mikroskopi og superopløsning fluorescens Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Teknikker til analyse af ekstracellulær Vesikler anvendelse af flowcytometri

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

En alternativ metode til Sample Preparation med lav Cell Antal for TEM Analyse

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Forberedelse af prøver og billeddannelse af Exosomes af transmissions Elektron Mikroskopi

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Miniaturiserede prøveforberedelse til transmissions Elektron Mikroskopi

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

Spalteåbninger Tape-Peel: En forbedret metode til vagt celle prøveforberedelse

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels

Prøveforberedelse til masse-massespektrometri-baseret Proteomics analyser af okulær Microvessels

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly ...

Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

Prøveforberedelse til metabolisk profilering ved hjælp af MALDI Mass Spectrometry Imaging

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to ...