Name: quantitative measurement of relative retinoic acid levels in e8.5 embryos and neurosphere cultures using the f9 rare-lacz cell-based reporter assay
Uploaded: 2016-09-06T14:00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Measurement of Relative Retinoic Acid Levels in E8.5 Embryos and Neurosphere Cultures Using the F9 RARE-Lacz Cell-based Reporter Assay at JoVE.co

We would like to acknowledge Dr. Michael Wagner (SUNY Downstate Medical Center) and Ben Thiede (Dr. Jeff Corwin lab, University of Virginia) for providing us with the F9 RARE-LacZ cells and technical support. This study is funded by the New Jersey Commission on Spinal Cord Research (NJCSCR) (Grantnumber:10-3092-SCR-E-0) and the New Jersey Commission on Brain Injury Research (NJCBIR) (Grant number: CBIR13FEL006).

<ol>
	<li>Vilhais-Neto, G. C., Pourquie, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid.">Retinoic acid.</a> Curr Biol. 18 (5), R191-R192 (2008).</li><li>Drager, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signaling+in+the+functioning+brain.">Retinoic acid signaling in the functioning brain.</a> Science Signalling. 324, 1-3 (2006).</li><li>Lane, M. A., Bailey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+retinoid+signalling+in+the+adult+brain.">Role of retinoid signalling in the adult brain.</a> Prog Neurobiol. 75 (4), 275-293 (2005).</li><li>Maden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoid+signalling+in+the+development+of+the+central+nervous+system.">Retinoid signalling in the development of the central nervous system.</a> Nat Rev Neurosci. 3 (11), 843-853 (2002).</li><li>Maden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoids+and+spinal+cord+development.">Retinoids and spinal cord development.</a> J Neurobiol. 66 (7), 726-738 (2006).</li><li>Rhinn, M., Dolle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signalling+during+development.">Retinoic acid signalling during development.</a> Development. 139 (5), 843-858 (2012).</li><li>Ang, H. L., Deltour, L., Hayamizu, T. F., Zgombic-Knight, M., Duester, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+synthesis+in+mouse+embryos+during+gastrulation+and+craniofacial+development+linked+to+class+IV+alcohol+dehydrogenase+gene+expression.">Retinoic acid synthesis in mouse embryos during gastrulation and craniofacial development linked to class IV alcohol dehydrogenase gene expression.</a> J Biol Chem. 271 (16), 9526-9534 (1996).</li><li>Ang, H. L., Duester, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+premature+retinoic+acid+synthesis+in+Xenopus+embryos+following+premature+expression+of+aldehyde+dehydrogenase+ALDH1.">Stimulation of premature retinoic acid synthesis in Xenopus embryos following premature expression of aldehyde dehydrogenase ALDH1.</a> Eur J Biochem. 260, 227-234 (1999).</li><li>Bastien, J., Rochette-Egly, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+retinoid+receptors+and+the+transcription+of+retinoid-target+genes.">Nuclear retinoid receptors and the transcription of retinoid-target genes.</a> Gene. 328, 1-16 (2004).</li><li>Chatzi, C., Cunningham, T. J., Duester, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+retinoic+acid+function+during+embryonic+brain+development+using+retinaldehyde-rescued+Rdh10+knockout+mice.">Investigation of retinoic acid function during embryonic brain development using retinaldehyde-rescued Rdh10 knockout mice.</a> Dev Dyn. 242 (9), 1056-1065 (2013).</li><li>Sakai, Y., Drager, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+retinoic+acid+catabolism+with+reporter+systems+and+by+in+situ+hybridization+for+CYP26+enzymes.">Detection of retinoic acid catabolism with reporter systems and by in situ hybridization for CYP26 enzymes.</a> Methods Mol Biol. 652, 277-294 (2010).</li><li>Yamamoto, M., Drager, U. C., McCaffery, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+retinoic+acid+catabolic+enzymes+shows+high+expression+in+the+developing+hindbrain.">A novel assay for retinoic acid catabolic enzymes shows high expression in the developing hindbrain.</a> Dev Biol Res. 107, 103-111 (1998).</li><li>Rossant, J., Zirngibl, R., Cado, D., Shago, M., Giguere, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+retinoic+acid+response+element-hsplacZ+transgene+defines+specific+domains+of+transcriptional+activity+during+mouse+embryogenesis.">Expression of a retinoic acid response element-hsplacZ transgene defines specific domains of transcriptional activity during mouse embryogenesis.</a> Genes &amp; Dev. 5, 1333-1344 (1991).</li><li>Wagner, M., Han, B., Jessel, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+differences+in+retinoid+release+from+embryonic+neural+tissue+detected+by+an+in+vitro+reporter+assay.">Regional differences in retinoid release from embryonic neural tissue detected by an in vitro reporter assay.</a> Development. 116, 55-66 (1992).</li><li>Luo, T., Wagner, E., Crandall, J. E., Drager, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+retinoic-acid+critical+period+in+the+early+postnatal+mouse+brain.">A retinoic-acid critical period in the early postnatal mouse brain.</a> Biol Psychiatry. 56 (12), 971-980 (2004).</li><li>Luo, T., Wagner, E., Grun, F., Drager, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signaling+in+the+brain+marks+formation+of+optic+projections,+maturation+of+the+dorsal+telencephalon,+and+function+of+limbic+sites.">Retinoic acid signaling in the brain marks formation of optic projections, maturation of the dorsal telencephalon, and function of limbic sites.</a> J Comp Neurol. 470 (3), 297-316 (2004).</li><li>Kelley, M. W., Xu, X. M., Wagner, M. A., Warchol, M. E., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developing+organ+of+Corti+contains+retinoic+acid+and+forms+supernumerary+hair+cells+in+response+to+exogenous+retinoic+acid+in+culture.">The developing organ of Corti contains retinoic acid and forms supernumerary hair cells in response to exogenous retinoic acid in culture.</a> Development. 119, 1041-1053 (1993).</li><li>McCaffery, P., Drager, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hot+spots+of+retinoic+acid+synthesis+in+the+developing+spinal+cord.">Hot spots of retinoic acid synthesis in the developing spinal cord.</a> Proc Natl Acad Sci. 91, 7194-7197 (1994).</li><li>Hu, L., Gudas, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP+analogs+and+retinoic+acid+influence+the+expression+of+retinoic+acid+receptor+alpha,+beta,+and+gamma+mRNAs+in+F9+teratocarcinoma+cells.">Cyclic AMP analogs and retinoic acid influence the expression of retinoic acid receptor alpha, beta, and gamma mRNAs in F9 teratocarcinoma cells.</a> Mol Cell Biol. 10 (1), 391-396 (1990).</li><li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teratocarcinomas+and+mammalian+embryogenesis.">Teratocarcinomas and mammalian embryogenesis.</a> Science. 209 (4458), 768-776 (1980).</li><li>Strickland, S., Mahdavi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+induction+of+differentiation+in+teratocarcinoma+stem+cells+by+retinoic+acid.">The induction of differentiation in teratocarcinoma stem cells by retinoic acid.</a> Cell. 15 (2), 393-403 (1978).</li><li>Li, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+orphan+GPCR,+Gpr161,+regulates+the+retinoic+acid+and+canonical+Wnt+pathways+during+neurulation.">The orphan GPCR, Gpr161, regulates the retinoic acid and canonical Wnt pathways during neurulation.</a> Dev Biol. 402 (1), 17-31 (2015).</li><li>Hogan, B., Constantini, F., Lacy, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (1986).</li><li>Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+expansion,+and+differentiation+of+adult+Mammalian+neural+stem+and+progenitor+cells+using+the+neurosphere+assay.">Isolation, expansion, and differentiation of adult Mammalian neural stem and progenitor cells using the neurosphere assay.</a> Methods Mol Biol. 549, 91-101 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

خط الخلية نادر-LacZ F9 14 هو نظام قوي التي يمكن استخدامها للكشف عن التهاب المفاصل الروماتويدي التي تنتجها الأنسجة إإكسبلنتس 12،14،17،18. أنه حساس لتركيزات RA منخفضة تصل إلى 100 ​​FM، مع عدم وجود استجابة غير محددة في الكشف عن الخلايا غير المعالجة مع RA 12،14،18. وعلاوة على ذلك، فإن الخلايا مراسل تستجيب لجميع العابر RA بطريقة خطية ضمن نطاق معين من التركيز، مما يسمح للرد فعل LacZ ليكون كميا وتستخدم لتحديد حجم مستويات RA 12،14،18. مقايسة مراسل RA سريعة وسهلة المعروضة هنا يستخدم لنادر-LacZ خط الخلية مراسل F9 لتصور (الشكل 2) والقياس الكمي النسبي (الشكل 3) من الأجنة والكبار مثقف الخلايا الجذعية العصبية. هذا النظام مراسل يسمح بمقارنة مستويات RA الذاتية بين العينات الفردية، كما هو مبين في الشكل 2، وهي حساسة بما يكفي لتكون قادرة على الكشف عن التهاب المفاصل الروماتويديتولدها الأجنة الفردية E8.5 (الشكل 2A)، وكذلك التهاب المفاصل الروماتويدي التي تنتجها neurospheres مثقف (الشكل 2B). استجابة تعتمد على الجرعة من هذا الخط الخلية لتركيزات RA متفاوتة تسمح لتقدير مستويات RA (الشكل 3A) في عينات وكذلك المقارنة بين مستويات RA النسبية بين العينات (الشكل 3B). من المهم أن نلاحظ أن خط الخلية مراسل نادر F9 يقيس المبلغ الإجمالي للاتحاد الإقليمي المتولدة عن عينة من النسيج على الوقت من الحضانة. هذا هو ما يعادل صافي رصيد التوليف RA وهدم. في حين أن نادر-LacZ نظام مراسل خلية F9 حساس للغاية وتنوعا، وهناك عدة خطوات حل المشاكل الحرجة التي أدخلنا من أجل ضمان موثوقية من هذا النظام. أولا، كما هو مبين في الشكل رقم 1، من المهم للحفاظ على صحة هذه الخلايا عن طريق الممرات العادية من دون السماح لهم زصف إلى confluency. ثانيا، لقد لوحظ في وقت لاحق الممرات عادة ما ينتج عنها ردود RA متناسقة، حتى لو تم الحفاظ على الثقافات باستمرار تحت التحديد مع G418. لاستكشاف هذا، فمن المستحسن أن تجاهل الثقافات بعد 20 الممرات وذوبان الجليد قارورة جديدة. وبالإضافة إلى ذلك، يجب إجراء فحوصات منتظمة للتأكد من أن الخلايا لا تزال مراسل المستجيبين قوية على وجود التهاب المفاصل الروماتويدي في وسائل الإعلام. ثالثا، إذا عرض الممرات مبكرة الاستجابة الضعيفة أو غير موحدة إلى RA (الشكل 1B، يسار)، واحد أو عدة جولات من استنساخ فرعي قد تكون ضرورية حتى يتم الحصول على المستجيبين قوية (الشكل 1B، تي righ). وأخيرا، قبل أن تشارك في الثقافة، فمن المستحسن أن عينات الأنسجة مثل الأجنة وneurospheres يتم فصل الخلايا واحدة. وقد لاحظنا أن تفارق من نتائج العينات في القياسات اللونية أكثر اتساقا. قد يكون هذا يرجع إلى توزيع أكثر عدالة للاتحاد الإقليمي في الآبار الثقافة، كما فصل الخلايا هي في يونيشكل من أشكال الاتصال مع الخلايا المراسل. وقدمت العديد من التعديلات أيضا على بروتوكول الأصلي 14. أولا، تم كميا استجابة RA الخلايا نادر-LacZ F9 عن طريق تحديد بشكل مباشر على الخلايا وقياس الامتصاصية في 610 نانومتر بدلا من جمع الخلايا وتحليل المحللة للنشاط ب غالاكتوزيداز 14. تعديل آخر هو المباشرة ثقافة مشتركة من عينات فصلها مع F9 نادر-LacZ قبل القياس الكمي للاستجابة RA. وذكرت وسائل السابقة زرع العينات بشكل منفصل وإضافة فقط وسائل الإعلام من هذه الثقافات إلى F9 نادر-LacZ 16،18. على الرغم من كونه نظام القوية، وF9 نادر-LacZ مراسل مقايسة لديها العديد من القيود. واحد الحد من هذا الخط خلية المراسل هو أنه على الرغم من أنه يستجيب بقوة لوجود جميع العابر RA، فإنه يستجيب أيضا لأيزومرات حمض الريتينويك الأخرى بما في ذلك 9-رابطة الدول المستقلة-RA و 13 رابطة الدول المستقلة للاتحاد الإقليمي؛ ومع ذلك، فإنها هي 100 أضعاف أكثر حساسية لجميع العابر المقارنة RAالأحمر بأيسومرات أخرى 18. الحد أخرى لهذا النظام هو أن استجابة تعتمد على الجرعة الخطية يقع فقط بين 10 -13 م إلى 10 -7 M في-RA 14،18. وبالتالي، إذا بمقارنة مستويات RA خارج هذه الحدود، فإنه قد يكون من الضروري إجراء تخفيف التسلسلي للعينة حتى سقوط القياسات ضمن مجموعة خطية. وأخيرا، لأن هذا هو في المقام الأول مقايسة اللونية، ونقطة النهاية للتنمية اللون تختلف بين العينات والتجارب. وبالتالي، فمن المهم أن منحنى القياسية دائما تكون مطلية بشكل متواز لكل تجربة واحدة من أجل استخدامها لتقدير حجم خلية الرد المراسل. في الختام، لقد ذكرت استخدام خط الخلية مراسل F9 نادر-LacZ RA RA لقياس مستويات كميا في الأجنة E8.5 ووغير المبلغ عنه سابقا، في neurospheres. براعة هذا النظام المراسل قد تسمح لتقدير مستويات RA في أي خلية أو نسيج نوع تقريبا، ومعبد المنعم يوسف يؤدي إلى تطوير تطبيقات متنوعة في المستقبل.

حمض الريتينويك (RA) هو مشتق الأيض الريتينول أو فيتامين (أ) ويتم إنتاج من خلال النشاط متتابعة من عدة أنزيم نازع للهيدروجين الخلوية 1. بسبب الطبيعة الكيميائية amphiphatic، فإنه يعبر بسهولة الأغشية الدهنية ويمكن أن تكون بمثابة عامل تخلقية للذوبان 1. وهو جزيء الضروري أن ينظم العديد من العمليات الخلوية التنموية والكبار عن طريق العمل كمركز ليجند لمستقبلات ريتينويد النووية وتفعيل التعبير الجيني 2-10. دون RA، هذه المستقبلات RA (RARS) راريس ربط في الحمض النووي، وتقوم بدور repressors. RA ملزمة لهذه المستقبلات تحولهم إلى تفعيل النسخي مما أسفر عن هدف التعبير الجيني 1،5،6. على الرغم من أن مسار RA إشارات تتميز بشكل جيد، وحجم صغير (~ 300 دا) وطبيعة متقابلة الزمر للاتحاد الإقليمي يجعل التصور النسيجي المباشر وقياس RA حاليا غير مجد من الناحية الفنية 11. الطريقة الوحيدة للديرإلخ قياس مستويات RA هو من خلال عزل RA من عينات الأنسجة باستخدام عالية الأداء اللوني السائل (HPLC) 11. يتطلب هذا الأسلوب عادة كميات كبيرة من الأنسجة، ويسر عن طريق تجميع عينات مختلفة 12. وهكذا، وهذا الأسلوب هو ضعيف مناسبة لقياس مستويات RA في الأجنة الفردية أو كميات صغيرة من عينة / الأنسجة. من أجل التحقيق في وظيفة الخلايا من التهاب المفاصل الروماتويدي، وقد وضعت عدة طرق للاستدلال غير مباشر وجود التهاب المفاصل الروماتويدي. هذه الطرق الاستفادة من أنظمة مراسل تحتوي على عالية الاستجابة RAR بيتا نادر القيادة التعبير عن بيتا غالاكتوزيداز أو وسيفيراز 11،13،14. ونادر-LacZ مراسل الفئران المحورة جينيا الناتجة عن Rossant وآخرون. 13 هو النظام المثالي لتصور المناطق الزمانية المكانية للاتحاد الإقليمي إشارات في الموقع 11،13،15،16 لكن غير مناسب لقياس الكمي. وF9 خط الخلية نادر-LacZ 14، على روقال انه ومن ناحية أخرى، أمر مفيد للكشف عن التهاب المفاصل الروماتويدي والقياسات الكمية للمستويات RA في إإكسبلنتس الأنسجة 11،12،14،17،18. خلايا سرطانة مسخية F9 تعبر ألفا الذاتية وبيتا، وحمض غاما الريتينويك مستقبلات 19، والشروع التمايز إلى الأديم الجدارية بعد التعرض لالتهاب المفاصل الروماتويدي 19-21. ولطالما تم إنشاء خلايا F9 كنموذج للتمايز الخلايا التي يسببها التهاب المفاصل الروماتويدي، والذي هو السبب في اختياره كخط خلية مثالية للمقايسة مراسل RA. وسيل 15 RA خط الخلية مراسل المستمدة F9 الناتجة عن فاغنر وآخرون. 14 يحتوي على E. coli&#39;LacZ الجين المصب من نسخة واحدة من 64 شركة بريتيش بتروليوم الريتينويك عنصر استجابة حمض (نادر) من (RAR بيتا) الجينات بيتا الريتينويك البشري حمض مستقبل. من أجل تحديد والحفاظ على الحيوانات المستنسخة مستقرة، يتضمن بناء أيضا الجين أمينوغليكوزيد ناقلة الفسفات (ص الأجسام القريبة من الأرض) كعلامة اختيار في وجود G418. هذا البناء المشتركnfers التعبير محرض للب غالاكتوزيداز في وجود التهاب المفاصل الروماتويدي، والتي يمكن أن تصور من خلال تلطيخ LacZ وهذا الرد يمكن أن يكون في وقت لاحق كميا باستخدام الأساليب اللونية 11،12،14،18. وقد استخدم هذا الخط خلية مراسل متعددة للغاية على نطاق واسع في الكشف عن إنتاج RA الذاتية من خلال ثقافة مشتركة من عينات الأنسجة مع الخلايا المراسل، مثل قوقعة 17 و الجنينية إإكسبلنتس لوحة الطابق 14. وبالإضافة إلى ذلك، تم استخدام هذا الخط مراسل لتقدير مستويات RA في الحبل الشوكي النامية عن طريق زراعة أقسام المجمعة من النخاع الشوكي الجنينية بشكل منفصل وإضافة وسائل الإعلام مكيفة من هذه الثقافات إلى F9 الخلايا نادر-LacZ 18. وقد أجريت الكمي بعد LacZ تلطيخ من خلال القراءة اللونية باستخدام معيار ELISA لوحة القارئ 11،12،18. وأخيرا، تم استخدام هذا الخط الخلية مراسل في الكشف عن وجود التهاب المفاصل الروماتويدي الإنزيمات الأيضية التي كتبها monitoriالتغييرات نانوغرام في مستويات RA 12،18. نحن هنا أبلغكم أن حساسية هذا الخط خلية مراسل يسمح أيضا لقياس مستويات RA المتولدة من الأجنة E8.5 شارك مثقف الفردية. وهذا يتيح للمقارنة بين الأجنة الفردية من المورثات مختلفة. وكمثال محدد، Gpr161 هو النوع من الاختزال اليتيم الذي ينظم تكون العصيبة جزئيا من خلال RA إشارات الطريق 22، ونفيدكم باستخدام هذا الخط خلية مراسل لدراسة تأثير طفرة المتنحية في Gpr161 (Gpr161 فل) على مستويات RA الشاملة في جنين. بالإضافة إلى ذلك، فإن تعدد وسهولة في استخدام هذا النظام مراسل يسمح للحرية لقياس ومقارنة مستويات RA في عينات الأنسجة المختلفة، حتى في الثقافات neurosphere تم الحصول عليها من خلايا الجذعية في العمود الفقري الكبار. نحن هنا وصف تحديد كمية مستويات RA النسبية في الأجنة والثقافات neurosphere من خلال المباشرة ثقافة مشتركة مع F9 نادر-LacZ RA مندوبخط الخلية orter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>C3H/HeSn-Gpr161vl/J mouse strain</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>000316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F9 RARE-LacZ reporter cell line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>from Dr. Michael Wagner (SUNY Downstate Medical Center) and Ben Thiede (Dr. Jeff Corwin lab, University of Virginia)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 (with L-glutamine and HEPES)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11330-057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), qualified</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26140-079</td>
			<td>Store at -20 &#176;C in 10-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; warm in 37 C for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Store at -20 &#176;C in 10-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; light-sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10131-027</td>
			<td>Store at 4 &#176;C; light-sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Gelatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1393</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement (2 % stock solution)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Store at -20 &#176;C in 1-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; warm at room temperature for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09</td>
			<td>Prepare 100 &#956;g/ml stock solution in 0.1% bovine serum albumin (BSA) in 1X PBS; prepare working concentrations by diluting with 1X PBS; store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Fibroblast Growth Factor (FGF)-basic</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>450-33</td>
			<td>Prepare 100 &#956;g/ml stock solution in 0.1% bovine serum albumin (BSA) in 1X PBS; prepare working concentrations by diluting with 1X PBS; store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% glutaraldehyde</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M155</td>
			<td>Store at 4 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate monohydrate (C24H39NaO4 &#183; H2O)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5670</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium ferrocyanide (K&#8324;[Fe(CN)&#8326;] &#183; 3H&#8322;O)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P-9387</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium ferricyanide (K&#8323;[Fe(CN)&#8326;])</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P-8131</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-d-galactopyranoside)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3941</td>
			<td>Store stock at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>41639</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>all-trans Retinoic Acid (at-RA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R-2625</td>
			<td>Store 1 ml aliquots of stock in -80 &#176;C; extremely sensitive to light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>alternative to TrypLE Express; aliquot and store at -20 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14170-112</td>
			<td>Store at 4 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X phosphate buffered solution (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>Store at 4 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LK003176</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003703</td>
			<td>Store in 1 ml aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronic acid&#160;</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>385908</td>
			<td>Store 200 &#956;l aliquots at -20 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNaseI</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002139</td>
			<td>Store in 200 &#956;l aliquots at -20 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>K3375</td>
			<td>Store in 200 &#956;l aliquots at -20 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing container</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm culture dish (non-cell culture treated)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm culture dish (cell culture treated)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm culture dish (non-cell culture treated)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cell culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml amber microcentrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml cryovials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine surgical scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>no. 5 forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blunt-ended forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass pasteur pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alcohol lamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative measurement of relative retinoic acid levels in e8.5 embryos and neurosphere cultures using the f9 rare-lacz cell-based reporter assay

Retinoic acid (RA) is an important developmental morphogen that coordinates anteroposterior and dorsoventral axis patterning, somitic differentiation, neurogenesis, patterning of the hindbrain and spinal cord, and the development of multiple organ systems. Due to its chemical nature as a small amphipathic lipid, direct detection and visualization of RA histologically remains technically impossible. Currently, methods used to infer the presence and localization of RA make use of reporter systems that detect the biological activity of RA. Most established reporter systems, both transgenic mice and cell lines, make use of the highly potent RA response element (RARE) upstream of the RAR-beta gene to drive RA-inducible expression of reporter genes, such as beta-galactosidase or luciferase. The transgenic RARE-LacZ mouse is useful in visualizing spatiotemporal changes in RA signaling especially during embryonic development. However, it does not directly measure overall RA levels. As a reporter system, the F9 RARE-LacZ cell line can be used in a variety of ways, from simple detection of RA to quantitative measurements of RA levels in tissue explants. Here we describe the quantitative determination of relative RA levels generated in embryos and neurosphere cultures using the F9 RARE-LacZ reporter cell line.

ونادر-LacZ مراسل F9 هو الجنينية خط خلية سرطان ملتصقة نمت على سطح الجيلاتين المغلفة. وبناء مراسل يسمح للخلايا للرد كميا لRA مع الحث النسبي للبيتا غالاكتوزيداز. 11،12،14،18. هذه الخلايا عرض على التشكل الظهارية (الشكل 1A). بسبب معدل مضاعفة عالية، وينصح أن هذه الخلايا يمكن تقسيم كل 2-3 أيام في نسبة 01:10. خلال عملنا مع هذا الخط خلية المراسل، لاحظنا أنه حتى مع إضافة G418 في مستنبت، واستجابة هذه الخلايا إلى RA تضعف بعد العديد من المقاطع (الشكل 1B، يسار)، وهذا يمكن أن يؤثر على قدرة مراسل هذا خط الخلية. قد يكون راجعا إلى فقدان جزئي للالتحوير في الممرات في وقت لاحق هذا فقدان القدرة على الاستجابة. كما لا بد من هذا القبيل، استنساخ فرعي الدوري لضمان الاستجابة قوية وموحدة إلى RA (الشكل1B، يمين). في حين الاستخدامات المختلفة لهذا الخط الخلية قد نشرت سابقا 12،14-18، ذكرت هنا هو استخدام هذا الخط الخلية لقياس مستويات RA الذاتية من أجنة E8.5 الفردية مع الأنماط الوراثية المختلفة. انخفضت نتائج Gpr161 فل / فل طفرة في الاتحاد الإقليمي الجنينية يشير 22. كما يتضح من شارك في ثقافة الأجنة فصل مع خلايا نادر-LacZ F9، خفضت هذه Gpr161 فل / فل الأجنة الذاتية RA مقارنة تتزاحم البرية من نوع (الشكل 2A). ونظرا لبراعة هذا خط الخلية المراسل، كما ذكرت هنا هي رواية استخدام هذه الخلايا للكشف عن مستويات RA التي تنتجها الثقافات neurosphere تم الحصول عليها من الكبار Gpr161 وزن الفئران / وزن (الشكل 2B). وكان هذا الخط خلية مراسل قادرة على إثبات أن الثقافات neurosphere من الخلايا الجذعية في العمود الفقري للبالغين إنتاج RA الذاتية. وفرق كبيرerence في كثافة تلطيخ يشير إلى استجابة الخلية مراسل أكبر لneurospheres الحبل الشوكي مقارنة مع الأجنة E8.5. قد يكون هذا بسبب أكبر بكثير مستويات RA الناتجة عن neurospheres مع مرور الوقت مقارنة مع الأجنة E8.5، التي يمكن أن تكون يرجع ذلك إلى حقيقة أن neurosphere الثقافات هي أكثر تجانسا من الأجنة E8.5 وبالتالي تحتوي على أكثر من الخلايا RA المنتجة. إضافة تركيزات مختلفة من النتائج في-RA في رد خطي تعتمد على جرعة من الخلايا المراسل. ويمكن قياس هذا الرد colorimetrically من خلال قراءة الامتصاصية في 610 نانومتر. ويمكن بعد ذلك المنحنى القياسي المتولدة يمكن استخدامها لقياس مستويات RA في العينات، كما هو الحال في الثقافات من النوع البري neurosphere (الشكل 3A) أو الأجنة E8.5 (الشكل 3B). <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54443/54443fig1.jpg" /> الشكل 1. للصيانةenance واستنساخ فرعي من خلايا نادر-LacZ F9. (A) يظهر صورة المرحلة على النقيض من الخلايا نادر-LacZ F9. هذه الخلايا وقتا مضاعفة ~ 10 ساعة ويجب أن يتم تمرير كل 3 أيام. (ما يقرب من 70-80٪ التقاء) بنسبة 01:10 (ب) اختبار الدوري الثقافات مع اضافة 1 نانومتر في-RA وLacZ لاحق ويجب أن يتم تلطيخ لضمان بقاء الثقافات المستجيبين قوية وموحدة إلى RA (يمين). في حالة المستجيبين الفقيرة وغير موحدة (يسار)، يجب إجراء استنساخ فرعي. على نطاق ويمنع 100 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54443/54443fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54443/54443fig2.jpg" /> عينات الشكل 2. LacZ تلون المشارك مثقف (فصل E8.5 الأجنة / Neurospheres) وF9 الخلايا نادر-LacZ. (أ) الجنين E8.5 الماوس<html> تم فصلها الصورة من مختلف الأنماط الجينية ومطلي على رأس F9 الخلايا نادر-LacZ. LacZ تلطيخ 24 ساعة في وقت لاحق يسمح التصور من رد F9 الخلايا نادر-LacZ لالذاتية RA التي تنتجها عينات شارك مثقف. وGpr161 فل النتائج طفرة في الاتحاد الإقليمي الذاتية انخفضت كما تصور من قبل خفضت استجابة الخلايا مراسل (ب) نقاط. وأظهرت صورة على النقيض من المرحلة من neurospheres مثقف من الحبل الشوكي الخلايا الجذعية العصبية الكبار. حق. تم فصلها Neurospheres المستمدة من الكبار Gpr161 وزن الحبل الشوكي / وزن ومطلي على رأس F9 الخلايا نادر-LacZ. وجود راسب أزرق التالية تلطيخ LacZ تشير إلى وجود الذاتية RA في هذه neurospheres. الفرق في تلطيخ كثافة بين neurosphere والجنين E8.5 المشترك الثقافات تشير إلى مستويات أعلى من RA موجودة في neurospheres من الأجنة E8.5. على نطاق ويمنع 100 ميكرون.الهدف = &quot;_ فارغة&quot;&gt; الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/54443/54443fig3.jpg" /> الشكل 3. منحنى قياسي واللونية الكمي لمستويات RA. وكان رد LacZ نادر خط F9 خلية مراسل يمكن قياس colorimetrically في 610 نانومتر باستخدام معيار ELISA لوحة القارئ. (A) منحنى مستوى الممثل تستخدم لقياس مستويات RA النسبية لل النوع البري neurosphere ثقافة الصورة. (ب) الكمي لمستويات RA النسبية من شارك مثقف الأجنة E8.5. N = 3؛ * ف &lt;0.05، اختبار t الطالب. أشرطة الخطأ ووزارة شؤون المرأة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54443/54443fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ستوالمخازن المسيخ / حلول </td><td> مكونات </td><td> شروط التخزين </td></tr><tr><td> 10٪ deoxycholate الصوديوم مونوهيدرات (C 24 H 39 ناو 4 · H 2 O) </td><td> 10 مل في 100 مل O 2 درهم </td><td> 4 درجات مئوية </td></tr><tr><td> 1 M كلوريد المغنيسيوم (MgCl 2) </td><td></td><td> RT </td></tr><tr><td> 100X فيرو سيانيد البوتاسيوم (K 4 [الحديد (CN) 6] · 3H 6 O) </td><td> 2.12 غرام في DH 10 مل 2 O </td><td> RT في الظلام </td></tr><tr><td> 100X فيري سيانيد البوتاسيوم (K 3 [الحديد (CN) 6]) </td><td> 1.64 غرام في DH 10 مل 2 O </td><td> RT في الظلام </td></tr><tr><td> 20 ملغ / مل X-غال (5-برومو-4-كلورو-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) </td><td> إضافة 5 مل ثنائي ميثيل الفورماميد لجعل 20 ملغ / مل حل الأوراق المالية </td><td> -20 درجة مئوية </td></tr><tr><td> 10 ملم (3 ملغ / مل) كل طن تبريدالجواب حمض الريتينويك </td><td> حل 50 ملغ في 16.67 مل ايثانول المطلق. إعداد 1 مل قسامات. </td><td> -80 درجة مئوية في الظلام، في 1.5 مل أنابيب العنبر microcentrifuge ل </td></tr><tr><td> غراء </td><td> حل قنينة واحدة في 7 مل HBSS </td><td> 4 درجات مئوية </td></tr></tbody></table> الجدول 1. المخازن والحل التراكيب. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> العمل المخازن / حلول </td><td> مكونات </td><td> شروط التخزين </td></tr><tr><td> F9 نادر-LacZ خلية ثقافة المتوسط </td><td> 50 مل مصل بقري جنيني (FBS) (تركيز النهائي 10٪) </td><td> تصفية تعقيم. </td></tr><tr><td></td><td> 5 مل 100X البنسلين ستربتومايسين (نهائي اضرب 1X) </td><td> تخزين عند 4 درجات مئوية. </td></tr><tr><td></td><td> 4مل 50 ملغ / مل G418 (النهائي اضرب 0.4 ملغ / مل) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 500 مل DMEM / F-12 (مع L-الجلوتامين وHEPES) </td><td></td></tr><tr><td> 0.2٪ الجيلاتين </td><td> 25 مل 2.0٪ الجيلاتين </td><td> تخزين عند 4 درجات مئوية. </td></tr><tr><td></td><td> 80 مل من الماء المقطر </td><td></td></tr><tr><td></td><td> اخلط جيدا </td><td></td></tr><tr><td> 70٪ من الإيثانول </td><td> 30 مل 95٪ من الإيثانول </td><td> وضع في زجاجة رذاذ. </td></tr><tr><td></td><td> 70 مل من الماء المقطر </td><td> متجر في RT </td></tr><tr><td> Neurosphere التفكك المتوسطة </td><td> 1 مل 20U غراء </td><td> إعداد جديدة في كل مرة </td></tr><tr><td></td><td> 100 ميكرولتر 13 ملغ / مل التربسين </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 100 ميكرولتر 7 ملغ / مل حمض الهيالورونيك </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 28 ميكرولتر 10 ملغ / مل DNaseI </td><td></td></tr><tr><td></td><td>50 ميكرولتر 4mg / حمض kynurenic مل </td><td></td></tr><tr><td> مستنبت Neurosphere </td><td> DMEM / F-12 (مع L-الجلوتامين وHEPES) </td><td> إعداد جديدة في كل مرة </td></tr><tr><td></td><td> 2٪ الملحق B-27 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> مل 20 عامل نانوغرام / نمو الخلايا الليفية (جمعية جيل المستقبل) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 20ng عامل نمو البشرة (EGF) </td><td></td></tr><tr><td> 2.5٪ غلوتارالدهيد </td><td> 250 ميكرولتر 50٪ غلوتارالدهيد </td><td> إعداد جديدة في كل مرة </td></tr><tr><td></td><td> 4750 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X </td><td></td></tr><tr><td> LacZ محلول الغسيل </td><td> 0.5 مل 10٪ deoxycholate (اضرب النهائي 0.1٪) </td><td> تخزين عند 4 درجات مئوية. </td></tr><tr><td></td><td> 1.0 مل 100٪ NP-40 (نهائي اضرب 0.2٪) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 50 مل 10X برنامج تلفزيوني </td><td></td></tr><tr><td></td><td> الماء المقطر إلى 500 مل </td><td></td></tr><tr><td> X-غال حل تلطيخ </td><td> 1X فيرو سيانيد البوتاسيوم </td><td> إعداد جديدة في كل مرة </td></tr><tr><td></td><td> 1X فيري سيانيد البوتاسيوم </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1 ملغ / مل X-غال </td><td></td></tr><tr><td></td><td> للحجم المناسب باستخدام محلول الغسيل LacZ </td><td></td></tr><tr><td> F9 نادر-LacZ المتوسط ​​تجميد </td><td> F9 ثقافة نادر-LacZ المتوسطة + 5٪ DMSO </td><td> إعداد جديدة في كل مرة </td></tr></tbody></table> الجدول 2. المخازن العامل، والحل التراكيب.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Measurement of Relative Retinoic Acid Levels in E8.5 Embryos and Neurosphere Cultures Using the F9 RARE-Lacz Cell-based Reporter Assay at JoVE.co

Quantitative Measurement of Relative Retinoic Acid Levels in E8.5 Embryos and Neurosphere Cultures Using the F9 RARE-Lacz Cell-based Reporter Assay

Methods to accurately measure retinoic acid (RA) levels in small amounts of tissue do not exist. This protocol describes the easy, quantitative measurement of relative RA levels in E8.5 embryos and neurospheres using an RA reporter cell line.

القياس الكمي لمستويات حمض الريتينويك النسبية في E8.5 الأجنة وNeurosphere الثقافات باستخدام F9 نادر-Lacz القائم على خلية مراسل الفحص

Retinoic acid (RA) is an important developmental morphogen that coordinates anteroposterior and dorsoventral axis patterning, somitic differentiation, ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

العزل والتوسع في الخلايا الجذعية العصبية الكبار باستخدام الفحص Neurosphere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

تأسيس الخلايا الجذعية الجنينية الماوس العصبية الثقافة باستخدام الفحص Neurosphere

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

العزل والتوسع في الإنسان خلايا الورم ورم أرومي دبقي الأشكال باستخدام الفحص Neurosphere

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

مراقبة البصرية من البروتين العصبية باستخدام حمض أميني مصطنعة مشفرة وراثيا في الخلايا العصبية

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

تقييم تكوين الخلايا العصبية الابتدائية في<em&gt; القيطم</em&gt; الأجنة عن طريق المناعية

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures

الإثارة الخارجية من الخلايا العصبية باستخدام المجالات الكهربائية والمغناطيسية في واحدة والثقافات ثنائي الأبعاد

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

في نقل فيفو جين لخلايا شوان في العصب القوارض وركي من Electroporation لل

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

خلية يعيش "قياس الرائحة مستقبلات التنشيط باستخدام" مقايسة مخيم في الوقت الحقيقي

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Quantitative Measurement of &#947;-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms

Quantitative Measurement of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms

القياس الكمي لبروتين اميلويد السلائف γ-سيكريتاسي-بوساطة والانقسام الشق في لوسيفراس يستند إلى الخلية مراسل منصات المقايسة

We have developed a pair of cell-based reporter gene assays to quantitatively measure &#947;-secretase cleavage of distinct substrates. This manuscript ...

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

تحليل يستند إلى الخلية لدراسة التخليص تاو جسم بوساطة من Microglia

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...