Name: the visual colorimetric detection of multi-nucleotide polymorphisms on a pneumatic droplet manipulation platform
Uploaded: 2016-09-27T14:00:00
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Ministry of Science and Technology of Taiwan provided financial support of this research under contracts MOST-103-2221-E-002 -097 -MY3.

1. Verfahren zum Erkennen von MNP Hinweis: Dieser Abschnitt beschreibt das Verfahren, das MNP basierend auf der Hybridisierung vermittelte Wachstum von Gold-Nanopartikeln zu erkennen. <ol><li> Bereiten Sie die DNA-Sonde (5&#39;-Thiol-GAGCTGGTGGCGTAGGCAAG-3 &#39;) Lösung bei einer Konzentration von 100 uM. </li><li> Bereiten Sie die Sonde DNA-modifizierten AuNP (AuNP Sonde) Partikel. 21 Hinweis: Die Lautstärke hier hängt von der Anforderung der Sonde DNA-modifizierten AuNP (AuNP Sonde) Teil...

<ol>
	<li>Chorley, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+verification+of+functional+single+nucleotide+polymorphisms+in+regulatory+genomic+regions:+current+and+developing+technologies.">Discovery and verification of functional single nucleotide polymorphisms in regulatory genomic regions: current and developing technologies.</a> Mutat. Res. Rev. Mutat. 659 (1), 147-157 (2008).</li><li>Hinds, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+patterns+of+common+DNA+variation+in+three+human+populations.">Whole-genome patterns of common DNA variation in three human populations.</a> Science. 307 (5712), 1072-1079 (2005).</li><li>Rosenfeld, J. A., Malhotra, A. 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S., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet-driven+transports+on+superhydrophobic-patterned+surface+microfluidics.">Droplet-driven transports on superhydrophobic-patterned surface microfluidics.</a> Lab Chip. 11 (21), 3642-3648 (2011).</li><li>Huang, C. J., Fang, W. F., Ke, M. S., Chou, H. Y. E., Yang, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biocompatible+open-surface+droplet+manipulation+platform+for+detection+of+multi-nucleotide+polymorphism.">A biocompatible open-surface droplet manipulation platform for detection of multi-nucleotide polymorphism.</a> Lab Chip. 14 (12), 2057-2062 (2014).</li><li>Mirkin, C. A., Letsinger, R. L., Mucic, R. C., Storhoff, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA-based+method+for+rationally+assembling+nanoparticles+into+macroscopic+materials.">A DNA-based method for rationally assembling nanoparticles into macroscopic materials.</a> Nature. 382 (6592), 607-609 (1996).</li><li>Ichimura, K., Oh, S. K., Nakagawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-driven+motion+of+liquids+on+a+photo-responsive+surface.">Light-driven motion of liquids on a photo-responsive surface.</a> Science. 288 (5471), 1624-1626 (2000).</li><li>Jones, T. B., Gunji, M., Washizu, M., Feldman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dielectrophoretic+liquid+actuation+and+nanodroplet+formation.">Dielectrophoretic liquid actuation and nanodroplet formation.</a> J. Appl. Phys. 89 (2), 1441-1448 (2001).</li><li>Lee, J., Kim, C. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-tension-driven+microactuation+based+on+continuous+electrowetting.">Surface-tension-driven microactuation based on continuous electrowetting.</a> J. Microelectromech. S. 9 (2), 171-180 (2000).</li><li>Daniel, S., Chaudhury, M. K., De Gennes, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibration-actuated+drop+motion+on+surfaces+for+batch+microfluidic+processes.">Vibration-actuated drop motion on surfaces for batch microfluidic processes.</a> Langmuir. 21 (9), 4240-4248 (2005).</li><li>Darhuber, A. A., Valentino, J. P., Davis, J. M., Troian, S. M., Wagner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+actuation+by+modulation+of+surface+stresses.">Microfluidic actuation by modulation of surface stresses.</a> Appl. Phys. Lett. 82 (4), 657-659 (2003).</li></ol>

In diesem Protokoll zu erfassen ein einfaches kolorimetrisches Verfahren kann MNP bei Konzentrationen von 0,11 bis 0,50 &amp; mgr; M in Mikrozentrifugenröhrchen Bereich realisiert werden. Darüber hinaus ist die vorgeschlagen MNP Detektionsverfahren auf einem pneumatischen Tröpfchenmanipulationsplattform durchgeführt, die für die DNA-Screening und andere biomedizinische Anwendungen ein hohes Potential aufweist. In der Praxis hängt der detektierbare Bereich der Proben-DNA-Konzentration auf die Mischeffizienz der Bet...

Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP), die eine einzelne Basenpaarunterschied in einer DNA-Sequenz ist, ist eine der häufigsten genetischen Veränderungen. Aktuelle Studien berichten , dass SNPs mit Erkrankungsrisiko assoziiert sind, Wirksamkeit von Medikamenten und Nebenwirkungen von Individuen durch die Genfunktion zu beeinflussen. 1,2 Jüngste Studien zeigten auch , dass zwei- oder mehrPunktMutationen (Multi-nucleotide polymorphism) verursachen bestimmte Krankheiten und individuelle Unterschiede in den Auswirkungen der Krankheit. 3,4 der Nachweis von Nukleotid - Polymorphismus ist in prescreening Krankheit daher unerlässlich. Einfache und effiziente Verfahren zum schnellen Nachweis von sequenzspezifischen Oligonucleotide wurden in den letzten zwei Jahrzehnten hoch entwickelt. 1,5 Aktuelle Ansätze DNA Mutationen umfassen typischerweise Verfahren , einschließlich Sonde Immobilisierung, Fluoreszenzmarkierung, Gelelektrophorese, usw., zu identifizieren 6,7 aber diese Methoden erfordern in der Regel einen langen analytischen Prozess, Expensive Ausrüstung, gut ausgebildete Techniker und signifikanten Verbrauch von Proben und Reagenzien. Ein Nanopartikel mit einem großen Verhältnis von Oberfläche zu Volumen und einzigartigen physikalisch-chemischen Eigenschaften ist ein ideales Material als hochempfindliche und billige Detektionsplattform für spezifische Biomarker. Gold - Nanopartikel (AuNP) zur DNA - Detektion weit verbreitet wegen ihrer großen Fähigkeit , mit Oligonukleotid - Sonden modifiziert werden. 8-10 SNP Detektionstechniken wurden auch AuNP entwickelt worden war . 11-13 In dieser Arbeit wurde ein neues farbmetrischen Ansatz der zu erkennen Multi-Nukleotid - Polymorphismus (MNP) , durch DNA - Hybridisierungs vermittelte Wachstum von AuNP Sonden. 14 Diese einfache und schnelle Sondieren Verfahren liegt die Theorie zugrunde , daß vielfältige Längen von Einzelstrang - DNA (ssDNA) oder Doppelstrang - DNA (dsDNA) , konjugiert mit AUNP das Wachstum Größe und Form des AuNP beeinflussen (siehe Abbildung 1). 15 diese Methode der DNA - Nachweisverfügt über einen kleinen Verbrauch von Reagenzien eine kleine Testdauer (wenige Minuten) und ein einfaches Verfahren ohne thermische Kontrolle, die prospektiv anwendbar für die klinische Diagnostik und häusliche medizinische Untersuchung ist. Mehrere Mikrofluidik - Systeme , die die DNA - Sequenz zu detektieren , wurden entwickelt; 16 Diese mikrofluidischen Systemen, von traditionellen experimentelle Protokolle entwickelt, weniger Stücke von Großgeräten und vereinfacht die experimentellen Protokolle erforderlich , um die Empfindlichkeit, die Nachweisgrenze und Spezifität der DNA zu verbessern Biosensor. DNA Detektionsmethoden in der mikrofluidischen Systeme noch erfordern jedoch Instrumente einem nachfolgenden Prozess , wie beispielsweise einer PCR (Polymerasekettenreaktion) Maschine zur Signalverstärkung und einem Fluoreszenzlesegerät für eine einzige Auslesung des heterogenen SNP zu identifizieren. 17,18 eine einfache Entwicklung Plattform ohne die nachfolgende Verarbeitung zu multi-nucleotide polymorphism ausgelesen direkt die Ergebnissesehr wünschenswert ist. Im Vergleich zu gut genutzt, herkömmlichen, geschlossenen mikrofluidischen Systemen, die offene Oberfläche Mikrofluidiksystemen verheißungs mehrere Vorteile, wie zum Beispiel einem klaren optischen Weg, eine einfache Möglichkeit, den Zugriff auf die Probe, eine direkte Umwelt Zugänglichkeit und nicht leicht gebildet Kavitation oder Grenzflächen Behinderung bieten in der Kanal. 19 Unsere bisherigen Arbeit führte eine einfache pneumatische Plattform für Open-Oberfläche Tröpfchenmanipulation (siehe Abbildung 2). 20 Auf dieser Plattform Tröpfchen können gleichzeitig transportiert und manipuliert werden , ohne Einmischung von einer Antriebsenergie eine Saugkraft verwendet, die eine hat ein großes Potenzial in der biologischen und chemischen Anwendungen. Diese pneumatische Plattform wurde so die Manipulation von DNA-Proben für MNP Detektion in Kombination mit dem kolorimetrischen Ansatz unter Verwendung des Konzepts der DNA-Hybridisierungs vermittelte Wachstum von AuNP Sonden auszuführen verwendet. Das Protokoll in diesem Papier beschreibteine einfache visuelle Erkennung von Multi-Nukleotid-Polymorphismen auf der pneumatischen Tröpfchenmanipulationsplattform auf einer offenen Fläche. Diese Arbeit bestätigt, dass die multi-Nukleotid-Polymorphismus mit dem bloßen Auge nachweisbar ist; die vorgeschlagene pneumatische Plattform für biologische und chemische Anwendungen geeignet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="735">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:245px;">PDMS</td>
			<td style="width:204px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">SYLGARD 184</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">benchtop engravers</td>
			<td style="width:204px;">&#160;Roland DG</td>
			<td style="width:119px;">EGX-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">laser cutting machine</td>
			<td style="width:204px;">Universal Laser Systems, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">VLS 3.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Oxygen plasma treatment system</td>
			<td style="width:204px;">Femto Science Inc. Korea</td>
			<td style="width:119px;">CUTE-MPR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">solenoid valve</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>home built</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">vacuum pump</td>
			<td>ULVAC KIKO, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">DA-30D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">13-nm AuNP solution</td>
			<td style="width:204px;">TAN Bead Inc., Taiwan</td>
			<td style="width:119px;">NG-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">DNA (with 5 -end labeled thiol)</td>
			<td style="width:204px;">MDBio, Inc., Taiwan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>UniRegion&#160;Bio-Tech,. Taiwan</td>
			<td>PBS001-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:204px;">J. T. baker</td>
			<td style="width:119px;">4095-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:245px;">Hydroxylamine solution (NH2OH)</td>
			<td style="width:204px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">467804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:245px;">Chloroauric acid (HAuCl4)</td>
			<td style="width:204px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:245px;">vortex mixer</td>
			<td style="width:204px;">Digisystem Laboratory Instruments Inc.</td>
			<td style="width:119px;">VM-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">centrifuge</td>
			<td style="width:204px;">Hermle Labortechnik GmbH.</td>
			<td style="width:119px;">Z 216 MK</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the visual colorimetric detection of multi-nucleotide polymorphisms on a pneumatic droplet manipulation platform

Eine einfache und visuelle Methode Multi-Nukleotid-Polymorphismus (MNP) zu erfassen wurde auf einem pneumatischen Tröpfchenmanipulationsplattform auf einer offenen Fläche ausgeführt. Dieser Ansatz zur farbmetrischen DNA-Nachweis auf der Hybridisierung vermittelte Wachstum von Gold-Nanopartikel-Sonden (AuNP Sonden) basiert. Die Wachstums Größe und Konfiguration des AuNP werden durch die Anzahl von DNA-Proben mit den Sonden hybridisierten dominiert. Auf der Grundlage der spezifischen größen- und formabhängigen optischen Eigenschaften der Nanopartikel, die Anzahl von Fehlpaarungen in einer Proben-DNA-Fragment an die Sonden können unterschieden werden. Die Versuche wurden über jeweils Tröpfchen durchgeführt, enthaltend Reagenzien und DNA-Proben und wurden transportiert und an der pneumatischen Plattform mit dem gesteuerten pneumatischen Ansaugen des flexiblen PDMS-basierten superhydrophoben Membran gemischt. Droplets können gleichzeitig und präzise auf eine offene Fläche an der vorgeschlagenen pneumatischen Plattform geliefert werden, die ohne Neben eff hoch biokompatibelect von DNA-Proben in den Tröpfchen. Die Kombination der beiden vorgeschlagenen Verfahren kann das multi-Nukleotid-Polymorphismus auf den Blick auf den pneumatischen Tröpfchenmanipulationsplattform detektiert werden; kein zusätzliches Gerät erforderlich ist. Das Verfahren von der Installation der Tröpfchen auf der Plattform zum Endergebnis in weniger als 5 min, viel weniger als mit bestehenden Methoden. Darüber hinaus erfordert diese kombinierte MNP Detektionsansatz ein Probenvolumen von nur 10 &amp; mgr; l in jede Operation, die bemerkenswert geringer ist als die eines Makrosystem.

unter Verwendung eines einfachen und neuartigen Nachweismethode durch die DNA-Hybridisierung vermittelte Wachstum der AuNP Sonden in dieser Arbeit wurden drei DNA-Proben getestet. Die Sequenzen der Sonden-DNA und DNA-Proben von drei Arten, nämlich, CDNA, TMDNA (drei Basenpaar nicht übereinstimmen DNA) und SixMDNA (sechs Basenpaar nicht übereinstimmen DNA) aufgelistet sind in Protokoll Schritt 1 (völlig komplementäre DNA-Sonde). die Fehlpaarungen an die Sonde der hier getesteten DNA ...

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The Visual Colorimetric Detection of Multi-nucleotide Polymorphisms on a Pneumatic Droplet Manipulation Platform

Diese Arbeit stellt eine einfache und visuelle Methode Multi-Nukleotid-Polymorphismen auf einem pneumatischen Tröpfchenmanipulationsplattform zu erfassen. Mit dem vorgeschlagenen Verfahren wird das gesamte Experiment, einschließlich Tropfenmanipulation und zum Nachweis von Mehr nucleotide polymorphisms, kann in der Nähe von 23 ° C ohne Zuhilfenahme moderner Instrumente durchgeführt werden.

Der Visual kolorimetrischen Nachweis von Multi-Nukleotid-Polymorphismen auf einem pneumatischen Droplet Manipulation Platform

A simple and visual method to detect multi-nucleotide polymorphism (MNP) was performed on a pneumatic droplet manipulation platform on an open surface. ...

Research

JoVE Journal

Genetics

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Forschung

Genetik

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Der Nachweis von Copy Number Änderungen Single Cell-Sequenzierung

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Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

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