Name: improved polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism genotyping of toxic pufferfish by liquid chromatography/mass spectrometry
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry at JoVE.

This work was supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research by the Japanese Society for the Promotion of Science (15K08060).

The authors have nothing to disclose.

لاستخراج الحمض النووي، ويتم استخدام عدة التجارية لاستخراج الحمض النووي من الدم والأنسجة وفقا للبروتوكول من الشركة المصنعة مع تعديلات طفيفة (كمية بروتين كاف والطرد المركزي من حل تحلل). ومع ذلك، أي عدة استخراج يمكن استخدامها طالما يمكن استخراج الحمض النووي الخلوي مع الانتعاش والنقاء المناسب لPCR. وقد تم اختبار هذه الطريقة باستخدام العضلات، وفنلندا، والكبد، والمبيض، والجلد 37. الزعنفة هو مناسبة خاصة بسبب مساحة كبيرة، والتي تمكن تحلل السريع مع بروتين K. الطازجة أو المجمدة أو المجففة، والمغلي وتم اختبار عينات ينفوخية خبز بنجاح 37. تم تصميم التمهيدي مجموعة PCR (الجدول 1) لينفوخية وتضخيم 16S الميتوكوندريا الريباسي الجينات الحمض النووي الريبي ينفوخية. الحمض النووي الهدف لتضخيم هو 114-115 سنة مضت (جنس سمك القراض) و 86 سنة مضت (جنس Lagocephalus) (جدول رقم 5). لتسهيل طريقة الإنمائية لل<html> الإقليم الشمالي، واستخدمت أليغنوكليوتيد] توليفها وجود تسلسل الهدف للإشارة بدلا من جمع العينات ينفوخية الأصيلة. يمكن استبدال مجموعة التمهيدي التي كتبها التمهيدي مجموعة أخرى استجابة لهذا الغرض، ومع ذلك، يجب أن يكون طول الحمض النووي النهائي بعد الهضم الأنزيمي أقل من 100 الإقليم الشمالي من حيث الحفاظ على جودة الطيف الكتلي اللازمة لdeconvolution ناجحة. بالإضافة إلى ذلك، ضغط النيتروجين في C-فخ ينبغي خفض عندما النوكليوتيد الهدف هو أطول من حوالي 75 الإقليم الشمالي ونوعية الطيف الكتلي ليست كافية لdeconvolution ناجحة. يمكن السيطرة على هذه القيود من خلال التطورات الأخيرة في مجال البرمجيات الصك، وإلا فإن صمام لC-فخ داخل الهيكل يجب ضبطها كما هو موضح في قسم البروتوكول. أما بالنسبة لإعداد العينات، واستخدام الكواشف خالية من المنظفات أمر بالغ الأهمية لLC لاحق من حيث ذروة الشكل المناسب، ذروة كثافة كافية ومستقرة الوقت الاحتفاظ 31. معشوقة = &quot;jove_content&quot;&gt; وPS-DVB الشعرية متراصة العمود 21،24-33، وهي C 18 العكسية المرحلة جسيمات السيليكا العمود 23،40،41 واللوني التفاعل مسعور (HILIC) وقد استخدمت العمود 42 لLC / تحليل ESI-MS من أليغنوكليوتيد]. من بينها، والعمود الشعري متراصة متفوقة على غيرها من حيث القدرة الانفصال، ومع ذلك، تم اتخاذ العمود الشعري متراصة المستخدمة في الدراسات السابقة في البيت وتعمل في معدل تدفق منخفض (2 ميكرولتر / دقيقة)، الأمر الذي يتطلب الأجهزة مخصص لLC الجزئي. لتسهيل عملية سهلة، وجرى تقييم الأعمدة المتاحة تجاريا لفصل أليغنوكليوتيد] طويلة في ارتفاع معدلات تدفق (100-400 ميكرولتر / دقيقة). تم فصل ثلاثة أزواج من الدوبلكس الحمض النووي (26 و 37 و 53 سنة مضت) باستخدام الأعمدة المذكورة أعلاه، ومع ذلك، كانت دورة مرات من -bonded العمود C 18 جسيمات السيليكا والعمود PS-DVB متراصة 65 و 70 دقيقة على التوالي ، في حين أن من C <sub&gt; كان 18 -bonded العمود السيليكا متراصة 8 دقيقة (الشكل 1). أخذ التحليل السريع بعين الاعتبار، وقد تم اختيار العمود السيليكا متراصة C 18 -bonded لأغراضنا على الرغم من قدرة فصل محدودة؛ ومع ذلك يجوز تشغيل تبقى من عمودين عند طلب تحسين الانفصال. من الناحية النظرية، في حالة وجود عمود متراصة، لا يوجد حجم الخلالي وستضطر الطور المتحرك في التدفق من خلال مسام المرحلة الصلبة مع الحفاظ على طول مسار ثابت، مما يتيح لفصل كفاءة 27. سوف تتجلى هذه العمليات، ولا سيما في تحليل الجزيئات الكبيرة مثل النوكليوتيد، كما نشر البطيء لتلك الجزيئات الكبيرة. واحدة من مزايا العملية من عمود متراصة هو أن الضغط الخلفي هو أقل من السيليكا العمود الجسيمات 27. وعلى الرغم من ارتفاع معدل تدفق (400 ميكرولتر / دقيقة) وانخفاض درجة حرارة العمود (20 درجة مئوية)، أقصى قدر من الضغط الخلفي للكان نظام 12.5 ميجا باسكال 37. وهذا هو أول مظاهرة من الاستفادة من C 18 -bonded العمود السيليكا متراصة للتحليل السريع لالنوكليوتيد طويلة. ونظرا لارتفاع معدل تدفق، لا حاجة إلى صك مخصص لLC الصغيرة ومحاذاة دقيقة في واجهة. بدلا من ذلك، لا بد من التحقيق ESI ساخنة لفصل الوجهين الحمض النووي ومساعدة تأين الحمض النووي كما هو موضح في وقت لاحق. يستخدم ايون الزوج اللوني عادة لفصل MS-متوافق من أليغنوكليوتيد]. ومع ذلك، كاشف ايون الزوج يتدخل بشكل عام مع عملية ESI ويقلل حساسية ESI-MS. لذلك، كثيرا ما يستخدم HFIP للمرحلة الجوالة لتحسين حساسية النوكليوتيد. ومع ذلك، HFIP (نقطة الغليان 59 ° C) يبخر بسرعة في واجهة من قبل (نقطة الغليان 65 درجة مئوية) الميثانول، وبالتالي، هذه الخسارة من المذيبات يزيد درجة الحموضة وتشجع الانفصال كاشف ايون الزوج (أي الشاي)من النوكليوتيد. لأن الطريقة الحالية توظف ESI التحقيق ساخنة، التي nebulizes شطافة مع غاز النيتروجين الساخن في 350 درجة مئوية، قد يكون وأكد الإفراط في هذا الشأن. بدلا من العازلة HFIP-TEA، أوصى إرب وOberacher خلات cyclohexyldimethylammonium (CycHDMAA، ودرجة الحموضة 8.4) للتحليل التنميط الجيني بسبب انخفاض في تشكيل ناتج إضافة مع أيونات المعادن النزرة 33. الكتاب استنتجوا أن CycHDMAA نفسها قمع تشكيل ناتج إضافة المعادن. وعلى الرغم من الأدب، لم يحترم تشكيل ناتج إضافة هامة في هذا الأسلوب. بالإضافة إلى ذلك، فإن الفائدة التي شهدها نظام HFIP-TEA-الميثانول هو أن ذروة المنطقة التي تم الحصول عليها مع نظام HFIP-TEA-الميثانول وكان 17 مرات أكبر من تلك التي تم الحصول عليها من نظام CycHDMAA-الأسيتونتريل عند تحليل وamplicon 86 سنة مضت من T. poecilonotus (لا تظهر البيانات). عيب واحد من نظام HFIP-TEA-الميثانول، ومع ذلك، هو زيادة تكلفة بالنسبة للنظام CycHDMAA الأسيتونتريل. حساب كتلة monoisotopic يتطلب الفصل بين قمم النظائر من الأيونات تتضاعف. لذلك، القرار هو أمر حاسم لهذا التحليل. وعلى الرغم من قوة قرار المطلوبة تعتمد على طول الزوج قاعدة تحليلها، تحليل TOF التقليدية، التي لديها قوة قرار من عدة عشرات من الآلاف، قد تكون محدودة لتحليل أليغنوكليوتيد قصيرة. حسبت الجماهير monoisotopic النظرية هو مبين في الجدول رقم 4 من المؤلفات قاعدة المقابلة من التحاليل. بدلا من ذلك، Muddiman آخرون بتطوير تطبيق برنامج لحساب تكوين قاعدة من كتلة دقيقة 43. تم دمج برنامج مماثل في الآلي النظام ESI-MS 16-18. استخدام هذه الخوارزميات قد يحسن متانة الأسلوب الحالي لكتلة monoisotopic قياس لا تتطابق دائما إلى قاعدة فريدة من نوعها تكوين سالجناح إلى التسامح الشامل من 3 جزء في المليون الناجمة عن خطأ في القياس لا مفر منه. لسوء الحظ، لم نتمكن من الحصول على هذه البرمجيات لهذه الدراسة. وmonoisotopic تحديد الأنواع الحالي القائم على كتلة قد تكون مناسبة ليس فقط لتمايز ينفوخية ولكن أيضا للكشف عن الأشكال الأخرى الحمض النووي لأنه يعتمد الأسلوب الحالي على تحليل تكوين قاعدة، وليس فيها إجراء صممت خصيصا لينفوخية. أما بالنسبة للكشف عن تعدد الأشكال الحمض النووي، ونظام ESI-MS مخصص هو مؤتمتة بالكامل وسهلة التشغيل، والتي قد تكون مناسبة للاستخدام التشخيص مثل الكشف عن مسببات الأمراض 15،17،18،20،30. على العكس من ذلك، هذا الأسلوب هو ممكن مع الأدوات المشتركة الأبحاث وأجهزة، وبالتالي، ومناسبة لاستخدامات البحوث. وقد تم بالفعل تطبيق ESI-MS إلى تعدد الأشكال الحمض النووي البشري مثل واحد 13،28،32 النوكليوتيدات تعدد الأشكال، قصيرة جنبا إلى جنب تكرار 26والحمض النووي analsis 16،19. تم تحليل الحمض النووي الريبي الصغيرة أيضا عن طريق الشعيرات الدموية LC / ESI-MS 44. ويمكن أيضا أن تتحقق هذه التطبيقات التي نشرتها الأسلوب الحالي. وبالإضافة إلى ذلك، قد تكون هذه الطريقة مناسبة لرصد التفاعل بين النوكليوتيد ومنخفضة الوزن الجزيئي المركبات، مثل تفاعل المضادات الحيوية والحمض النووي الريبي الريباسي 45 بسبب فصل درجات الحرارة المنخفضة. في مثل هذه الحالات، أليغنوكليوتيد والمركبات منخفضة الوزن الجزيئي يجب أن يتم الكشف في وقت واحد، والذي هو ميزة استخدام LC / ESI-MS. هناك قيد أن الأجهزة غير مناسب لإجراء تحليل الموازي كما في التقنيات التقليدية مثل سانجر تسلسل وفي الوقت الحقيقي PCR. بالإضافة إلى ذلك، يحدد المنهج الحالي تكوين قاعدة الوحيد وأي استبدال قاعدة داخل نفس الجزيء لا يمكن تمييزها. ومع ذلك، فإن تحليل الحمض النووي يستند إلى MS-الموصوفة هنا قد لا تزال لديها الجدارة في المدىالصورة الدقة في المقارنة مع الحمض النووي ملزمة التقنيات المعتمدة صبغ مثل الكهربائي للهلام وفي الوقت الحقيقي PCR.

مطياف الكتلة (MS) هو عبارة عن تقنية مقبولة لتحديد سريع وموثوق بها من الأحماض النووية، مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز / التأين (MALDI) وتأين بالإرذاذ الإلكتروني (ESI) تستخدم للتأين 1،2. يتم الجمع بين تقنية MALDI عادة مع الوقت من الطيران (TOF) محلل. ومع ذلك، يقتصر تطبيق MALDI-TOF MS إلى أليغنوكليوتيد قصيرة (~ 25 النيوكليوتيدات (الإقليم الشمالي)) نظرا لتجزئة لاحق، وتشكيل ناتج إضافة وانخفاض التأين كفاءة 1،2. في المقابل، ESI ينطبق على أليغنوكليوتيد أطول (&gt; 100 الإقليم الشمالي)، ولكن العديد من الدول المسؤولة عن مضاعفات اتهم الأيونات ([M-نيو هامبشاير] ​​ن-) يتم إنتاجها في وقت واحد من الجزيئات الكبيرة الحيوية، وبالتالي كتلة تحليلها يمكن أن يتجاوز العلوي حدود النطاق م / ض لطيف. وهذا يتطلب تفسير أطياف معقد، أي التحول من سلسلة ولاية تهمة في الكتلة المقابلةعبر deconvolution. في حالة قياس كتلة جزيء صغير، ذروة كتلة monoisotopic، أي كتلة جزيء يحتوي فقط النظير الأكثر شهرة من كل عنصر هو الأكثر وفرة ومراعاتها بشكل طبيعي 3. كما يزيد الوزن الجزيئي، والتحولات توزيع النظائر إلى أعلى م / ض وذروة monoisotopic يصبح تحجب الضوضاء الأساسي 3-5. مرة واحدة في ذروة monoisotopic لم يعد للكشف عن الجماهير أكبر من 10 كيلو دالتون 3، يتم استخدام متوسط ​​الكتلة الجزيئية لقياس بدلا من الكتلة monoisotopic 5. في مثل هذه الحالات، وتوزيع النظائر التي يتم فصل كل القمم الفردية بنسبة 1 دا لا يمكن إلا أن تراعى عند محلل كتلة عالية الدقة مثل TOF، وتحويل فورييه تعديل ملكوت فخ محلل 6، أو تحويل فورييه الأيوني سيكلوترون صدى يستخدم محلل للتحليل. ومع ذلك، في ذروة الأكثر وفرة هي الصورةometimes لا تتفق مع متوسط ​​الكتلة الجزيئية 5. هذه المشاكل يمكن أن يؤدي إلى صعوبة تحديد بدقة التحاليل. ونظرا للتباين في وفرة طبيعية من النظائر المستقرة والصعوبات في تحديد متوسط ​​الكتلة الجزيئية، وقياس كتلة monoisotopic مثالية لتوصيف الشامل من الجزيئات الحيوية 3،4. في الواقع، إذا كان ذروة monoisotopic يمكن ملاحظتها أو لا، فإن كتلة monoisotopic يمكن تقدير بمقارنة نمط توزيع النظائر لاحظت أن واحدة نظريا محسوب من تحليلها نموذج 4،7-10. أدرج الخوارزمية المناسب 8 الآن في البرمجيات الاحتكارية. في سياق ESI-MS، يطلب من التفكك من الوجهين الحمض النووي وتنقية وتحلية للقياس المباشر لتجنب فشل التأين بسبب قمع أيون وناتج إضافة تشكيل 2،10-14. وهذه الإجراءات هي troublesome، ومع ذلك، فقد تم تطوير أنظمة التحليلية مؤتمتة بالكامل تجاريا تنطوي على تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، وإعداد العينات وESI-MS للكشف عن مسببات الأمراض 15-20. وثمة نهج آخر هو إدخال اللوني السائل (LC) للانفصال. يوفر LC على فصل على الانترنت من التحاليل من المواد التعايش ولا يتطلب إعداد عينة شاقة قبل التأين 21،22. ومع ذلك، والفصل بين الأحماض النووية باستخدام الطور المتحرك MS-متوافقة هو أكثر صعوبة من لمعظم مركبات أخرى مثل المخدرات، والببتيدات والبروتينات نظرا لطبيعة polyanionic من النيوكليوتيدات. وتشمل الأمثلة الأكثر نجاحا في LC / ESI-MS استخدام ايون الزوج عكس المرحلة LC. مرحلة الجوالة من 1،1،1،3،3،3-hexafluoro-2-بروبانول وقد اقترحت (HFIP) -triethylamine (TEA) -methanol في البداية من قبل Apffel وآخرون لفصل وكشف أليغنوكليوتيد قصيرة 23. تطبيق LC / ESI-MS التنميط الجيني لالتمايزوقد أبلغ ن الأنواع الممرض، الأشكال-النوكليوتيدات واحدة ويكرر قصيرة جنبا إلى جنب باستخدام الشعرية عمود البوليمر متراصة التي يمكن فصل أليغنوكليوتيد أطول 1،21،24-33. في اليابان والولايات المتحدة، حدث تسمم غذائي خطير بسبب عدم التعرف وإعداد غير المناسب للينفوخية، وهذا على الرغم من حقيقة أن توزيع وإعداد ينفوخية يتم التحكم بدقة عن طريق التشريع سلامة الأغذية 34،35. وعلاوة على ذلك، وهو القتل العمد باستخدام مستخلص ينفوخية لم يحدث في اليابان 36. لذلك، لا بد من التفريق بين الأنواع ينفوخية من الصحة العامة وجهات النظر التحقيق والطب الشرعي. بالإضافة إلى ذلك، لأن rubripes سمك القراض أبعد ما تكون أكثر تكلفة من أنواع أخرى من ينفوخية، وهناك حاجة أيضا القدرة على التمايز في سياق تحقيقات الاحتيال الغذاء. هنا، وهي طريقة مفصلة لتحديد موصفت كتلة onoisotopic منتج PCR بواسطة LC / ESI-MS باستخدام عكس المرحلة العمود السيليكا متراصة ومطياف الكتلة عالية الدقة. على وجه التحديد، وقد تم تطوير هذا النهج للسماح التفريق بين الأنواع السامة ينفوخية على أساس استخدام PCR طول تقييد جزء تعدد الأشكال (RFLP) طريقة 37، وهو أول مثال للتمايز الأنواع من الحيوانات باستخدام MS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="742">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">DNeasy Blood &#38; Tissue Kit (50)</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:107px;">69504</td>
			<td style="width:272px;">DNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:107px;">19131</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Ethanol (99.5+ vol%)</td>
			<td style="width:147px;">Wako</td>
			<td style="width:107px;">054-07225</td>
			<td style="width:272px;">For dilution of wash buffers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">TE buffer (pH 8.0)</td>
			<td style="width:147px;">Wako</td>
			<td style="width:107px;">310-90023</td>
			<td style="width:272px;">For dilution of DNA sample</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">PCR primer</td>
			<td style="width:147px;">Fasmac</td>
			<td style="width:107px;">NA</td>
			<td style="width:272px;">Purified with reverse-phase cartridge column by the supplier</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Template DNA</td>
			<td style="width:147px;">Eurofins Genomics</td>
			<td style="width:107px;">NA</td>
			<td style="width:272px;">Purified by HPLC by the supplier</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Ultrapurified water</td>
			<td style="width:147px;">NA</td>
			<td style="width:107px;">NA</td>
			<td style="width:272px;">Generated with a Milli-Q Direct water purification system (Merck Millipore), used for sample preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Detergent Free 5X Phusion HF Buffer</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:107px;">F-520L</td>
			<td style="width:272px;">Use instead of the provided buffer of DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Pfu-X DNA polymerase</td>
			<td style="width:147px;">Jena Bioscience</td>
			<td style="width:107px;">PCR-207S</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">dNTP mix (20 mM each)</td>
			<td style="width:147px;">Jena Bioscience</td>
			<td style="width:107px;">NA</td>
			<td style="width:272px;">Supplied with the DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:216px;">10&#215; Universal buffer M</td>
			<td style="width:147px;">Takara Bio</td>
			<td style="width:107px;">NA</td>
			<td style="width:272px;">Containing 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol and 500 mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dra I</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:107px;">FD0224</td>
			<td style="width:272px;">Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Msp I</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:107px;">FD0544</td>
			<td style="width:272px;">Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP)</td>
			<td style="width:147px;">Fluka</td>
			<td style="width:107px;">42060-50ML</td>
			<td style="width:272px;">Eluent additive for LC-MS grade.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Triethylamine (TEA)</td>
			<td style="width:147px;">Fluka</td>
			<td style="width:107px;">65897-50ML</td>
			<td style="width:272px;">Eluent additive for LC-MS grade.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">T6508</td>
			<td style="width:272px;">For preparation of calibrant.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Sodium hydroxide (1.0 M)</td>
			<td style="width:147px;">Fluka</td>
			<td style="width:107px;">72082</td>
			<td style="width:272px;">Dilute to 10 mM with ultrapurified water and use for titration of trifluoroacetic acid.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:147px;">Fluka</td>
			<td style="width:107px;">34967</td>
			<td style="width:272px;">For preparation of calibrant, LC/MS grade.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:147px;">Kanto</td>
			<td style="width:107px;">25185-76</td>
			<td style="width:272px;">For mobile phase, LC/MS grade.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Water</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:107px;">W6-1</td>
			<td style="width:272px;">For mobile phase, LC/MS grade.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Microcentrifuge tube (0.5 ml)</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:107px;">0030123301</td>
			<td style="width:272px;">PCR clean grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Microcentrifuge tube (1.5 ml)</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:107px;">0030123328</td>
			<td style="width:272px;">PCR clean grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">UVette</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:107px;">0030106300</td>
			<td style="width:272px;">Disposable UV cuvette.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Gel Green</td>
			<td style="width:147px;">Biotium</td>
			<td style="width:107px;">41004</td>
			<td style="width:272px;">Fluorescent DNA stain</td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;width:216px;">Cosmospin filter G (0.2 &#956;m)</td>
			<td style="width:147px;">Nakalai Tesque</td>
			<td style="width:107px;">06549-44</td>
			<td style="width:272px;">Made of hydrophilic polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane. Any centrifugal filter unit (pore size, 0.2&#8211;0.5 &#956;m) made of hydrophilic PTFE or another low-binding membrane is applicable.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">300-&#956;l PP screw vial</td>
			<td style="width:147px;">American Chromatography Supplies</td>
			<td style="width:107px;">V0309P-1232</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Preassembled screw cap and septa</td>
			<td style="width:147px;">Finneran</td>
			<td style="width:107px;">5395-09R</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">Monobis C18 analytical column (2.0&#215;50 mm, mesopore size = 30 nm)</td>
			<td style="width:147px;">Kyoto Monotech</td>
			<td style="width:107px;">2050H30ODS</td>
			<td style="width:272px;">Outside Japan, available for purchase from GL Sciences via its distributors. (http://www.glsciences.com/distributors/)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Monobis C18 guard column</td>
			<td style="width:147px;">Kyoto Monotech</td>
			<td style="width:107px;">GCSET-ODS3210</td>
			<td style="width:272px;">Holder included.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Cadenza CW-C18 (3.0&#215;250 mm)</td>
			<td style="width:147px;">Imtakt</td>
			<td style="width:107px;">CW036</td>
			<td style="width:272px;">C18-bonded particulate silica column</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">ProSwift RP-4H (1.0&#215;250 mm)</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:107px;">066640</td>
			<td style="width:272px;">Poly(styrene-divinylbenzene) monolith column</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Themo Mixer C</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:107px;">5382 000.023</td>
			<td style="width:272px;">For digestion of fish tissues.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:147px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:107px;">UV-3150</td>
			<td style="width:272px;">Quantification of DNA concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Thermal cycler</td>
			<td style="width:147px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:107px;">T100</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Portable refrigerator</td>
			<td style="width:147px;">Twinbird</td>
			<td style="width:107px;">D-CUBE</td>
			<td style="width:272px;">For aqueous mobile phase to avoid evaporation of HFIP. This can be replaced by an ice box.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Ultimate 3000 liquid chromatograph</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:107px;">NA</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Q Exactive mass spectrometer</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:107px;">NA</td>
			<td style="width:272px;">Fourier transform mass spectrometer equipped with the modified Kingdon trap analyzer.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Protein deconvolution 3.0</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:107px;">NA</td>
			<td style="width:272px;">Use version 3.0 or higher having an isotopic patter model of nucleotide.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism genotyping of toxic pufferfish by liquid chromatography/mass spectrometry

يوصف نسخة محسنة من تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) -restriction جزء طول تعدد الأشكال (RFLP) طريقة لالتنميط الجيني الأنواع ينفوخية السامة عن طريق السائل اللوني / Electrospray التأين الطيف الكتلي (LC / ESI-MS). ويتم استخراج الحمض النووي من استخدام عدة استخراج الحمض النووي استنادا غشاء السيليكا. بعد التضخيم PCR باستخدام عازلة PCR خالية من المنظفات، تضاف الانزيمات التقييد إلى حل من دون تنقية محلول التفاعل. عكس المرحلة العمود السيليكا متراصة وتحويل فورييه يعملون عالية الدقة مطياف الكتلة وجود تعديل ملكوت فخ محلل للانفصال وكشف، على التوالي. الطور المتحرك، ويتألف من 400 ملي 1،1،1،3،3،3-hexafluoro-2-بروبانول، 15 ملي ثلاثي الإيثيلامين (الرقم الهيدروجيني 7.9)، والميثانول، ويتم تسليم بمعدل تدفق 0.4 مل / دقيقة. دورة الزمن لتحليل LC / ESI-MS هو 8 دقيقة بما في ذلك موازنة العمود. برنامج Deconvolution وجود النظائر نموذج التوزيع سو قليل النوكليوتيد يستخدم لحساب كتلة monoisotopic المقابلة من الطيف الشامل. لتحليل أليغنوكليوتيد] (المدى 26-79 النيوكليوتيدات)، وكانت دقة الجماعية 0.62 ± 0.74 جزء في المليون (ن = 280) وما استمر دقة ممتازة والدقة لمدة 180 ساعة دون استخدام معيار كتلة القفل.

تم تقييم ثلاثة أعمدة المتاحة تجاريا لفصل أليغنوكليوتيد] طويلة في معدلات تدفق من 100-400 ميكرولتر / دقيقة. A-مسام واسعة octadecyl سلسلة الكربون (C 18) عمود الجسيمات -bonded السيليكا (أ)، بولي المتاحة تجاريا (الستايرين divinylbenzene) (PS-DVB) عمود متراصة (ب) والسيليكا -bonded العمود متراصة C 18 ( ج) تمت مقارنة (الشكل 1). ثلاثة أزواج من الدوبلكس الحمض النووي (26 و 37 و 53 سنة مضت) تم فصل باستخدام كافة الأعمدة، وكانت تستخدم C 18 السيليكا -bonded العمود متراصة في دراسات لاحقة. ممثل النتائج لتحليل عينة الحمض النووي المستخرج من عضلة T. ويرد rubripes في الشكل 2. قمم حل نظائريا، كما هو مبين في الشكل 2A، مطلوبة من أجل حساب كتلة monoisotopic بنجاح. النظرية والاتفاقات البيئية المتعددة الأطرافمحكم monoisotopic كتلة T. وتظهر rubripes في الشكل 2B. لأنه يتم تنفيذ عملية الهضم مع نوكلياز داخلي بعد PCR التضخيم بغير طهور، شغل في نهاية 3&#39;لزجة الناتجة عن نوكلياز داخلية MSP أنا مع بوليميريز الحمض النووي المتبقية. وفقا لتحليل amplicons مشتقة من قوالب الحمض النووي الاصطناعية، وتراوحت دقة الجماعية من -2.48 إلى 2.40 جزء في المليون (0.62 ± 0.74 جزء في المليون في المتوسط، ن = 280). وهكذا، تم استخدام التسامح الشامل من 3 جزء في المليون للتمييز بين الأنواع (الجدول 4). باستخدام الجدول، والتمييز بين كل من العينات ينفوخية تم الحصول عليها من الأسواق والمحلات التجارية على نحو سليم وأنواع محددة 37. وفقا لتحليل دوري للعينة التي تم الحصول عليها من القالب الحمض النووي الاصطناعي من T. ذهبية العيون، تم تحديد جميع الجماهير monoisotopic من التحاليل بنجاح داخل ± 3 جزء في المليون لفي لوأست 180 ساعة دون أي معايرة الجماعية (الشكل 3). وهذا يعني أن معايرة الجماعية سيكون مطلوبا على أساس أسبوعي. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54402/54402fig1.jpg" /> الشكل 1: مجموع الاستشرابية أيون الحالية للمنتج PCR-RFLP المستمدة من القالب الحمض النووي توليفها من T. pardalis باستخدام عمود C 18 -bonded جسيمات السيليكا (أ، 3 × 250 ملم، وحجم الجسيمات 3 ميكرون)، بولي (الستايرين divinylbenzene) (PS-DVB) عمود متراصة (ب، 1.0 × 250 مم) وC 18 -bonded العمود متراصة السيليكا (ج، الطريقة الحالية) شروط (أ): معدل تدفق 0.2 مل / دقيقة. نسبة الميثانول، 0-2 دقيقة 5٪، 2-5 دقيقة 5٪ -25٪، 5-20 دقيقة 25٪ -40٪، 20-35 دقيقة 40٪ -98٪، 35-50 دقيقة 98٪، 50- 51 دقيقة 98٪ -5٪، 51-65 دقيقة 5٪. شروط (ب):معدل التدفق 0.1 مل / دقيقة. نسبة الميثانول، 0-2 دقيقة 5٪، 2-5 دقيقة 5٪ -25٪، 5-35 دقيقة 25٪ -40٪، 35-40 دقيقة 40٪ -98٪، 40-55 دقيقة 98٪، 55- 56 دقيقة 98٪ -5٪، 56-70 دقيقة 5٪. كانت درجة الحرارة لكلا العمودين 20 درجة مئوية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54402/54402fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54402/54402fig2.jpg" /> الشكل 2: ممثل النتائج لتحليل العضلات الخام من T. rubripes (أ) النموذجية الاستشرابية الحالية الكلي أيون والطيف الكتلي. (ب) النظرية وقياس الجماهير monoisotopic من المنتجات PCR-RFLP المستمدة من القالب الحمض النووي توليفها من T. rubripes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54402/54402fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض كبيرة</a><html> نسخة ص من هذا الرقم. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/54402/54402fig3.jpg" /> الرقم 3: اختبار الاستقرار إستفتاء amplicons المستمدة من الحمض النووي الاصطناعي من T. وقد تم تحليل ذهبية العيون كل 10 ساعة. لم يتم تنفيذ معايرة الجماعية أثناء الاختبار. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54402/54402fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم </td><td> تسلسل </td></tr><tr><td> lago86F </td><td> 5&#39;-CCATGTGGAATGAAAACACC-3&#39; </td></tr><tr><td> taki114F </td><td> 5&#39;-AAAAACAAGAGCCACAGCTCTAA-3&#39; </td></tr><tr><td> fugu86-114R </td><td> 5&#39;-CCCTAGGGTAACTCGGTTCG-3&#39; </td></tr></tbody></table>ether.within الصفحات = &quot;1&quot;&gt; الجدول 1: PCR الاشعال. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> PCR الكاشف </td><td> حجم استخدامها </td><td> التركيز النهائي </td></tr><tr><td> المياه Ultrapurified </td><td> 15.75 ميكرولتر </td><td></td></tr><tr><td> خالية من المنظفات 5X العازلة </td><td> 5.0 ميكرولتر </td><td> 1X </td></tr><tr><td> مزيج dNTP (10 ملم لكل منهما) </td><td> 0.5 ميكرولتر </td><td> 0.2 ملم </td></tr><tr><td> مزيج التمهيدي (10 ميكرومتر كل من lago86F، taki114F وfugu86-114R في TE العازلة درجة الحموضة 8.0) </td><td> 1.0 ميكرولتر </td><td> 0.4 ميكرومتر كل </td></tr><tr><td> الحمض النووي بوليميريز (2.5 وحدة / ميكرولتر) </td><td> 0.25 ميكرولتر </td><td> 0.1 وحدة / ميكرولتر </td></tr><tr><td> قالب الحمض النووي في TE العازلة درجة الحموضة 8.0 (5،0 حتي 10 نانوغرام / ميكرولتر لعينة المستخرجة، 0.2 ميكرومتر لالحمض النووي الاصطناعي كما تحكم إيجابية) </td><td> 2.5 ميكرولتر </td><td> 0.5-1.0 نز / ميكرولتر الحمض النووي المستخرج و 20 نانومتر لالحمض النووي الاصطناعي </td></tr><tr><td></td><td> مجموع: 25 ميكرولتر </td><td></td></tr></tbody></table> الجدول 2: مكونات نطاق 25 ميكرولتر PCR. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> دورة </td><td> شرط </td><td> وظيفة </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 دقيقة في 95 ° C </td><td> تمسخ الأولي </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 30 ثانية في 95 درجة مئوية </td><td> تمسخ </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 30 ثانية في 56 درجة مئوية </td><td> الصلب </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 30 ثانية في 72 درجة مئوية </td><td> استطالة </td></tr><tr><td> 5 </td><td> كرر 2-4 (تماما 30 دورات) </td><td></td></tr><tr><td> 6 </td><td> 7 دقيقة في 72 ° C </td><td> الاستطالة النهائية </td></tr><tr><td> 7 </td><td> عقد في 12 درجة مئوية حتى إزالة عينة </td><td></td></tr></tbody></table> الجدول 3: برنامج PCR. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td rowspan="2"> عدد الذروة في وقت الاحتفاظ 4،0-5،5 دقيقة </td><td colspan="2"> كتلة Monoisotopic الذروة الثالثة في مجموعة (دا) </td><td colspan="2"> كتلة Monoisotopic من الذروة الثانية في مجموعة (دا) </td><td rowspan="2"> الأنواع ينفوخية </td></tr><tr><td> حبلا أصغر </td><td> حبلا أكبر </td><td> حبلا أصغر </td><td> حبلا أكبر </td></tr><tr><td rowspan="5"> 2 </td><td rowspan="5"> → </td><td rowspan="5"> → </td><td> 15890،707 حتي 15890،803 </td><td> 16177،531 حتي 16177،629 </td><td> L. العزلاء </td></tr><tr><td> 15921،702 حتي 15921،797 </td><td> 16146،537 حتي 16146،634 </td><td> L. gloveri </td></tr><tr><td> 15930،713 حتي 15930،809 </td><td> 16137،525 حتي 16137،622 </td><td> lunaris L. </td></tr><tr><td> 15937،697 حتي 15937،792 </td><td> 16131،537 حتي 16131،634 </td><td> L. wheeleri </td></tr><tr><td> 24173،034 حتي 24173،179 </td><td> 24566،905 حتي 24567،053 </td><td> ذهبية العيون T. </td></tr><tr><td rowspan="6"> 3 </td><td rowspan="2"> 16295،706 حتي 16295،804 </td><td rowspan="2"> 16467،610 حتي 16467،709 </td><td> 11341،851 حتي 11341،919 </td><td> 11466،875 حتي 11466،944 </td><td> T. pardalis T. snyderi T. ocellatus T. xanthopterus T. stictonotus </td></tr><tr><td> 11654،908 حتي 11654،978 </td><td> 11770،920 حتي 11770،991 </td><td> niphobles T. </td></tr><tr><td> 16296،701 حتي 16296،799 </td><td> 16468،605 حتي 16468،704 </td><td> → </td><td> → </td><td> rubripes T. </td></tr><tr><td> 16311،701 حتي 16311،799 </td><td> 16452،610 حتي 16452،709 </td><td> → </td><td> → </td><td> T. poecilonotus T. exascurus </td></tr><tr><td> 16320،713 حتي 16320،811 </td><td> 16443،599 حتي 16443،697 </td><td> → </td><td> → </td><td> T. porphyreus T. obscurus </td></tr><tr><td> 16599،751 حتي 16599،851 </td><td> 16780،667 حتي 16780،767 </td><td> → </td><td> → </td><td> T. الدويدية </td></tr></tbody></table> الجدول 4: تمايز ينفوخية من الجماهير monoisotopic المستمدة من LC / ESI-MS. <img alt="الجدول 5" src="/files/ftp_upload/54402/54402tbl5.jpg" /> الجدول 5: تضخيم تسلسل الحمض النووي (أ) تسلسل مطابق ل.أن الأنواع ينفوخية أخرى كما هو موضح في الجدول رقم (4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54402/54402tbl5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry at JoVE.

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

يوصف سلسلة البلمرة تحسين طريقة طول تفاعل تقييد جزء تعدد الأشكال عن التنميط الجيني الأنواع ينفوخية من السائل اللوني / الكتلة الطيفي. ويعمل عكس المرحلة العمود السيليكا متراصة لفصل amplicons هضمها. هذه الطريقة أن توضح للجماهير monoisotopic من أليغنوكليوتيد]، وهو أمر مفيد لتحديد تكوين قاعدة.

تحسين تفاعل البلمرة المتسلسل-تقييد جزء طول تعدد الأشكال الجيني من ينفوخية السامة من قبل اللوني السائل / قياس الطيف الكتلي

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

مستحلب T7 الحمض النووي الريبي البلمرة بوساطة مولتيجين نظام التعبير، بمغس

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

High-resolution Melting PCR for Complement Receptor 1 Length Polymorphism Genotyping: An Innovative Tool for Alzheimer's Disease Gene Susceptibility Assessment

عالية الدقة ذوبان ير ل تكمل مستقبلات 1 طول تعدد الأشكال التنميط الجيني: أداة مبتكرة لمرض الزهايمر الجينات تقييم القابلية

Complement receptor 1 (CR1), a transmembrane glycoprotein that plays a key role in the innate immune system, is expressed on many cell types, but ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

كشف شبه كمي النشاط المعتمدة على الحمض النووي الريبي بوليميراز الحمض النووي الريبي للبروتين البشري Telomerase المنتسخة العكسية

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene

أسلوب لدراسة تعدد الأشكال C924T الجينات مستقبلات A2 ثرومبوكاني

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

الجينات المرشح الاختبار في الدراسات الفوجية السريرية مع التنميط متعدد والطيف الكتلي

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

التضخيم من القرب من كامل طول فيروس نقص المناعة البشرية-1 بروفيروسيس للجيل التالي التسلسل

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

استخراج الحمض النووي الفائق والتنميط 3dpf الزرد يرقات بالقطع Fin

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

قطره واحدة رقمي البلمرة المتسلسل لكشف شامل ومتزامن من الطفرات في المناطق الساخنة

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

تحديد الأحداث جزئ مثلى في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس باستخدام النشاف الجنوبي وتفاعل البوليميراز المتسلسل

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

تقييم تفاعل البلمره المتسلسل المتداخل العالمي للكشف عن فيروسات الليسايسيس

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...