Name: using touch-evoked response and locomotion assays to assess muscle performance and function in zebrafish
Uploaded: 2016-10-31T13:00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish at JoVE.com

We thank Viewpoint for their kind sponsorship of this manuscript. This work was funded by an Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant (APP1010110).

1. Trykk-fremkalt respons analyse <ol><li> Utarbeidelse av to dpf embryoer for Touch-fremkalt respons analyse <ol><li> Kontroller at klokkeslettet som testen er gjennomført er konsistent mellom eksperimenter fordi aktivitet kan variere dramatisk i løpet av dagen 17,18. MERK: Forsøket skal utføres blindet og rekkefølgen på testing randomisert for å minimere eksperimentelle artefakter. </li><li> Tildel fisken påkjenningen et tall, som er ukjent for den enkelte utførelse av eksperimentet. Etter dette, ved hjelp av fritt tilgjengelige elektroniske verktøy generere en tilfeldig liste som bestemmer rekkefølgen på testing. </li><li> Minst en time før testing, dechorionate embryoer ved ripping et hull i chorion og forsiktig trekke chorion fra hverandre ved hjelp av et par fine pinsett. Fjern eventuelle rester fra petriskål før retur til 28 ° C inkubator. </li></ol></li><li> Utføre Touch-fremkalt respons analyse <ol><li> Heat stage til 28 ° C i minst 15 minutter før du starter testing. MERK: Denne fasen er temperaturstyrt og vil holde seg på 28 &#160; ° C i løpet av testingen. Temperaturen vil påvirke aktivitet og det er derfor viktig å opprettholde en konstant temperatur. Hvis en oppvarmet trinn er ikke tilgjengelig da temperaturen på vannet skal overvåkes, og alle forsøk bør utføres ved den samme temperatur. </li><li> Plasser en petriskål fylt med embryo-medium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4 i vann) på et belyst scene og montere høyhastighetskamera over petriskålen. </li><li> Start videokamera innspillingen programvare (for eksempel Stream Pix 5, beskrevet her), og under &quot;arbeidsområdet&quot; fanen velg 1000 bilder per sekund (1000 fps) som opptakshastigheten for å sikre at rask svømming handling av fisken er registrert. </li><li> Arbeide med en embryo av gangen, plassere embryo i middle av petriskål med sebrafisk godt synlig i synsfeltet. MERK: Hvis fosteret svømmer bort før oppstart av forsøket erstatte den med en annen, som gjenerobre og posisjonering av embryoet kan resultere i at det blir ufølsomme til stimulans og gjentatte burst reaksjoner kan fremme muskelsvakhet i enkelte sykdomsmodeller. </li><li> Begynn opptaket ved å klikke på &quot;record&quot; -knappen, og levere mechanosensory stimulans til fosteret ved å berøre dem forsiktig med en butt nål på toppen av hodet. </li><li> Stopp opptak etter embryo har svømt ut av synsfeltet eller returneres til hvile. MERK: Akselerasjons toppene innenfor den første 0,2 sek av brast flukt respons etter den mekaniske stimulus. Derfor sikre at minst under den første 0,2 sek på flukt respons opptak fisken er i synsfeltet. Ved hjelp av programvaren som er beskrevet i trinn 1.2.3, vil data automatisk lagressom en .avi videofil. Alternative video fange programvare som Free Video Capture eller Softonic, som begge er fritt tilgjengelig for nedlasting, kan også brukes. </li><li> Returner embryoet til en ny petriskål og velge et annet embryo for testing. Utføre testing på minimum 15 fisk. </li></ol></li><li> Kvantifisering av Swimming Behavior <ol><li> For å kvantifisere svømmeatferd, starter programvaren og velg &quot;Single Larver Locomotion uten bakgrunn subtraksjon&quot; -modulen for å åpne den lagrede AVI videofil. </li><li> Bruke &quot;frihånd&quot; eller &quot;polygon&quot; verktøy fra menylinjen Velg områder av filmen som skal brukes for analyse. Sørg for at regionen omfatter både den opprinnelige plasseringen av fisk og området som fisken vil svømme inn. Sørge for at proben er utelukket fra det området som skal analyseres. Programvaren vil automatisk følge banen til fisken innenfor det ønskede området. </li><li> For å utføre than analyse, klikk på &quot;eksperiment&quot; fra menylinjen og velg &quot;kjøre&quot;. Når du blir bedt lagre rå dataanalyse fil (.phr format) på ønsket sted. Når du har lagret, klikk på &quot;start&quot; for å begynne analysen. Avslutt analyse ved å klikke på &quot;stopp&quot; under &quot;eksperiment&quot; drop down menyen. Et vindu som inneholder resultatene vil bli vist. </li><li> Bla til høyre for å få &quot;maksimal akselerasjon&quot; verdi. Dersom det er ønskelig, eksportere disse dataene ved å lukke resultatvinduet og klikke på &quot;eksport øyeblikkelig resultater&quot; -knappen under &quot;resultater&quot; drop down menyen. Velg riktig rå dataanalyse filen og klikk på Åpne. En tekstfil som kan åpnes i et regnearkprogram vil bli lagret i målmappen. </li><li> Gjenta denne fremgangsmåten for hver enkelt fisk, og gjennomsnittet for å oppnå den maksimale akselerasjon for hver stamme (se figur 1). MERK: Som et alternativ til using programvaren som er beskrevet her, kan lignende pakker som fritt tilgjengelig ImageJ programvare brukes til å trekke ut de relevante bevegelsesdata. 3D Particle Tracker plugin kan brukes til å spore svømming baner. </li></ol></li></ol> 2. Locomotion analyse - 10-min Swim Test <ol><li> Fremstilling av 6 dpf embryoer for bading Analysis <ol><li> Hvis det er nødvendig, liksom embryoer for den ønskede genotype, for eksempel ved å kontrollere ekspresjon av et fluorescerende protein, eller ved å fenotype, og plasser i en separat petriskål (25-30 embryoer pr skål). Alternativt kan genotypen bli bestemt etter fullførelse av bevegelse analysen. </li><li> På tre dpf, revurdere petriskåler og fjerne eventuelle unhatched embryoer og rusk. Returner petriskåler til 28 ° C inkubator inntil 6 dpf. </li><li> Utføre testing av alle stammer mellom 9 am og 24:00, som er den tiden hvor sebrafisk larver er mest aktive. Randomisere rekkefølgen på testing og posisjon i psent av villtype og mutante prøver å minimalisere virkningene av biologiske forskjeller og andre eksperimentelle bias. MERK: Det er viktig at testtiden er konsistent mellom eksperimenter fordi aktivitet kan variere dramatisk i løpet av dagen. </li><li> I minst 30 min før testing, sted larver inn i en 48-brønns plate med en larve per brønn. Etter overføring, fylle brønnene, slik at vannflaten ligger like under toppen av brønnen, slik at det ikke er noen bobler. Gå tilbake platene til 28 ° C inkubator. </li><li> Ta platene ut av inkubatoren og akklimatisere i lyset i fem minutter før testing. </li></ol></li><li> Utføre Locomotion analysen <ol><li> Plasser 48-brønns plate i opptakskammeret, som er utstyrt med et infrarødt kamera, og fanger opp til 60 bilder / sek, slik at larvene kan påvises i mørket. Sjekk at alle brønnene er plassert inne i sirkulær rutenett på locomotion programvare, og at alle larvene er clearly synlig. </li><li> Start programvaren og velg &quot;tracking&quot; modul. Under &quot;fil&quot; klikk på &quot;generere ny protokoll&quot; og endre antall brønner som brukes for forsøket. Sett både eksperimentet varighet og integrasjonsperioden til 10 min ved å klikke på &quot;parametre&quot; drop down menyen og velge &quot;protokollparametere&quot; og senere &quot;tid&quot; -kategorien. På samme &quot;protokollparametere&quot; dialogboksen, klikk på &quot;alternativer&quot; -fanen og sikre &quot;Numeriscope&quot; boksen klikkes følgende som er &quot;protokollparametere&quot; dialogboksen kan lukkes. </li><li> Hvis du vil angi opptaksområdene markere hele rutenettet og dobbeltklikk på en av brønnene. Klikk på &quot;trekke områder&quot; knappen og tegne rundt øverst til venstre, øverst til høyre, og nederste venstre brønner og klikk &quot;build&quot;, som gjør at programvare for å automatisk bestemme plasseringen av hver brønn. Også trekke i en skalabar og klikk på &quot;gjelder for gruppen&quot;. Etter fullført, klikk på &quot;tegne områder&quot; -knappen. </li><li> Visuelt bestemme deteksjonsgrensen ved å skyve &quot;deteksjonsgrensen&quot; bar til et nivå hvor kun de fisk bevegelser fremheves uten bakgrunnssignaler. MERK: deteksjonsgrensen vil variere mellom stammer og dermed tersklene må bestemmes når en ny stamme er testet. I den representative data presentert en deteksjonsgrense på 25 mm / sek, ble anvendt. </li><li> Før du starter testing angi bevegelses terskler for påvisning av inaktivitet, og små og store bevegelser. MERK: I de representative data presenteres en inaktivitetsterskelen av 6 mm / sek og en aktivitet brast terskelen på 30 mm / sek ble brukt. Tersklene bestemme minimum bevegelsen for å bli betraktet som aktiv, og det nivå som er nødvendig for å bli betraktet briste aktivitet og tillater klassifisering av aktivitet i små (aktiv, men under brudd aktivitety terskler) og store (større enn utbrudd aktivitet terskel) bevegelser. Tersklene kan endres avhengig av aktiviteten av den spesielle fiske stammer analysert. MERK: Selv om analysen kan utføres i enten lyse eller mørke forhold, har sebrafisk larver vist seg å være mer aktiv i mørket 18. </li><li> Sett lysintensiteten inne i kammeret for å være på 0% ved å klikke på &quot;lette kjøreinnstillinger&quot; -knappen under &quot;parametre&quot; drop down menyen. På dialogboksen som vises, legge de nødvendige lysinnstillinger. MERK: lysintensiteten inne i kammeret kan utløses for å slå av og på i løpet av testtiden å stimulere larve aktivitet </li><li> Lukk døren av opptaket kammer og starte videoopptak. </li></ol></li><li> Kvantifisering av Swimming Behavior <ol><li> Etter at forsøket er ferdig, klikk på &quot;stopp&quot; under &quot;eksperiment&quot; drop down menyen. En dialog boksx med alle resultatene vises. </li><li> For å få tilgang til disse resultatene i excel klikk på &quot;Åpne mappen som inneholder&quot; og åpne excel-filen som vises i resultatmappen. De viktigste parametrene er &quot;smlct&quot; (liten bevegelse teller), &quot;larct&quot; (stor bevegelse teller), &quot;smldist&quot; (total distanse som fisken i små bevegelser) og &quot;lardist&quot; (total distanse som fisken i store bevegelser ). MERK: Etter innspillingen programvaren returnerer også to ekstra utgang filer i form av en AVI-fil (som inneholder en video av 10 min opptak) og en .png bildefil (som inneholder en visuell representasjon av bevegelse i løpet av 10- min eksperiment; se figur 2). </li><li> Når locomotion verdier beregnes, spille av .avi og PNG-filer for å vurdere om de locomotion verdiene som er beregnet nøyaktig bilde av svømme bevegelser av fisk (se Figur3). MERK: Som et alternativ til å bruke programvaren som er beskrevet her, kan pakker som fritt tilgjengelig ImageJ programvare brukes til å spore motorisk atferd. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Bassett, D. I., Bryson-Richardson, R. J., Daggett, D. F., Gautier, P., Keenan, D. G., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+is+required+for+the+formation+of+stable+muscle+attachments+in+the+zebrafish+embryo.">Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo.</a> Development. 130 (23), 5851-5860 (2003).</li><li>Gupta, V. A., Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+splice+site+mutation+in+laminin-&#945;2+results+in+a+severe+muscular+dystrophy+and+growth+abnormalities+in+zebrafish.">A splice site mutation in laminin-&#945;2 results in a severe muscular dystrophy and growth abnormalities in zebrafish.</a> PLoS ONE. 7 (8), e43794 (2012).</li><li>Gupta, V., Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+dag1+mutant:+a+novel+genetic+model+for+dystroglycanopathies.">The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies.</a> Hum Mol Genet. 20 (9), 1712-1725 (2011).</li><li>Kawahara, G., Karpf, J. A., Myers, J. A., Alexander, M. S., Guyon, J. R., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Proc Natl Acad Sci. 108 (13), 5331-5336 (2011).</li><li>Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=neb:+a+zebrafish+model+of+nemaline+myopathy+due+to+nebulin+mutation.">neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation.</a> Dis Model &amp; Mech. 5 (3), 389-396 (2012).</li><li>Ruparelia, A. A., Oorschot, V., Vaz, R., Ramm, G., Bryson-Richardson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+of+BAG3+myofibrillar+myopathy+suggest+a+toxic+gain+of+function+leading+to+BAG3+insufficiency.">Zebrafish models of BAG3 myofibrillar myopathy suggest a toxic gain of function leading to BAG3 insufficiency.</a> Acta Neuropathol. 128 (6), 821-833 (2014).</li><li>Sztal, T. E., Sonntag, C., Hall, T. E., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epistatic+dissection+of+laminin-receptor+interactions+in+dystrophic+zebrafish+muscle.">Epistatic dissection of laminin-receptor interactions in dystrophic zebrafish muscle.</a> Hum Mol Genet. 21 (21), 4718-4731 (2012).</li><li>Sztal, T. E., Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+for+nemaline+myopathy+reveal+a+spectrum+of+nemaline+bodies+contributing+to+reduced+muscle+function.">Zebrafish models for nemaline myopathy reveal a spectrum of nemaline bodies contributing to reduced muscle function.</a> Acta Neuropathol. 130 (3), 389-406 (2015).</li><li>Pichler, F. B., Laurenson, S., Williams, L. C., Dodd, A., Copp, B. R., Love, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+discovery+and+global+gene+expression+analysis+in+zebrafish.">Chemical discovery and global gene expression analysis in zebrafish.</a> Nat Biotechnol. 21 (8), 879-883 (2003).</li><li>Peterson, R. T., Shaw, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+suppression+of+a+genetic+mutation+in+a+zebrafish+model+of+aortic+coarctation.">Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation.</a> Nat Biotechnol. 22 (5), 595-599 (2004).</li><li>Kawahara, G., Serafini, P. R., Myers, J. A., Alexander, M. S., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+zebrafish+dysferlin+by+morpholino+knockdown.">Characterization of zebrafish dysferlin by morpholino knockdown.</a> Biochem Bioph Res Co. 413 (2), 358-363 (2011).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish.">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nat Rev Drug Discov. , (2005).</li><li>Smith, L. L., Beggs, A. H., Gupta, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+skeletal+muscle+defects+in+larval+zebrafish+by+birefringence+and+touch-evoke+escape+response+assays.">Analysis of skeletal muscle defects in larval zebrafish by birefringence and touch-evoke escape response assays.</a> J Vis Exp. (82), e50925 (2013).</li><li>Sloboda, D. D., Claflin, D. R., Dowling, J. J., Brooks, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+measurement+during+contraction+to+assess+muscle+function+in+zebrafish+larvae.">Force measurement during contraction to assess muscle function in zebrafish larvae.</a> J Vis Exp. (77), (2013).</li><li>McDonald, C. M., Henricson, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+6-minute+walk+test+as+a+new+outcome+measure+in+Duchenne+muscular+dystrophy.">The 6-minute walk test as a new outcome measure in Duchenne muscular dystrophy.</a> Muscle Nerve. 41 (4), 500-510 (2010).</li><li>McDonald, C. M., Henricson, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+6-minute+walk+test+and+other+clinical+endpoints+in+duchenne+muscular+dystrophy:+reliability,+concurrent+validity,+and+minimal+clinically+important+differences+from+a+multicenter+study.">The 6-minute walk test and other clinical endpoints in duchenne muscular dystrophy: reliability, concurrent validity, and minimal clinically important differences from a multicenter study.</a> Muscle Nerve. 48 (3), 357-368 (2013).</li><li>Hurd, M. W., Debruyne, J., Straume, M., Cahill, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+of+locomotor+activity+in+zebrafish.">Circadian rhythms of locomotor activity in zebrafish.</a> Physiol Behav. 65 (3), 465-472 (1998).</li><li>MacPhail, R. C., Brooks, J., Hunter, D. L., Padnos, B., Irons, T. D., Padilla, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotion+in+larval+zebrafish:+Influence+of+time+of+day,+lighting+and+ethanol.">Locomotion in larval zebrafish: Influence of time of day, lighting and ethanol.</a> Neurotoxicology. 30 (1), 52-58 (2009).</li><li>Berger, J., Berger, S., Jacoby, A. S., Wilton, S. D., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+exon-skipping+strategies+for+Duchenne+muscular+dystrophy+utilizing+dystrophin-deficient+zebrafish.">Evaluation of exon-skipping strategies for Duchenne muscular dystrophy utilizing dystrophin-deficient zebrafish.</a> J Cell Mol Med. 15 (12), 2643-2651 (2011).</li><li>Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+birefringence+readily+measures+the+level+of+muscle+damage+in+zebrafish.">Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish.</a> Biochem Bioph Res Co. 423 (4), 785-788 (2012).</li><li>Ravenscroft, G., Jackaman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+dominant+ACTA1+disease+recapitulate+human+disease+and+provide+insight+into+therapies.">Mouse models of dominant ACTA1 disease recapitulate human disease and provide insight into therapies.</a> Brain. 134 (4), 1101-1115 (2011).</li><li>Ravenscroft, G., Wilmshurst, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+ACTA1+mutation+resulting+in+a+severe+congenital+myopathy+with+nemaline+bodies,+intranuclear+rods+and+type+I+fibre+predominance.">A novel ACTA1 mutation resulting in a severe congenital myopathy with nemaline bodies, intranuclear rods and type I fibre predominance.</a> Neuromuscular Disord. 21 (1), 31-36 (2011).</li><li>Wolman, M. A., Jain, R. A., Liss, L., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+modulation+of+memory+formation+in+larval+zebrafish.">Chemical modulation of memory formation in larval zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci. 108 (37), 15468-15473 (2011).</li><li>Müller, U. K., van Leeuwen, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swimming+of+larval+zebrafish:+ontogeny+of+body+waves+and+implications+for+locomotory+development.">Swimming of larval zebrafish: ontogeny of body waves and implications for locomotory development.</a> J Exp Biol. 207 (Pt 5), 853-868 (2004).</li><li>Cheng, W., Tian, J., Burgunder, J. M., Hunziker, W., Eng, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotonia+congenita-associated+mutations+in+chloride+channel-1+affect+zebrafish+body+wave+swimming+kinematics.">Myotonia congenita-associated mutations in chloride channel-1 affect zebrafish body wave swimming kinematics.</a> PLoS ONE. 9 (8), e103445 (2014).</li><li>Moggio, M., Colombo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+disease+heterogeneity:+a+prognostic+challenge.">Mitochondrial disease heterogeneity: a prognostic challenge.</a> Acta Myol. 33 (2), 86-93 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Mange forskjellige dyremodeller, inkludert mus, hunder, sebrafisk, fluer og ormer har bidratt til vår forståelse av genetiske og molekylære grunnlaget for muskelsykdommer, og bistått i utviklingen av terapeutiske tilnærminger for å bekjempe dem. Sebrafisk har flere fordeler for studiet av muskelsykdommer. Sebrafisk gir et genetisk manipulere system for å vurdere kompleks muskel mønster i en passende fysiologisk miljø, noe som ikke er mulig i in vitro kultursystemer. I motsetning til andre virveldyr dyremodeller, det store antall fisk som produseres, sammen med dens optisk klarhet, letter hurtig, high-throughput in vivo kjemisk og genetisk screening. Her beskriver vi utviklingen av sebrafisk bevegelse analyser for å gi en høy gjennomstrømming og automatisert metode for å vurdere muskel ytelse under sebrafisk embryogenese. For begge analysene må det erkjennes at døgnrytme ogytre miljømessige stimuli vil påvirke sebrafisk svømmeatferd 17,18. Gjentatt testing av den samme sebrafisk vil også føre til tilvenning forårsaker en reduksjon i respons til det taktile stimuli 23. Derfor, for å oppnå reproduserbare resultater mellom eksperimenter hver sebrafisk embryo skal bare testes en gang, den tiden av døgnet og lysforhold bør være standardisert, og vanntemperaturen må være strengt regulert. Bruke berørings fremkalt analyse på to dpf vi kan direkte måle maksimal akselerasjon av en burst svømming handling, som er proporsjonal med muskelkraft. Tidligere teknikker i sebrafisk har undersøkt muskelstyrken ved å binde begge ender av embryoene som eksperimentelt utstyr hvor muskelkontraksjon stimuleres ved hjelp av et elektrisk felt og den kraftgenererende evne av muskelen 14 blir målt. Mens denne metoden måler kraften av produksjonsevnen av than larve muskel, betyr det ikke måle den virkelige kraften som genereres av larve muskelen under svømming. Vi har derfor utviklet en metode for indirekte å vurdere den kraft som dannes under den normale larvesvømme bevegelse for å gi en samlet grad av muskel helse. Den høyhastighets video system, kan ta opp enkeltsebrafisk bevegelser på en bildefrekvens på 1000 bilder / sek kan brukes til å identifisere små, men signifikante forskjeller i muskelfunksjon, som ikke er direkte gjenkjennelig ved øyet. Det vil være av interesse å se hvordan tidligere rapportert endringer i elektrisk stimulert kraft generasjon korrelerer med endringer i svømming ytelse. I tillegg er den berørings fremkalt respons-assays kan også brukes til å vurdere svømme kinematikk, slik som formen og hastigheten av legemet bølge under bading bevegelse 24, for å gi en kvantitativ måling av motorisk oppførsel. På grunn av den spontane bevegelse av zebrafish larver etter tre dpf, var vi ikke i stand til å utføre de berøringsfremkalle analyser for å måle muskelfunksjon. Motsatt har vi målt muskel ytelse over en lengre periode ved å bestemme avstand svømt av sebrafisk larver på 6 dpf. Denne testen, selv om et indirekte mål på muskelfunksjonen, kan brukes til å identifisere fisk som viser nedsatt muskelyteevne 8 eller neurodegenerering 25,26. Denne testen gir ikke bare en måling som er analog med den 6 min gange test, men er også egnet for automatisert high-throughput in vivo medikament eller mutagenese-skjermer.

I løpet av det siste tiåret sebrafisk har blitt stadig mer brukt til å studere muskelcellebiologi og sykdom. Den raske utviklingen av ytre sebrafisk embryo, kombinert med optisk klarhet, tillater direkte visualisering av muskeldannelse, vekst og funksjon. Prosessen med muskelutvikling er sterkt konservert i sebrafisk og dette har gjort en vellykket modellering av en rekke muskelsykdommer inkludert muskeldystrofier og medfødte myopatier 1-8. Detaljert undersøkelse av sebrafisk-modeller har ikke bare gitt ny innsikt i patobiologi av disse forholdene, men også gitt en plattform for testing av egnede behandlinger 6,9-13. Analysen av sebrafisk modeller av muskelsykdommer er avhengig av pålitelige og reproduserbare analyser for å måle muskel ytelse. Tidligere studier har blitt målt den kraft som frembringes av et sebrafisk stammen muskelen i fisk mellom 3 og 7 DPF avelektrisk å stimulere sammentrekning av et immobilisert fisk festet til en kraft transduksjon system 14. Dette kan gi detaljerte målinger av kraft, men er ikke ideelt for høyere gjennomstrømning eksperimenter, og det er fordeler med å måle muskel ytelse under svømming. På to DPF sebrafisk muskelen er fullt funksjonell og fisken kan lokke fram burst svømmebevegelser som respons på stimuli. Den berøringsfremkalle fluktrespons analysen anvendes for å måle akselerasjon i løpet av en burst svømming bevegelse, som kan brukes som et mål på kontraktil kraft. Et av de mest benyttet målinger av muskelfunksjonen i myopati pasienter er 6 min gangtest, som registrerer totaldistanse på en hard flat overflate 15,16. Vi har brukt en tilsvarende test for å måle muskelfunksjon i seks dpf sebrafisk larver, hvor vi overvåke den totale distansen svømt, og det totale antall bevegelser gjort av hver larve i løpet av en 10 minutters periode. Dette gjøresved hjelp av et automatisert system for sporing, som gir pålitelige og high-throughput målinger av muskel ytelse. Begge muskel testene er svært reproduserbare, og har blitt brukt til å kvantifisere forskjeller i muskel ytelse i sebrafisk myopati modeller 8.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>21G X 1&#39; Blunt Needle</td>
			<td>Terumo/Admiral Medical Supplies</td>
			<td>TE2125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90mm Petri Dishes</td>
			<td>Pacific Laboratory Products PT</td>
			<td>S90001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Speed Camera</td>
			<td>Baumer</td>
			<td>HXC20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>http://www.randomization.com</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>Steps 1.1.2, 2.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermoline Scientific</td>
			<td>TEI-43L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16001-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StreamPix5</td>
			<td>NorPix</td>
			<td></td>
			<td>Step 1.2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Control Unit</td>
			<td>Viewpoint</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers, style 8</td>
			<td>ProSciTech</td>
			<td>T04-821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrabox System</td>
			<td>Viewpoint</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebralab</td>
			<td>Viewpoint</td>
			<td></td>
			<td>Steps 1.3.1, 2.2.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using touch-evoked response and locomotion assays to assess muscle performance and function in zebrafish

Sebrafisk muskelutvikling er sterkt konservert med pattedyrsystemer som gjør dem til et utmerket modell for å studere muskelfunksjon og sykdom. Mange myopatier påvirker skjelettmuskelfunksjon kan raskt og enkelt vurderes i sebrafisk i løpet av de første dagene av embryogenese. Ved 24 timer etter befruktning (HPF), hvete sebrafisk spontant kontrakt sine halen muskler og ved 48 HPF, sebrafisk utstilling kontrollert svømme atferd. Reduksjon i hyppigheten av, eller andre endringer i, kan disse bevegelsene indikere en skjelettmuskel dysfunksjon. Å analysere svømmeatferd og vurdere muskel ytelse tidlig i sebrafisk utvikling, bruker vi både berørings fremkalt rømnings respons og locomotion analyser. Touch-fremkalt rømnings respons analyser kan brukes til å vurdere muskel ytelse under korte serie bevegelser som følge av sammentrekning av raske muskelfibre. Som svar på en ekstern stimulus, som i dette tilfelle er et trykk påhodet, villtype sebrafisk 2 dager etter befruktning (DPF) vanligvis viser en kraftig utbrudd svømmetur, ledsaget av skarpe svinger. Vår metode kvantifiserer skjelettmuskelfunksjonen ved å måle maksimal akselerasjon i løpet av en burst svømming bevegelse, akselerasjon er direkte proporsjonal med kraften som produseres av muskelkontraksjon. I kontrast er locomotion analyser i løpet av tidlig sebrafisk larveutvikling brukes til å vurdere muskel ytelse under vedvarende perioder med muskelaktivitet. Ved hjelp av et sporingssystem for å overvåke svømmeatferd, får vi en automatisk beregning av hyppigheten av aktivitet og avstand i 6 dager gamle sebrafisk, gjenspeiler deres skjelettmuskelfunksjon. Målinger av svømming ytelse er verdifulle for fenotypiske vurdering av sykdomsmodeller og high-throughput screening av mutasjoner eller kjemiske behandlinger som påvirker skjelettmuskelfunksjon.

Berørings fremkalt respons analysen kan brukes til å bestemme hastigheten og akselerasjonen av svømmebevegelser som er en proporsjonal måling av muskelkraft. Som svar på en mekanisk stimulus, for eksempel en liten trykk i hodet to dpf vill type sebrafisk utstillings en rask svømming handling. Videoer ble tatt og analysert for to forskjellige sebrafisk myopati modeller: Tg (ACTA1 D286G -eGFP), en modell av nemaline myopati som har vist seg å ha betydelig muskelsvakhet, og en modell av Duchenne muskeldystrofi hvor alvorlige muskelskader har blitt beskrevet ved 5 DPF 19,20. Bilder fra en video av en typisk berøring fremkalt analysen er vist i figur 1A. Akselerasjon av sebrafisk ble undersøkt og funnet å toppnivå i løpet av den første 0,2 sek av burst svømmefluktrespons (figur 1B). Denne toppen maksimal akselerasjon gir et mål som er proporsjonalt med den kraft generating kapasiteten til skjelettmuskel. De maksimale akselerasjonsverdier ble beregnet for å oppnå en midlere maksimal akselerasjon verdi (± standardfeil av gjennomsnittet) for hver stamme: Tg (ACTA1 D286G -eGFP): middelverdi = 276,0 ± 28,8 m / sek 2, n = 3 uavhengige eksperimenter som omfatter gjentatte 15 enkeltfisk; hvete kontroll: gjennomsnitt = 500,8 ± 50,28 m / sek 2, n = 3 uavhengige replikere eksperimenter som omfatter 15 enkeltfisk; DMD PC2 - / - mutant: gjennomsnitt = 249,9 ± 19,1 m / sek 2, n = 3 uavhengige replikere eksperimenter som omfatter 12-19 enkeltfisk; DMD PC2 +/- heterozygoter: gjennomsnitt = 235,9 ± 8,7 m / sek 2, n = 3 uavhengige replikere eksperimenter som omfatter 16-27 enkeltfisk; DMD PC2 + / + hvete homozygote: gjennomsnitt = 230,9 ± 8,7 m / sek 2, n = 3 uavhengige replikere eksperimenter som omfatter 8-27 enkeltfisk (figur 1C). Som forventet, Tg (ACTA1 D286G -eGFP) fisk ble funnet å ha en betydelig reduksjon i maksimal akselerasjon som indikerer redusert muskelfunksjon, noe som er konsistent med musemodeller og pasientdata 8,21,22. DMD PC2 - / - mutant fisk imidlertid, viste ingen forskjell i maksimal akselerasjon, 2 dpf, i samsvar med deteksjon av muskeldefekter fra 3 dpf 20 (figur 1D). Bevegelse analyser ble utført ved 6 dpf for å bestemme aktiviteten og avstanden swum av sebrafisk stammer som en indikasjon på muskelytelsen. Etter testing ble en skjematisk fremstilling av svømmebevegelser over ti-minutters testperiode generert, med røde og grønne linjer som representerer perioder med langsomme og raske bevegelser henholdsvis og sorte linjer som representerer perioder uten aktivitet (figur 2). Individuell hvete sebrafisk viser høy aktivitet med relativt ingen perioder uten aktivitet som motståed å Tg (ACTA1 D286G -eGFP) fisk som er mindre aktive over testperioden (figur 2B). Svømme oppførsel ble kvantifisert ved å ta gjennomsnittet de individuelle verdier av det antall bevegelser, og avstanden swum av hver fisk (figur 3). Begge, Tg (ACTA1 D286G -eGFP) fisken (figur 3A og 3B) og DMD pc2 - / - mutant fisk (figur 3C og 3D) ble funnet å ha en betydelig reduksjon i det midlere antall bevegelser og avstand svømt i forhold til deres respektive kontroller: Tg (ACTA1 D286G -eGFP) fisk: gjennomsnittlig antall bevegelser = 94,3 ± 13,6, mener avstand svømt = 112,9 ± 18,4 mm, n = 3 uavhengige replikere eksperimenter som omfatter 45 fisk; villtype kontroller: gjennomsnittlig antall bevegelser = 177,4 ± 14,0, mener avstand svømt = 300,2 ± 22,8 mm, n = 3 uavhengige replicate eksperimenter som omfatter 45 fisk; DMD PC2 - / - mutant: gjennomsnittlig antall bevegelser = 163,3 ± 30,0, mener avstand svømt: 298,4 ± 60,37 mm, n = 3 uavhengige replikere eksperimenter som omfatter 12-20 fisk; DMD PC2 +/- heterozygoter: gjennomsnittlig antall bevegelser = 362,3 ± 38,8, mener avstand svømt: 660,3 ± 86.1mm n = 3 uavhengige replikere eksperimenter som omfatter 17-27 fisk; DMD PC2 + / + hvete homozygote: gjennomsnittlig antall bevegelser = 341,9 ± 91,6, mener avstand svømt = 574,3 ± 170.9mm n = 3 uavhengige replikere eksperimenter som omfatter 8-25 fisk. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/54431/54431fig1.jpg" /> Figur 1:. Kvantifisering av touch-fremkalle respons analyse for to DPF sebrafisk embryoer (A) Snapshot bilder av en kontroll sebrafisk under berøringsfremkalle analyser på to dpf. (B) Akselerasjon profil for den første 0,2 sek for enenkelt Tg (ACTA1 D286G -eGFP) (rød) og enkelt kontroll (blå) sebrafisk etter påføring av berørings stimulans. Den maksimale akselerasjon er representert ved de stiplede linjene. (C, D) Kvantifisering av maksimal akselerasjon (m / sek 2) registreres fra berørings fremkalte responsanalyser av (C) Tg (ACTA1 D286G -eGFP) sebrafisk og (D) DMD PC2 - / - mutant fisk sammenlignet med kontrollsebrafisk ved 2 DPF. Feilfelt representerer ± SEM for 3 replikere eksperimenter, * p &lt;0,05. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54431/54431fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54431/54431fig2.jpg" /> Figur 2:. Representasjon av locomotion analyser for sebrafisk embryo (A) sebrafisk embryoer er plassert i 48-brønners plater og bevegelse registreres ovenfra ved hjelp av et infrarødt kamera. (B) Skjematisk av sebrafisk bevegelse i løpet av testperioden med røde linjer viser raske bevegelser, grønne linjene viser langsomme bevegelser og svarte linjene viser inaktivitet (som bestemmes av deteksjonstersklene angitt i programvaren). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54431/54431fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54431/54431fig3.jpg" /> Figur 3:. Kvantifisering av locomotion analyser for 6 dpf sebrafisk larver Kvantifisering av (A) antall bevegelser og (B) avstanden som Tg (ACTA1 D286G -eGFP) sebrafisk i forhold til å kontrollere sebrafisk på 6 dpf.Kvantifisering av (C) antall bevegelser og (D) avstanden som DMD PC2 - / - mutant fisk sammenlignet med kontrollsebrafisk på 6 dpf. Feilfelt representerer ± SEM for 3 replikere eksperimenter, * p &lt;0,05, ** p &lt;0,01. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54431/54431fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish at JoVE.com

Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish

Zebrafish are an excellent model to study muscle function and disease. During early embryogenesis zebrafish begin regular muscle contractions producing rhythmic swimming behavior, which is altered when the muscle is disrupted. Here we describe a touch-evoked response and locomotion assay to examine swimming performance as a measure of muscle function.

Ved hjelp av Touch-fremkalt respons og locomotion Analyser for å vurdere muskel ytelse og funksjon i Sebrafisk

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Karakterisering av Thymus- Bosetting stamfedre i Mouse Embryo hjelp<em&gt; I Vivo</em&gt; Og<em&gt; In Vitro</em&gt; Analyser

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse av Sebrafisk Larver Skeletal Muscle Integrity med Evans blå Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Sporing celler i GFP-transgene Sebrafisk Bruke Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Acute and Chronic Models of Hyperglycemia in Zebrafish: A Method to Assess the Impact of Hyperglycemia on Neurogenesis and the Biodistribution of Radiolabeled Molecules

Akutte og kroniske modeller av hyperglykemi i sebrafisk: En metode for å vurdere virkningen av hyperglykemi på neurogenese og biodistribusjon av radiomerkede molekyler

Hyperglycemia is a major health issue that leads to cardiovascular and cerebral dysfunction. For instance, it is associated with increased neurological ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Anvendelse av kronisk stimulering å studere kontraktile aktivitet-indusert rotte Skjelettmuskel fenotypiske tilpasninger

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Celle aggregering analyser evaluere bindingen Drosophila hakket med Trans-ligander og dens hemming av Cis-ligander

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

I Vivo Avbildning av muskel-sene Morphogenesis i Drosophila Pupae

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Vurdering av oksidativ skade i primær mus okulære overflateceller / stamceller som svar på ultrafiolett-C (UV-C) skade

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Helmontering i Situ Hybridisering i sebrafisk embryoer og tube formasjonsanalyse i iPSC-ECs å studere rollen som Endoglin i vaskulær utvikling

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

High-Frequency Ultrasound Echocardiography to Assess Zebrafish Cardiac Function

Høyfrekvent ultralyd ekkokardiografi for å vurdere zebrafish hjertefunksjon

The zebrafish (Danio rerio) has become a very popular model organism in cardiovascular research, including human cardiac diseases, largely due to its ...