Name: improved polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism genotyping of toxic pufferfish by liquid chromatography/mass spectrometry
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry at JoVE.

This work was supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research by the Japanese Society for the Promotion of Science (15K08060).

1. DNA Extraction Merk: Bruk et eget rom for DNA-ekstraksjon og post-PCR undersøkelser som gel elektroforese og LC / ESI-MS. Legg etanol til vaskebuffer 1 (inneholdende guanidin-hydroklorid) og vaskebuffer 2 (ikke inneholdende guanidin-hydroklorid) i henhold til DNA-ekstraksjon settprotokollen. Fiskeprøver ble tatt fra fisk grossister og personkundemarkedet i Japan. <ol><li> Plasser 30-50 mg av fisk vev i et 0,5 ml eller 1,5 ml mikrosentrifugerør. Squash vev ved hjelp av en mikro-spatel (unntatt for fin og hud). Merk: I tilfelle av fin, bruker en 0,5 ml tube for soaking. </li><li> Legg 180 pl av lyseringsbuffer og 40 ul proteinase K og vortex kort. Inkuber ved 56 ° C på et blokkvarmer i 2 timer eller over natten. Bland ved kort å virvle hvert 15. minutt i løpet av inkuberingen. Merk: Komplett lyse er ikke nødvendig. </li><li> Sentrifuger i 5 min ved 13000 x g. Etter sentrifugering, hvis en liten amount av olje som finnes på overflaten i tilfelle av en fettprøve, slik som leveren, kast den. Overfør supernatanten til et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør. </li><li> Tilsett 200 ul av den kaotropiske buffer inneholdende guanidin-hydroklorid, og bland ved virvling. Tilsett 200 ul etanol (99,5%) og blanding ved å virvle igjen. </li><li> Overfør blandingen i spinnkolonne plassert i en 2 ml oppsamlingsrør. Sentrifuger i 1 min ved 13 000 x g. Kast gjennomstrømnings. Forsiktig: Ikke legg blekemiddel til avfall fordi guanidin kan danne svært reaktive forbindelser med blekemiddel. </li><li> Legg 500 ul av vaskebuffer 1 (inneholdende guanidin-hydroklorid) og sentrifuger i 1 min ved 13 000 x g. Kast strømmen gjennom og oppsamlingsrøret. </li><li> Plasser spinnkolonne i en ny 2 ml oppsamlingsrør levert med kittet. Legg 500 ul av vaskebuffer 2 og sentrifuger i 3 minutter ved 20 000 x g. Kast gjennomstrømnings og oppsamlingsrøret. Overfør spinnkolonne til en ny1,5 ml mikro tube. </li><li> Pipetter 200 pl elueringsbuffer til midten av spinnkolonne membranen. Etter 1 min, sentrifuger i 1 min ved 6000 x g. </li><li> Pipetter 50 ul av eluatet til en engangs UV-kyvette og måle UV-spektrum av eluatet ved 220-300 nm og absorbansen ved 260 nm ved anvendelse av et spektrofotometer. </li><li> Verifisere UV-spektrum av DNA med toppen ved 260 nm. Beregn den omtrentlige DNA-konsentrasjon ved hjelp av den enkle ligning &quot;DNA-konsentrasjon (ng / mL) = absorbans ved 260 nm x 50&quot;. Merk: konsentrasjon Typisk DNA ekstrahert fra finnene pufferfish er 63 ± 30 ng / mL (n = 20). </li><li> Dersom DNA-konsentrasjonen er høyere enn 10 ng / mL, fortynnet DNA-prøvene med Tris-EDTA (TE) buffer (pH 8) til 5 ng / mL. </li><li> Oppbevar prøven ved -20 ° C eller fortsett til PCR-amplifikasjon (seksjon 2). </li></ol> 2. PCR <ol><li> Sett opp 25 mL PCR for hver extrhandlet DNA-prøve, positiv kontroll (0,2 uM syntetiserte oligonukleotid med target-sekvensen i TE-buffer pH 8,0) og negativ kontroll (ultrapurified vann i stedet for DNA-prøve) på is i henhold til tabell 1 og 2 på en ren benk for å unngå forurensning. Merk: For enkel betjening, gjør tilstrekkelig mengde cocktail som inneholder alle reagenser uten templat-DNA og dispensere det. Bruke DNA-polymerase som har korrektur aktivitet for å unngå tilsetning av 3 &#39;A-overheng for å PCR-produktet. </li><li> Utføre PCR-amplifikasjon på en termosykler ved hjelp av syklusprogrammet vist i tabell 3. </li></ol> 3. Enzymatisk Fordøyelse <ol><li> Tilsett 2 ul av løsningen inneholdende 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol og 500 mM NaCl til PCR-løsning. </li><li> Tilsett 1 pl av hvert restriksjonsenzym (Dral og MSP I) og bland forsiktig. Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C på thermal cycler. </li><li> Inkuber i 5 min ved 72 ° C for å aktivere gjenværende DNA-polymerase, som fyller klebrig ende som genereres av MSP I. </li><li> Valgfritt: Analyser hver 2.5 ul av reaksjonsløsningen ved polyakrylamidgelelektroforese ved anvendelse av en kryss kobling forhold (% C, andel av bisakrylamid) på 3,33 (vekt%) og en polyakrylamid-gel-konsentrasjon (% T) 15 (% w / v) 38. Stain gelen ved hjelp av fluorescerende DNA flekken og observere dobbel tråd DNA på et blått lys transilluminator ved hjelp av et gult skjermen. </li><li> Filtrer reaksjonsoppløsningen med en 0,2-0,5 um sentrifugal-filteranordning for å hindre tilstopping, noe som ville skade den analytiske kolonnen. </li><li> Overfør filtratet til en konisk polypropylen-hetteglass og oppbevar ved -20 ° C inntil analyse. </li></ol> 4. LC / ESI-MS analyse <ol><li> Veie 67,2 g (ca. 42 ml) av HFIP og 1,52 g (ca. 2,0 ml) av TEA i en 1-liters flaske. Legg 955 ml ultrapurified vann (LC / MS grade) og rør ved hjelp av en magnetrører inntil reagensene er fullstendig oppløst. Ta en alikvot av løsningen, og kontroller pH (mellom 7,85 og 7,95, ideelt pH = 7,9) ved anvendelse av et pH-meter. Merk: Ikke returner delmengde til flasken for å unngå forurensning av metallioner. Dersom pH ikke er 7,9, tilsette en liten mengde av enten HFIP eller TEA for å justere pH og måling av pH-verdien på nytt. </li><li> Koble flasken til linje A på væskekromatograf med avkjøling av flasken ved hjelp av en bærbar direkte kjøling kjøleskap (for husholdningsbruk) for å forhindre fordampning. Koble en annen flaske fylt med metanol til linje B. </li><li> Koble beskyttelseskolonne og analytisk kolonne (2,0 x 50 mm, mesoporøs size = 30 nm) til den væskekromatograf. Strømme det første mobile fase (95% A, 5% B) for å ekvilibrere kolonnene. </li><li> Fremstille 0,5 mg / ml natrium-trifluoracetat (pH 3,5) som en kalibrerings 39. <ol><li> Veie 50 mg (ca. 34 mL) av tri acid i et beger. </li><li> Tilsett 30 ml ultrapurified vann og titrere til pH 3,5 med 10 mM natrium-hydroksyd ved hjelp av et pH-meter. </li><li> Fyll opp til 50 ml med ultrapurified vann. Tilsett 50 ml acetonitril (LC / MS grade) og bland. </li><li> Ta en del av arbeidsoppløsningen og lagre det ved romtemperatur. Lagre resten av løsningen ved 4 ° C. </li></ol></li><li> Redusere nitrogentrykk på den C-felle som følger. Merk: Recent Fourier transform massespektrometrene som er egnet for intakt protein analyse, har kontroll programvare for å kontrollere trykket. <ol><li> Ta av til venstre toppdeksel massespektrometer. C-fellen ventilen er på hjørnet av til venstre i forgrunnen. </li><li> Sjekk høyt vakuum trykkverdi i instrumentstatusvinduet i kontrollprogramvare. Merk: Verdien er typisk, 3 x 10 -8 bar. </li><li> Trekk knotten for å låse opp og vri på bryteren mot klokken veldig sakte for å redusere høyt vakuum trykkure til 1/3 (vanligvis 1 x 10 -8 bar). Den indikerte Trykket bør endres gradvis i en forsinket måte. Ignorer advarselen om lavt trykk. Trykk på knappen for å låse. </li><li> Gjenopprett toppdekselet for sikkerhet. </li></ol></li><li> Kalibrere massespektrometer med natrium trifluoroacetate 39. Merk: Daglig masse kalibrering kan erstattes av denne protokollen, men det anbefales kalibrering foreslått av produsenten burde vært gjennomført før denne kalibreringen. <ol><li> Sett skanneparametre og oppvarmede ESI kilde parametere i instrumentet kontrollboks for tuning programvaren som følger: skannetype i full MS; scan range m / z 500-4,000; fragmentering (in-kilde kollisjon indusert dissosiasjon (CID) spenning 60 eV, polaritet negative; automatisk styrkekontroll (AGC) målrette 1 x 10 6, maksimum injisere tid 50 msek, skjede gass strømningshastighet 5; aux gass strømningshastighet 0; feie gass strømningshastighet 0; spray spenning 3 kV, kapillær temperatur 320 ° C; S-objektiv radiofrekvens (RF) nivå 100; varmeapparat temperatur 30 ° C. <ol><li> Input listen over negative ioner for å bli overvåket som m / z 792,85908, 1064,80870, 1336,75832, 1608,70794, 1880,65755, 2152,60717, 2424,55679, 2696,50640, 2968,45602, 3376,38045. </li></ol></li><li> Bevege den oppvarmede ESI sonden nærmere grensesnittet av massespektrometer (stilling B). Koble sonden og en sprøyte med et rør. </li><li> Sette mot kalibrerings konstant ved en strømningshastighet på 10 ul / min ved anvendelse av det innebygde sprøytepumpe. Sjekk bare de 6 nedre masseioner (m / z 792,85908 til 2152,60717) i den tilpassede kalibreringstabellen. <ol><li> Fortsett med kalibrering etter intensiteten av signalene er stabilisert. Etter kalibrering, sjekk bare de seks høyere masseioner (m / z 1880,65755 til 3376,38045) og fortsett med kalibrering. Unngå kalibrering ved hjelp av alle ionene samtidig for å unngå svikt. </li></ol></li></ol></li><li> Flytt sonden til appropriate posisjon for en strømningshastighet på 0,4 ml / min (stilling D) og kobles til den væskekromatograf med en inert metallrør. </li><li> Sett de oppvarmede ESI kilde parametere i instrumentet kontrollboks for tuning programvaren som følger: skjede gass strømningshastighet 50; aux gasstrømningshastigheten 15; feie gasstrømningshastigheten 1; spray spenning 2,5 kV; kapillær temperatur 350 ° C; S-objektiv RF nivå 100; varmeapparat temperatur 350 ° C. </li><li> Sett oppkjøp parametre av massespektrometer i instrumental oppsettvinduet som følger: metode varighet 8 min; avlede ventil, 3,5-6 min til massespektrometer, 0 til 3,5 og 6-8 min til avfall; runtime 3,5 til 6 min; polaritet negative; i kilde CID spenning 15,0 eV; microscans 3; nominell oppløsning strøm (ved m / z 200) 140 000; AGC mål 1 x 10 6; maksimal ion tid 50 ms; antall skanninger 1; scan range m / z 700-3,500; spektrum datatype profil. </li><li> Sett parametre i flytende kromatograf som følger: kolonne ovn temperatur 20 ° C; sample skuffen temperatur 10 ° C; gradient program 0-0,5 min 5% B, 0,5-1 min 5-30% B, 1-3,5 min 30-40% B, 3,5 til 5 min 40-98% B, 5-6 min 98% B, 6- 6.05 min 98-5% B, 6,05 til 8 min 5% B; strømningshastighet 0,4 ml / min. </li><li> Purge bobler ved å trykke på bunnen av hetteglassene. Sett prøverør på prøven rack og injisere 1,0 mL av en prøve ved hjelp av autosampler å starte analysen. </li><li> Åpne rådatafiler med nettleser og bekrefter at alle oppkjøpene er vellykket ferdig, inkludert de positive og negative kontroller. Merk: Vanligvis vil to eller tre topper observeres i den totale ionestrøm kromatogrammet ved en retensjonstid på 4 til 5,5 min når pufferfish DNA er vellykket amplifisert og spaltet. </li></ol> 5. Deconvolution og tolkning <ol><li> Start deconvolution programvare. Velg eksperiment type &quot;auto-ekstrakt (isotopically løst)&quot;. </li><li> Redigere en metode ved hjelp av følgende parametere: utgangsmasse M; S / N threshold 3, relative overflod terskel 0; negativ ladning ja; beregne hentet ion nåværende kromatogram (XIC) ja, m / z utvalg 700-3,500; lade carrier H +; minimum antall oppdaget kostnad 3; isotop-forhold nucleotide; fit faktor 80%; Resten terskel 0%; vurdere overlapp ja; lade range 3-50; minimum intensitet 1; forventet intensitet feil tre. <ol><li> Lagre som en ny metode, og velg den. </li></ol></li><li> Velg katalogen der eksisterer rå datafiler. Velg rådatafiler som skal analyseres, og klikk &quot;Legg til i kø&quot; -knappen. </li><li> Klikk &quot;Kjør&quot; -knappen på fanen &quot;Kjør Kø &#39;for å starte deconvolution. </li><li> Etter køen er fullført, velger en rad og klikk &#39;Open Resultat &quot;i øvre bildeteksten for å få resultatene av deconvolution. </li><li> Tolke resultatene fra de monoisotopic massene avledet fra toppene på en retensjonstid på 4-5.5 min ved hjelp av tabell 4. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

For å ekstrahere DNA, er et kommersielt sett for å ekstrahere DNA fra blod og vev som brukes i henhold til protokollen fra produsenten med mindre modifiseringer (mengde av proteinase K og sentrifugering av lysis løsning). Imidlertid kan en hvilken som helst ekstraksjon kit benyttes så lenge som cellulært DNA kan ekstraheres med passende utvinning og renhet for PCR. Denne fremgangsmåten har blitt testet ved hjelp av muskler, finnen, lever, ovarie, og hud 37. Fin er spesielt egnet på grunn av det store arealet, noe som muliggjør rask lysis med proteinase K. fersk, frossen, tørket, kokt og bakt Pufferfish prøver ble testet med hell 37. PCR primersett (tabell 1) er utformet for pufferfish og forsterker den mitokondrielle 16S ribosomal RNA genet av pufferfish. Mål-DNA for å forsterke er 114-115 bp (genus Takifugu) og 86 bp (genus Lagocephalus) (tabell 5). For å lette metoden development, ble syntetisert oligonukleotider som har de målsekvenser som brukes for referanse i stedet for å samle autentiske Pufferfish prøver. Den primersett kan erstattes av en annen primer angitt i respons til formålet, men endelige DNA-lengde etter enzymatisk spaltning bør være mindre enn 100 nt når det gjelder å opprettholde kvaliteten av massespekteret som kreves for vellykket dekonvolvering. I tillegg bør nitrogentrykk i den C-felle reduseres når målet oligonukleotidet er lengre enn 75 nt, og kvaliteten på massespekteret er utilstrekkelig for vellykket dekonvolvering. Slike begrensninger kan styres via den senere tids utvikling i instrument-programvare, ellers ventilen for den C-fellen inne i selve kabinettet må innstilles som beskrevet i fremgangs delen. Som for prøveopparbeidelse, er bruk av vaskemiddel frie reagenser kritisk for den påfølgende LC i form av passende topp form, tilstrekkelig peak intensitet og stabil oppholdstid 31. 21,24-33, en C-18 revers-fase partikkelformig silikakolonne 23,40,41 og en hydrofob interaksjonskromatografi (HILIC) kolonne 42 er blitt anvendt for LC / ESI-MS analyse av oligonukleotider. Blant dem er det kapillære monolitten kolonnen overlegne i forhold til de andre i form av separasjonskapasiteten, men det kapillær monolitten kolonnen som brukes i tidligere studier ble gjort i huset og drevet ved en lav strømningshastighet (2 mL / min), noe som krever instrumentering dedikert til micro LC. For å lette enkel betjening, ble kommersielt tilgjengelige kolonner evaluert for separasjon av lange oligonukleotider ved høyere strømningshastigheter (100 til 400 ul / min). Tre par av DNA-duplekser (26, 37 og 53 bp) ble separert ved anvendelse av de ovennevnte kolonner, imidlertid syklustider på C-18-bundet partikkelformig silikakolonne og PS-DVB monolitten kolonne var 65 og 70 min, respektivt , mens det av den C- <sub&gt; 18-bundet silika monokolonne var 8 min (figur 1). Tar rask analyse i betraktning, ble den C-18-bundet silika monokolonne valgt for vårt formål til tross for den begrensede separasjonskapasiteten; men de gjenværende to kolonner kan anvendes når forbedret separasjon er påkrevd. Teoretisk sett, i tilfelle av en monokolonne, er det ingen mellomliggende volum, og den mobile fase vil bli tvunget til å strømme gjennom porene i den faste fase og samtidig opprettholde en konsistent banelengde, og dermed muliggjør en effektiv separering 27. Slike prosesser vil bli åpenbart, spesielt i analyse av biomacromolecules slik som et oligonukleotid, som den langsomme diffusjon av de store molekyler. En av de praktiske fordelene ved et monolitt kolonne er at det mottrykk er lavere enn den til en partikkelformet silikakolonne 27. Til tross for den høye strømningshastighet (400 ul / min) og lav kolonnetemperatur (20 ° C), maks mottrykk avSystemet var 12,5 MPa 37. Dette er den første demonstrasjon av fordelen av en C-18-bundet silika monokolonne for hurtig analyse av en lang oligonukleotid. På grunn av den høye strømningshastighet, er en dedikert instrument for mikro LC og presis justering ved grenseflaten ikke er nødvendig. I stedet er en oppvarmet ESI sonde er nødvendig for å dissosiere DNA-dupleks og hjelpe til ionisering av DNA som beskrevet senere. Ionepar-kromatografi er vanligvis brukes for MS-kompatible separasjon av oligonukleotider. Imidlertid kan en ione-par-reagens generelt forstyrrer ESI prosessen og reduserer følsomheten av ESI-MS. Derfor er HFIP ofte brukt for den mobile fasen for å forbedre følsomheten av oligonukleotidet. Imidlertid HFIP (kokepunkt 59 ° C) fordamper hurtig ved grenseflaten før metanol (kokepunkt 65 ° C), og derfor dette tapet av oppløsningsmiddel øker pH og fremmer dissosiasjon av ione-par-reagens (dvs. TEA)fra oligonukleotidet. Fordi den foreliggende fremgangsmåte anvender en oppvarmet ESI sonde, som nebulizes eluatet med varm nitrogengass ved 350 ° C, kan denne effekten understrekes sterkt nok. I stedet for HFIP-TEA buffer, Erb og Oberacher anbefales cyclohexyldimethylammonium acetat (CycHDMAA, pH 8,4) for genotyping analyse på grunn av en reduksjon i adduktdannelse med spormetallioner 33. Forfatterne sluttet at CycHDMAA seg undertrykket dannelsen av metall adduktet. Til tross for den litteratur, har betydelig adduktdannelse ikke blitt observert i den foreliggende fremgangsmåte. Dessuten er det bemerkelsesverdig fordel for HFIP-TEA-metanol system at topparealet oppnådd med HFIP-TEA-metanol system var 17 ganger større enn det som ble oppnådd fra den CycHDMAA-acetonitril-system for å analysere en 86 bp fragment av T. poecilonotus (data ikke vist). En ulempe ved de HFIP-TEA-metanol system, er imidlertid den økte kostnaden i forhold til den CycHDMAA-acetonitril-system. Beregning av monoisotopic massen krever separasjon av isotoper toppene formere ladede ioner. Derfor er oppløsning kritisk for den foreliggende analyse. Selv om nødvendig oppløsning strømmen er avhengig av basepar lengde av analytten, konvensjonelle TOF analysatorer, som har en oppløsning kraft på flere titalls tusen, kan være begrenset til analyse av korte oligonukleotider. De teoretiske monoisotopic massene er vist i tabell 4, ble beregnet ut fra den tilsvarende base sammensetninger av analytter. Alternativt Muddiman et al. Utviklet et program for å beregne basesammensetningen fra nøyaktig masse 43. Et lignende program ble integrert i automatiserte ESI-MS system 16-18. Bruken av disse algoritmene kan forbedre robustheten den nåværende metoden fordi en målt monoisotopic masse ikke alltid svarer til en unik base komposisjon ovinge til massen toleranse på 3 ppm som følge av den uunngåelige målefeil. Dessverre kunne vi ikke få tak i disse programvareprodukter for denne studien. Den foreliggende monoisotopic masse-basert bestemmelse art kan være egnet ikke bare for differensiering av pufferfish men også for påvisning av andre DNA-polymorfismer fordi den foreliggende fremgangsmåte er basert på analyse av basisblandingen og ikke involverer en prosedyre spesielt utformet for pufferfish. Når det gjelder påvisning av DNA-polymorfisme, er den dedikerte ESI-MS system helautomatisk og lett å betjene, noe som kan være egnet for diagnostisk anvendelse slik som påvisning av patogener 15,17,18,20,30. Omvendt er den foreliggende fremgangsmåte mulig med vanlige forskningsinstrumenter og apparater, og derfor egnet for forsknings- formål. ESI-MS har allerede blitt brukt til menneskelig DNA polymorfisme som enkeltnukleotidpolymorfi 13,28,32, kort tandem repetisjon 26Og mitokondrielle DNA analsis 16,19. Micro RNA ble også analysert via kapillær LC / ESI-MS 44. Disse publiserte søknader kan også realiseres ved den foreliggende fremgangsmåte. I tillegg kan denne metoden være egnet for overvåkning av interaksjon mellom oligonukleotid og lav-molekylvekt-forbindelser, såsom interaksjonen av antibiotika og ribosomalt RNA 45 på grunn av den lave temperatur separasjon. I slike tilfeller, oligonukleotider og lav-molekylvekt-forbindelser skal bli detektert samtidig, noe som er en fordel med å bruke LC / ESI-MS. Det er en begrensning at den instrumentering er ikke egnet for å utføre parallell analyse som i konvensjonelle teknikker som Sanger-sekvensering og real-time PCR. I tillegg identifiserer den foreliggende fremgangsmåte bare basesammensetning og enhver base substitusjon innenfor det samme molekyl kan ikke skilles fra hverandre. Imidlertid kan MS-baserte DNA-analyse er beskrevet her fortsatt har fortrinn på sikts av nøyaktighet i sammenligning med DNA-bindende fargestoffbaserte teknikker som gelelektroforese og real-time PCR.

Massespektrometri (MS) er en akseptert teknologi for rask og pålitelig identifikasjon av nukleinsyrer, matriks-assistert laserdesorpsjon / ionisering (MALDI) og elektrospray ionisering (ESI) som brukes for ionisering 1,2. Den MALDI teknikken er vanligvis kombinert med en time-of-flight (TOF) analysator; imidlertid er anvendelsen av MALDI-TOF-MS begrenset til korte oligonukleotider (~ 25 nukleotider (nt)) på grunn av det påfølgende fragmentering, adduktdannelse og lav ionisering effektivitet 1,2. I motsetning til dette er ESI gjelder for lengre oligonukleotider (&gt; 100 nt), men mange ladetilstander på multippel ladede ioner ([M-nH] n-) fremstilles samtidig fra biomacromolecules og dermed massen av analytten kan overstige den øvre grensen for m / z spekter av spektrometeret. Dette krever tolkning av korrugert spektra, dvs. omdanning av en ladetilstand serie til den tilsvarende massevia deconvolution. I tilfelle av massen måling av et lite molekyl, toppen av monoisotopic masse, det vil si, er massen av molekylet inneholdende bare den vanligste isotop av hvert element den mest tallrike og observert naturlig tre. Som de molekylære øker vekten, blir isotoper distribusjons skifter til høyere m / z og monoisotopic topp skjult av baseline støy 3-5. Når monoisotopic toppen lenger kan påvises for masser som er større enn 10 kDa 3, er den gjennomsnittlige molekylvekt som brukes for måling i stedet for monoisotopic massen 5. I slike tilfeller kan det isotop-fordeling hvor hver av de individuelle topper blir atskilt med en Da bare observeres når en høy oppløsningsmasse analysator slik som et TOF, en Fourier-transform modifisert Kingdon felle analysator 6, eller en Fourier-transformasjon ion syklotron resonans analysator er brukt for analyse. Imidlertid er den mest tallrike topp sometimes ikke forenlig med gjennomsnittlig molekylvekt 5. Disse problemene kan føre til problemer for nøyaktig bestemmelse av analytter. På grunn av variasjonen i den naturlige overflod av stabile isotoper og vanskelighetene i den bestemmer den midlere molekylvekt, er måling av monoisotopic massen ideell for masse karakterisering av biomolekyler 3,4. I praksis om en monoisotopic topp kan observeres eller ikke, den monoisotopic massen kan bli estimert ved å sammenligne mønsteret av den observerte isotopiske distribusjon til den teoretiske en beregnet fra en modell analytt 4,7-10. Beslaget algoritmen 8 er nå innlemmet i proprietær programvare. I sammenheng med ESI-MS, er dissosiasjon av en DNA-dupleks, rensing og avsalting som kreves for direkte måling for å unngå svikt i ionisering grunnet ion undertrykkelse og adduktdannelse 2,10-14. Disse prosedyrene er troublesome imidlertid helautomatisk analysesystemer er blitt utviklet kommersielt som omfatter polymerase kjedereaksjon (PCR), prøvepreparering og ESI-MS for påvisning av patogener 15-20. En annen tilnærming er å innføre væskekromatografi (LC) for separasjon. LC gir en on-line separasjon av analytter i kjøl stoffer og krever ikke en arbeidskrevende prøvepreparering før ioniseringshodet 21,22. Imidlertid er separasjonen av nukleinsyrer ved hjelp av en MS-kompatibel mobil fase vanskeligere enn for de fleste andre forbindelser, så som medikamenter, peptider og proteiner på grunn av den polyanioniske art av nukleotidene. De mest vellykkede eksemplene på LC / ESI-MS involverer bruk av ione-par omvendt-fase LC. En mobil fase av 1,1,1,3,3,3-heksafluor-2-propanol (HFIP) -triethylamine (TEA) -metanol ble opprinnelig foreslått av Apffel et al. For separering og detektering av korte oligonukleotider 23. Bruk av LC / ESI-MS genotyping for differentiation av patogene arter, enkelt-nukleotid polymorfismer og korte tandemrepetisjoner er rapportert ved bruk av en kapillær polymer-monolitt kolonne som kan skille lengre oligonukleotider 1,21,24-33. I Japan og USA, har alvorlig matforgiftning oppstått på grunn av feilidentifisering og upassende utarbeidelse av pufferfish, og dette er til tross for at fordelingen og utarbeidelse av pufferfish er strengt kontrollert av mat sikkerhetslovgivningen 34,35. Videre en tilsiktet mord ved hjelp pufferfish ekstrakt skjedde i Japan 36. Derfor er differensiering av Pufferfish arter kreves fra både folkehelsen og rettsmedisinske etterforsknings standpunkter. I tillegg, fordi Takifugu rubripes er langt dyrere enn andre typer pufferfish, en differensiering kapasitet er også nødvendig i sammenheng med mat svindel undersøkelser. Her er en detaljert fremgangsmåte for å bestemme monoisotopic masse av et PCR-produkt ved LC / ESI-MS ved anvendelse av en revers-fase silika-kolonne og monolitt en høy oppløsning massespektrometer beskrives. Nærmere bestemt, har tilnærmingen er utviklet for å muliggjøre differensiering av toksiske Pufferfish arter basert på bruk av PCR rflp (RFLP) metode 37, som er det første eksempel på arter differensiering av dyr ved hjelp av MS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="742">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">DNeasy Blood &#38; Tissue Kit (50)</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:107px;">69504</td>
			<td style="width:272px;">DNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:107px;">19131</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Ethanol (99.5+ vol%)</td>
			<td style="width:147px;">Wako</td>
			<td style="width:107px;">054-07225</td>
			<td style="width:272px;">For dilution of wash buffers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">TE buffer (pH 8.0)</td>
			<td style="width:147px;">Wako</td>
			<td style="width:107px;">310-90023</td>
			<td style="width:272px;">For dilution of DNA sample</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">PCR primer</td>
			<td style="width:147px;">Fasmac</td>
			<td style="width:107px;">NA</td>
			<td style="width:272px;">Purified with reverse-phase cartridge column by the supplier</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Template DNA</td>
			<td style="width:147px;">Eurofins Genomics</td>
			<td style="width:107px;">NA</td>
			<td style="width:272px;">Purified by HPLC by the supplier</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Ultrapurified water</td>
			<td style="width:147px;">NA</td>
			<td style="width:107px;">NA</td>
			<td style="width:272px;">Generated with a Milli-Q Direct water purification system (Merck Millipore), used for sample preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Detergent Free 5X Phusion HF Buffer</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:107px;">F-520L</td>
			<td style="width:272px;">Use instead of the provided buffer of DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Pfu-X DNA polymerase</td>
			<td style="width:147px;">Jena Bioscience</td>
			<td style="width:107px;">PCR-207S</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">dNTP mix (20 mM each)</td>
			<td style="width:147px;">Jena Bioscience</td>
			<td style="width:107px;">NA</td>
			<td style="width:272px;">Supplied with the DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:216px;">10&#215; Universal buffer M</td>
			<td style="width:147px;">Takara Bio</td>
			<td style="width:107px;">NA</td>
			<td style="width:272px;">Containing 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol and 500 mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dra I</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:107px;">FD0224</td>
			<td style="width:272px;">Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Msp I</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:107px;">FD0544</td>
			<td style="width:272px;">Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP)</td>
			<td style="width:147px;">Fluka</td>
			<td style="width:107px;">42060-50ML</td>
			<td style="width:272px;">Eluent additive for LC-MS grade.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Triethylamine (TEA)</td>
			<td style="width:147px;">Fluka</td>
			<td style="width:107px;">65897-50ML</td>
			<td style="width:272px;">Eluent additive for LC-MS grade.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">T6508</td>
			<td style="width:272px;">For preparation of calibrant.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Sodium hydroxide (1.0 M)</td>
			<td style="width:147px;">Fluka</td>
			<td style="width:107px;">72082</td>
			<td style="width:272px;">Dilute to 10 mM with ultrapurified water and use for titration of trifluoroacetic acid.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:147px;">Fluka</td>
			<td style="width:107px;">34967</td>
			<td style="width:272px;">For preparation of calibrant, LC/MS grade.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:147px;">Kanto</td>
			<td style="width:107px;">25185-76</td>
			<td style="width:272px;">For mobile phase, LC/MS grade.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Water</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:107px;">W6-1</td>
			<td style="width:272px;">For mobile phase, LC/MS grade.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Microcentrifuge tube (0.5 ml)</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:107px;">0030123301</td>
			<td style="width:272px;">PCR clean grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Microcentrifuge tube (1.5 ml)</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:107px;">0030123328</td>
			<td style="width:272px;">PCR clean grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">UVette</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:107px;">0030106300</td>
			<td style="width:272px;">Disposable UV cuvette.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Gel Green</td>
			<td style="width:147px;">Biotium</td>
			<td style="width:107px;">41004</td>
			<td style="width:272px;">Fluorescent DNA stain</td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;width:216px;">Cosmospin filter G (0.2 &#956;m)</td>
			<td style="width:147px;">Nakalai Tesque</td>
			<td style="width:107px;">06549-44</td>
			<td style="width:272px;">Made of hydrophilic polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane. Any centrifugal filter unit (pore size, 0.2&#8211;0.5 &#956;m) made of hydrophilic PTFE or another low-binding membrane is applicable.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">300-&#956;l PP screw vial</td>
			<td style="width:147px;">American Chromatography Supplies</td>
			<td style="width:107px;">V0309P-1232</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Preassembled screw cap and septa</td>
			<td style="width:147px;">Finneran</td>
			<td style="width:107px;">5395-09R</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">Monobis C18 analytical column (2.0&#215;50 mm, mesopore size = 30 nm)</td>
			<td style="width:147px;">Kyoto Monotech</td>
			<td style="width:107px;">2050H30ODS</td>
			<td style="width:272px;">Outside Japan, available for purchase from GL Sciences via its distributors. (http://www.glsciences.com/distributors/)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Monobis C18 guard column</td>
			<td style="width:147px;">Kyoto Monotech</td>
			<td style="width:107px;">GCSET-ODS3210</td>
			<td style="width:272px;">Holder included.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Cadenza CW-C18 (3.0&#215;250 mm)</td>
			<td style="width:147px;">Imtakt</td>
			<td style="width:107px;">CW036</td>
			<td style="width:272px;">C18-bonded particulate silica column</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">ProSwift RP-4H (1.0&#215;250 mm)</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:107px;">066640</td>
			<td style="width:272px;">Poly(styrene-divinylbenzene) monolith column</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Themo Mixer C</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:107px;">5382 000.023</td>
			<td style="width:272px;">For digestion of fish tissues.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:147px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:107px;">UV-3150</td>
			<td style="width:272px;">Quantification of DNA concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Thermal cycler</td>
			<td style="width:147px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:107px;">T100</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Portable refrigerator</td>
			<td style="width:147px;">Twinbird</td>
			<td style="width:107px;">D-CUBE</td>
			<td style="width:272px;">For aqueous mobile phase to avoid evaporation of HFIP. This can be replaced by an ice box.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Ultimate 3000 liquid chromatograph</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:107px;">NA</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Q Exactive mass spectrometer</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:107px;">NA</td>
			<td style="width:272px;">Fourier transform mass spectrometer equipped with the modified Kingdon trap analyzer.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Protein deconvolution 3.0</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:107px;">NA</td>
			<td style="width:272px;">Use version 3.0 or higher having an isotopic patter model of nucleotide.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism genotyping of toxic pufferfish by liquid chromatography/mass spectrometry

En forbedret versjon av en polymerase kjedereaksjon (PCR) -restriction fragmentlengde-polymorfisme (RFLP) Fremgangsmåte for genotyping giftige Pufferfish art ved væskekromatografi / elektrospray ionisering-massespektrometri (LC / ESI-MS) er beskrevet. DNA-ekstraksjon blir utført ved anvendelse av en silika-membran-baserte DNA ekstraksjon kit. Etter at PCR-amplifikasjon ved bruk av en detergent-fri PCR-buffer, blir restriksjonsenzymer tilsatt til den løsning uten rensing av reaksjonsløsningen. En omvendt-fase silika-kolonne og monolitt en Fourier-transform med høy oppløsning massespektrometer med en modifisert Kingdon felle analysator anvendes for separasjon og deteksjon, respektivt. Den mobile fasen, bestående av 400 mM 1,1,1,3,3,3-heksafluor-2-propanol, 15 mM trietylamin (pH 7,9) og metanol blir levert ved en strømningshastighet på 0,4 ml / min. Syklustiden for LC / ESI-MS-analyse er 8 min inklusive ekvilibrering av kolonnen. Deconvolution programvare har en isotop distribusjonsmodell of oligonukleotidet blir brukt til å beregne den tilsvarende monoisotopic masse fra massespektrum. For analyse av oligonukleotider (spredning 26-79 nukleotider), masse nøyaktighet var 0,62 ± 0,74 ppm (n = 280) og utmerket nøyaktighet og presisjon ble opprettholdt i 180 timer uten bruk av en lås masse standard.

Tre kommersielt tilgjengelige kolonner ble evaluert for separasjon av lange oligonukleotider ved strømningshastigheter på 100 til 400 ul / min. En vid-poret oktadecyl-karbonkjede (C-18)-bundet partikkelformig silikakolonne (a), en kommersielt tilgjengelig poly (styren-divinylbenzen) (PS-DVB) monolitten kolonne (b) og en C-18-bundet silika monokolonne ( c) ble sammenlignet (figur 1). Tre par av DNA-duplekser (26, 37 og 53 bp) ble separert ved hjelp av alle kolonnene, og den C-18-bundet silika monokolonne ble anvendt i etterfølgende studier. Representative resultater for analyse av en DNA-prøve ekstraheres fra muskel av T. rubripes er vist i figur 2. Isotopisk oppløste topper, slik som vist i figur 2a, er nødvendig for å lykkes med å beregne monoisotopic masse. Den teoretiske og measfigurert monoisotopic masse av T. rubripes er vist i figur 2b. Fordi spaltning med endonukleaser er utført like etter PCR amplifikasjon uten rensing, er 3&#39;-klebrig ende som genereres av MSP I endonuklease fylt opp med det resterende DNA-polymerase. Ifølge analysen av amplikonene avledet fra de syntetiske DNA-templater, masse nøyaktighet varierte fra -2,48 til 2,40 ppm (0,62 ± 0,74 ppm i gjennomsnitt, n = 280). Således ble en masse toleranse på 3 ppm som brukes for å skille artene (tabell 4). Ved hjelp av tabellen, er alle de Pufferfish prøver tatt fra markeder og lagrer ble riktig differensiert som spesifikke arter 37. I henhold til den periodiske analyse av prøven oppnådd fra det syntetiske DNA-templat av T. chrysops, alle monoisotopic masser av analyttene ble vellykket bestemt innenfor ± 3 ppm for på least 180 hr uten masse kalibrering (figur 3). Dette betyr at massen kalibrering vil være nødvendig på en ukentlig basis. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/54402/54402fig1.jpg" /> Figur 1: Totale ionestrøm kromatogrammer av PCR-RFLP produkt avledet fra den syntetiserte DNA-templat av T. pardalis ved hjelp av en C-18-bundet partikkelformig silikakolonne (a, 3 x 250 mm, partikkelstørrelse 3 um), en poly (styren-divinylbenzen) (PS-DVB) monokolonne (b, 1,0 x 250 mm) og en C-18 -bundet monosilikakolonne (c, liggende fremgangsmåte) betingelser for (a).: strømningshastighet 0,2 ml / min; forhold mellom metanol, 0-2 min 5%, 2-5 min 5% -25%, 5-20 min 25% -40%, 20-35 min 40% -98%, 35-50 min 98%, 50- 51 min 98% -5%, 51-65 min 5%. Betingelser for (b):strømningshastighet 0,1 ml / min; forhold mellom metanol, 0-2 min 5%, 2-5 min 5% -25%, 5-35 min 25% -40%, 35-40 min 40% -98%, 40-55 min 98%, 55- 56 min 98% -5%, 56-70 min 5%. Temperaturen for begge kolonnene var 20 ° C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54402/54402fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54402/54402fig2.jpg" /> Figur 2: Representative resultater for analysering av rå muskel av T. rubripes. (a) Typiske total ion gjeldende kromatogrammene og massespektrum. (B) Teoretiske og målte monoisotopic masser av PCR-RFLP produkter avledet fra det syntetiserte DNA mal av T. rubripes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54402/54402fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se et stort</a>r versjon av denne figuren. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54402/54402fig3.jpg" /> Fig. 3: Stabilitetstest i samle amplikonene avledet fra den syntetiske DNA fra T. chrysops ble analysert hver 10 time. Mass kalibrering ble ikke utført i løpet av testen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54402/54402fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Navn </td><td> Sekvens </td></tr><tr><td> lago86F </td><td> 5&#39;-CCATGTGGAATGAAAACACC-3&#39; </td></tr><tr><td> taki114F </td><td> 5&#39;-AAAAACAAGAGCCACAGCTCTAA-3&#39; </td></tr><tr><td> fugu86-114R </td><td> 5&#39;-CCCTAGGGTAACTCGGTTCG-3&#39; </td></tr></tbody></table>Tabell 1: PCR primere. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> PCR reagens </td><td> volumet som </td><td> Sluttkonsentrasjon konsentrasjon~~POS=HEADCOMP </td></tr><tr><td> Ultrapurified vann </td><td> 15.75 mL </td><td></td></tr><tr><td> Vaskemiddel fritt 5x Buffer </td><td> 5,0 mL </td><td> 1x </td></tr><tr><td> dNTP mix (10 mM hver) </td><td> 0,5 ul </td><td> 0,2 mm </td></tr><tr><td> Primer blanding (10 mM hver av lago86F, taki114F og fugu86-114R i TE-buffer pH 8,0) </td><td> 1,0 mL </td><td> 0,4 pM hver </td></tr><tr><td> DNA polymerase (2,5 enhet / mikroliter) </td><td> 0,25 mL </td><td> 0,1 enhet / mikroliter </td></tr><tr><td> Mal DNA i TE-buffer pH 8,0 (5,0 til 10 ng / mL for ekstraherte prøven, 0,2 mikrometer for syntetisk DNA som positiv kontroll) </td><td> 2,5 mL </td><td> 0,5-1,0 ng / mL for ekstraherte DNA og 20 nM for syntetisk DNA </td></tr><tr><td></td><td> Totalt: 25 pl </td><td></td></tr></tbody></table> Tabell 2: komponenter i en 25 ul PCR målestokk. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Syklus </td><td> Betingelse </td><td> Funksjon </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 min ved 95 ° C </td><td> initial denaturering </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 30 s ved 95 ° C </td><td> denaturering </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 30 s ved 56 ° C </td><td> gløding </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 30 s ved 72 ° C </td><td> Forlengelse </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Gjenta 2-4 (totalt 30 sykluser) </td><td></td></tr><tr><td> 6 </td><td> 7 min ved 72 ° C </td><td> endelig Forlengelse </td></tr><tr><td> 7 </td><td> Hold ved 12 ° C inntil fjerning av prøven </td><td></td></tr></tbody></table> Tabell 3: PCR-programmet. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> Peak nummer ved retensjonstid på 4,0 til 5,5 min </td><td colspan="2"> Monoisotopic massen av det tredje topp i området (Da) </td><td colspan="2"> Monoisotopic massen av den andre topp i området (Da) </td><td rowspan="2"> pufferfish arter </td></tr><tr><td> mindre strand </td><td> større strand </td><td> mindre strand </td><td> større strand </td></tr><tr><td rowspan="5"> 2 </td><td rowspan="5"> → </td><td rowspan="5"> → </td><td> 15890,707 til 15890,803 </td><td> 16177,531 til 16177,629 </td><td> L. inermis </td></tr><tr><td> 15921,702 til 15921,797 </td><td> 16146,537 til 16146,634 </td><td> L. gloveri </td></tr><tr><td> 15930,713 til 15930,809 </td><td> 16137,525 til 16137,622 </td><td> L. Lunaris </td></tr><tr><td> 15937,697 til 15937,792 </td><td> 16131,537 til 16131,634 </td><td> L. wheeleri </td></tr><tr><td> 24173,034 til 24173,179 </td><td> 24566,905 til 24567,053 </td><td> T. chrysops </td></tr><tr><td rowspan="6"> 3 </td><td rowspan="2"> 16295,706 til 16295,804 </td><td rowspan="2"> 16467,610 til 16467,709 </td><td> 11341,851 til 11341,919 </td><td> 11466,875 til 11466,944 </td><td> T. pardalis T. snyderi T. ocellatus T. xanthopterus T. stictonotus </td></tr><tr><td> 11654,908 til 11654,978 </td><td> 11770,920 til 11770,991 </td><td> T. niphobles </td></tr><tr><td> 16296,701 til 16296,799 </td><td> 16468,605 til 16468,704 </td><td> → </td><td> → </td><td> T. rubripes </td></tr><tr><td> 16311,701 til 16311,799 </td><td> 16452,610 til 16452,709 </td><td> → </td><td> → </td><td> T. poecilonotus T. exascurus </td></tr><tr><td> 16320,713 til 16320,811 </td><td> 16443,599 til 16443,697 </td><td> → </td><td> → </td><td> T. porphyreus T. obscurus </td></tr><tr><td> 16599,751 til 16599,851 </td><td> 16780,667 til 16780,767 </td><td> → </td><td> → </td><td> T. vermicularis </td></tr></tbody></table> Tabell 4: Differensiering av pufferfish fra monoisotopic massene stammer fra LC / ESI-MS. <img alt="tabell 5" src="/files/ftp_upload/54402/54402tbl5.jpg" /> Tabell 5: amplifisert DNA-sekvens (a) sekvens er identisk med.at av de andre Pufferfish arter som er beskrevet i tabell 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54402/54402tbl5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry at JoVE.

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

En forbedret polymerasekjedereaksjon-rflp Fremgangsmåte for genotyping Pufferfish art ved væskekromatografi / massespektrometri er beskrevet. En omvendt-fase silika-kolonne monolitten anvendes for separering av fordøyd amplikoner. Denne metoden kan belyse monoisotopic massene av oligonukleotider, noe som er nyttig for å identifisere basesammensetning.

Forbedret Polymerase Chain Reaction-rflp Genotyping av Toxic Pufferfish ved væskekromatografi / massespektrometri

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Inducerbart T7 RNA Polymerase-mediert Multigen Expressions System, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

High-resolution Melting PCR for Complement Receptor 1 Length Polymorphism Genotyping: An Innovative Tool for Alzheimer's Disease Gene Susceptibility Assessment

Høyoppløselig smeltende PCR for komplementreceptor 1 Lengdepolymorfisme Genotyping: Et innovativt verktøy for Alzheimers sykdomssesmerksvurdering

Complement receptor 1 (CR1), a transmembrane glycoprotein that plays a key role in the innate immune system, is expressed on many cell types, but ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Semi kvantitative påvisning av RNA-avhengig RNA Polymerase aktivitet av menneskelig Telomerase revers transkriptase Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene

En metode for å studere C924T polymorfisme av Thromboxane A2 reseptor genet

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Kandidaten Gene Testing i klinisk Kohortstudier multiplex genotyperingteknologi og massespektrometri

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Forsterkning av nær full lengde HIV-1-Proviruses for neste generasjons sekvensering

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Høy gjennomstrømming DNA utvinning og genotyperingteknologi av 3dpf sebrafisk larver av Fin klipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Eneste dråpe digitale polymerasekjedereaksjons omfattende og samtidige deteksjon av mutasjoner i Hotspot regioner

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identifikasjon av homologe rekombinasjon hendelser i mus embryonale stamceller Southern Blotting og polymerasekjedereaksjons

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Evaluering av en Universal nestet omvendt transkripsjon polymerase Kjedere reaksjon for påvisning av Lyssaviruses

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...