Name: a mimic of the tumor microenvironment: a simple method for generating enriched cell populations and investigating intercellular communication
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication at JoVE.com

This research was supported by grants from the New Jersey Commission on Cancer Research (Pre-Doctoral Fellowship DFHS13PPCO17), the National Institutes of Health (CA049062), and the National Aeronautics and Space Administration (NNX15AD62G).

1. Préparation de milieux de culture et les cellules <ol><li> Préparer 500 ml de milieu essentiel minimum d&#39;Eagle additionné de 12,5% (vol / vol) de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur (FBS), 2 mM de L-alanyl-L-glutamine et de 100 unités de pénicilline et 100 ug de streptomycine par ml. NOTE: Le milieu de croissance et le supplément (s) peut facilement être échangé pour les besoins d&#39;autres souches de cellules ou de lignées cellulaires croissance. </li><li> Préparer 70 pi de milieu d...

Le protocole décrit ici est un simple, adaptable au mode opératoire in vitro (figure 1) qui utilise un insert de membrane microporeuse perméable pour générer des populations de cellules individuelles hautement enrichis à partir d&#39; une co-culture de cellules hétérotypiques. De manière significative, le modèle est adapté pour étudier les différents modes de communication intercellulaire. Les étapes critiques comprennent la sélection de l&#39;insert de taille de pore ap...

Le microenvironnement de la tumeur (TME) est un système très complexe composé de cellules de carcinome qui co-exister et d&#39;évoluer aux côtés de stroma hôte. Ce composant de stroma est typiquement constitué de fibroblastes, les myofibroblastes, les cellules endothéliales, les divers composants du système immunitaire, ainsi qu&#39;une matrice extracellulaire 1. Un constituant important, souvent la majorité de ce stroma, sont des fibroblastes activés, souvent appelé fibroblastes associés au cancer ou des fibroblastes de carcinome associées (CAF) 2,3. A la différence, les fibroblastes normaux non activés, CAFs contribuent à l&#39; initiation d&#39; une tumeur, la progression, l&#39; angiogénèse, l&#39; invasion, la métastase et la récurrence 4-11 dans une grande variété de cancers, y compris du sein, de la prostate, du poumon, du pancréas, de la peau, du côlon, de l&#39; œsophage, et ovaire 5,6,12-17. Pourtant, la nature exacte de la contribution de la CAF à travers la pathogenèse du cancer reste mal défini. En outre, la preuve clinique a démontré une valeur pronostique de CAFs, Corréler leur présence à des tumeurs malignes de haut grade, échec thérapeutique, et la mauvaise 10,18,19 globale de pronostic. De toute évidence, l&#39;amélioration de notre compréhension des événements initiateurs dans le développement de la CAF, ainsi que les communications intercellulaires médiatrices leur rôle au sein de la TME, peuvent fournir de nouvelles cibles thérapeutiques intéressantes et des stratégies améliorées qui pourraient améliorer les résultats des patients. Pour atteindre cet objectif, plusieurs in vivo et in vitro , des modèles ont été développés. Alors que les approches in vivo sont plus représentatives de la TME de patients, ils possèdent des limitations, y compris l&#39;immense complexité et l&#39; hétérogénéité à l&#39;intérieur et entre les tumeurs. En outre, des échantillons de tumeurs provenant de sujets humains représentent souvent très développés TME et ne permettent pas une bonne compréhension des événements initiateurs TME. Des études expérimentales chez l&#39;animal offrent certains avantages, mais la généralisation des données animales aux humains doit être fait avec prudence en raison des différences de phylogie entre les humains et les animaux tels que les rongeurs (par exemple, la chimie thiol 20, le taux métabolique 21, la tolérance au stress 22, etc.). En outre, contrairement à la population humaine, qui est génétiquement hétérogène dans la nature, les animaux de laboratoire sont généralement élevés jusqu&#39;à homogénéité. En outre, il est souvent difficile d&#39;examiner les variations physiologiques transitoires et des modifications du phénotype des cellules, ainsi que pour contrôler les paramètres expérimentaux spécifiques en utilisant des animaux tels que les rongeurs. Ainsi, in vitro 2 et 3 dimensions (2D et 3D) des modèles de culture de tissus sont fréquemment utilisés pour faire avancer la compréhension de base du développement TME. En dépit de leur manque d&#39;une représentation exacte de la complexité des systèmes in vivo, ces modèles offrent des avantages qui facilitent grandement les enquêtes mécanistes. In vitro modèles permettent une analyse plus simplifiée, ciblée et rentable de la TME, de sorte que statistiquement significative les données peuvent être généréescellules libres des variations systémiques qui surviennent chez les animaux. Il existe plusieurs variétés de systèmes in vitro. Les deux TME modèles les plus couramment utilisés in vitro consistent en monocouche mixte ou des cultures de cellules sphéroïdes. Les deux méthodes de culture sont avantageux pour les études de base des interactions intercellulaires (par exemple, les cellules normales avec des cellules tumorales) et pour l&#39;analyse des divers changements de phénotype cellulaire spécifiques TME (par exemple, l&#39; apparition de fibroblastes associés au cancer de fibroblastes normaux). En outre, les sphéroïdes sont capables de créer une structure de TME tissu ressemblant plus réfléchi, et peuvent être représentatifs de l&#39; hétérogénéité tumorale 23. Cependant sphéroïdes produisent souvent très différents gradients de tension d&#39;oxygène à travers les couches, ce qui peut compliquer les conclusions expérimentales 24. Malheureusement, les deux modèles sont extrêmement limitées dans leur capacité à isoler des populations cellulaires pures pour une caractérisation plus poussée et l&#39;étude suivante coopérationCulture. Pour ce faire, il faudrait au moins un type de cellule à être marqués par fluorescence ou marqué avec un fabricant identifiant, puis en soumettant le mélange co-culture extensive de traitement et de tri cellulaire pour séparer les populations de cellules. Alors un trieur de cellules est capable d&#39;isoler une population de cellules plutôt pure, il faut être conscient du stress cellulaire et la contamination microbienne risques potentiels 25. Pour faciliter la compréhension de la communication intercellulaire, de grands efforts ont été consacrés au développement et l&#39; optimisation des systèmes in vitro qui imitent étroitement l&#39;environnement in vivo, tout en permettant une approche simplifiée. Un tel outil est l&#39;insert microporeux perméable, un substrat de membrane qui a été développé en 1953 26 et ensuite adapté pour des applications diverses et des études (par exemple, la polarité cellulaire 27, endocytose 28, le transport de la drogue 29, la modélisation des tissus 30, FERTilization 31, effet bystander 32,33, etc.). Ce système permet la croissance des cellules in vivo avec anatomique -like et la différenciation fonctionnelle, ainsi que l&#39; expression d&#39; un grand nombre in vivo , les marqueurs 34,35 qui ne sont pas observées lorsqu&#39;il est cultivé sur plasticware imperméable. En outre, la membrane poreuse extrêmement mince (10 um d&#39; épaisseur) permet la diffusion rapide des molécules et des temps d&#39;équilibrage, qui simule l&#39;environnement in vivo et permet le fonctionnement cellulaire indépendante à la fois les domaines de la cellule apicale et basolatérale. Un avantage supplémentaire de l&#39;utilité de l&#39;insert comme un système TME est la séparation physique des deux populations de cellules cultivées hétérotypiques de part et d&#39;autre de la membrane dans les mêmes conditions environnementales, tout en maintenant les différents modes de communication intercellulaire à travers les pores de la membrane. Bien qu&#39;ils soient séparés physiquement, les deux populations de cellules sont métaboliquement couplés par l&#39;intermédiaire d&#39;éléments sécrétées et, dedécrit ici, aussi, par la voie de l&#39;écart-jonctionnel. En outre, en maintenant les plaquettes in vivo à la pression d&#39;oxygène partielle (PO 2), le modèle réduit les complications des gradients d&#39;oxygène et chimiques observés dans d&#39; autres systèmes. Au contraire, elle augmente la compréhension des mécanismes naturels de contrôle TME. En particulier, les deux populations de cellules peuvent être facilement isolées avec une pureté élevée, sans marquage fluorescent et / ou le tri cellulaire après une longue période de co-culture. Nous décrivons ici un protocole de TME in vitro comprenant des cellules de carcinome du sein humain et des fibroblastes humains cultivés, respectivement, de part et d&#39; autre d&#39;un insert de membrane microporeuse perméable, mais encore dans une communication bidirectionnelle continue à travers les pores de la membrane. Nous montrons que l&#39;utilisation de membranes avec différentes tailles de pores, la contribution d&#39;un type spécifique de la communication intercellulaire (par exemple, des facteurs sécrétés par rapport à jonctions gap) pour le développementdu TME peut être étudiée.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="886">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">For Cell Culture</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:289px;">AG01522 (i.e., AG1522) human diploid fibroblast</td>
			<td style="width:180px;">Coriell</td>
			<td style="width:139px;">107661</td>
			<td style="width:279px;">Passage 8-13</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:289px;">MDA-MB-231-luc-D3H1 breast adenocarcinoma cell line</td>
			<td style="width:180px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:139px;">119261</td>
			<td style="width:279px;">Parental line: ATCC (#HTB-26)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:289px;">MDA-MB-231/GFP breast adenocarcinoma cell line</td>
			<td style="width:180px;">Cell Biolabs</td>
			<td style="width:139px;">AKR-201</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Eagle&#39;s minimal essential medium (MEM)</td>
			<td style="width:180px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:139px;">15-010-CV</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">F6178-500mL</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:289px;">Corning Glutagro Supplement (200mM L-alanyl-L-glutamine)</td>
			<td style="width:180px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:139px;">25-015-Cl</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Penicillin Streptomycin Solution, 100X</td>
			<td style="width:180px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:139px;">30-002-Cl</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:289px;">Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (0.4 &#956;m pore)</td>
			<td style="width:180px;">Costar</td>
			<td style="width:139px;">3450</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:289px;">Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (1 &#956;m pore)</td>
			<td style="width:180px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:139px;">657610</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:289px;">Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (3 &#956;m pore)</td>
			<td style="width:180px;">Costar</td>
			<td style="width:139px;">3452</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">6-well Culture Plate</td>
			<td style="width:180px;">Greiner Bio-One Cellstar</td>
			<td style="width:139px;">657160-01</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">75 cm2 cell culture flask</td>
			<td style="width:180px;">CellStar</td>
			<td style="width:139px;">658 170</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1X</td>
			<td style="width:180px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:139px;">21-040-CV</td>
			<td style="width:279px;">without calcium &#38; magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:289px;">0.25% (vol/vol) Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1X</td>
			<td style="width:180px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:139px;">25-053-Cl</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:180px;">CellTreat</td>
			<td style="width:139px;">229411</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">35 x 10 mm Cell Culture Dish</td>
			<td style="width:180px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:139px;">627 160</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Name</td>
			<td style="width:180px;">Company</td>
			<td style="width:139px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">For Immunofluorescent Microscopy</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:289px;">Mouse anti-Caveolin 1</td>
			<td style="width:180px;">BD Transduction Laboratories</td>
			<td style="width:139px;">610406</td>
			<td style="width:279px;">In situ Immunofluorescence - 1:5000</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:289px;">Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td style="width:180px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">A-11029</td>
			<td>In situ Immunofluorescence - 1:2000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Bovine Serum Albumin - Fraction V</td>
			<td style="width:180px;">Rockland</td>
			<td style="width:139px;">BSA-50</td>
			<td>Immunoglobulin and protease free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">16% (wt/vol) Formaldehyde Solution</td>
			<td style="width:180px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">28908</td>
			<td>Dilute to 4% with 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Premium Cover Glass (22x22 mm No.1)</td>
			<td style="width:180px;">Fisher</td>
			<td style="width:139px;">12548B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">SlowFade Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:139px;">S36938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Name</td>
			<td style="width:180px;">Company</td>
			<td style="width:139px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">For Flow Cytometric Analysis</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Calcein, AM</td>
			<td style="width:180px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:139px;">C3100MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco</td>
			<td style="width:139px;">14025-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Name</td>
			<td style="width:180px;">Company</td>
			<td style="width:139px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">For Western Blot Analysis</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:289px;">Mouse anti-Caveolin 1</td>
			<td style="width:180px;">BD Transduction Laboratories</td>
			<td style="width:139px;">610406</td>
			<td style="width:279px;">Western Blot - 1:10000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Tween-20</td>
			<td style="width:180px;">BioRad</td>
			<td style="width:139px;">170-6531</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Nitrocellulose Membrane (0.2 &#956;m)</td>
			<td style="width:180px;">BioRad</td>
			<td>162-0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Western Lightning Plus-ECL</td>
			<td style="width:180px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:139px;">NEL104001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">BioRad DC Protein Assay</td>
			<td style="width:180px;">BioRad</td>
			<td style="width:139px;">500-0116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:180px;">BioRad</td>
			<td style="width:139px;">161-0302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Sodium deoxycholate monohydrate (DOC)</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">D5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">IGEPAL CA-630 (NP40)</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1</td>
			<td style="width:180px;">BioRad</td>
			<td style="width:139px;">161-0158</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mimic of the tumor microenvironment: a simple method for generating enriched cell populations and investigating intercellular communication

Comprendre les interactions hétérotypiques précoces entre les cellules cancéreuses et le stroma non-cancéreuse environnante est important pour élucider les événements qui ont conduit à l&#39;activation du stroma et l&#39;établissement du microenvironnement de la tumeur (TME). Plusieurs in vitro et dans des modèles in vivo de TME ont été développés; cependant, en général, ces modèles ne permettent pas facilement l&#39;isolement des populations de cellules individuelles, dans des conditions non-perturbation, pour une étude plus approfondie. Pour contourner cette difficulté, nous avons utilisé un modèle in vitro de TME en utilisant un substrat de croissance cellulaire consistant en un insert de membrane microporeuse perméable qui permet la génération simple de populations de cellules hautement enrichis cultivés intimement, mais séparément, de part et d&#39; autre de la membrane de l&#39;insert de coopération élargie -Culture fois. Grâce à l&#39;utilisation de ce modèle, nous sommes capables de générer des fibroblastes associés au cancer grandement enrichi (CAF) populations de fibroblastes humains diploïdes normaux suivanteco-culture (120 h) avec des cellules fortement métastatiques de cancer du sein humain, sans l&#39;utilisation d&#39;un marquage fluorescent et / ou le tri cellulaire. En outre, en modulant la taille des pores de la pièce, on peut contrôler le mode de communication intercellulaire (par exemple, la communication de l&#39; écart-jonction, les facteurs sécrétés) entre les deux populations de cellules hétérotypiques, ce qui permet d&#39; étudier les mécanismes sous - jacents au développement du TME, y compris le rôle de l&#39;écart-perméabilité de la jonction. Ce modèle est un outil précieux pour améliorer notre compréhension des événements initiaux conduisant au cancer-stroma initiation, l&#39;évolution rapide de la TME, et l&#39;effet de modulation du stroma sur les réponses des cellules cancéreuses à des agents thérapeutiques.

Ici , nous avons adapté un insert de membrane microporeuse perméable à mettre au point un système cellulaire hétérotypique co-culture in vitro qui imite le microenvironnement de tumeur in vivo (figure 1). Ce système permet de deux populations de cellules différentes pour être cultivées sur chaque côté de la membrane poreuse de l&#39;insert pendant des périodes de temps prolongées (jusqu&#39;à 120 h, dans l&#39;utilisation). Il est importa...

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A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication

We adapted a permeable microporous membrane insert to mimic the tumor microenvironment (TME). The model consists of a mixed cell culture, allows simplified generation of highly enriched individual cell populations without using fluorescent tagging or cell sorting, and permits studying intercellular communication within the TME under normal or stress conditions.

A Mimic du microenvironnement de la tumeur: Une méthode simple pour générer des populations de cellules enrichies et enquête intercellulaire Communication

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events ...

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