Name: enumeration of neural stem cells using clonal assays
Uploaded: 2016-10-04T15:00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays at JoVE.com

Мы благодарим Агентство по науке, технологиям и исследованиям (A * STAR), Сингапур за финансирование этого исследования.

<ol>
	<li>Ahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+culture+of+neural+stem+cells.">The culture of neural stem cells.</a> J. Cell. Biochem. 106 (1), 1-6 (2009).</li><li>Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multipotent+EGF-responsive+striatal+embryonic+progenitor+cell+produces+neurons+and+astrocytes.">A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes.</a> J. Neurosci. 12 (11), 4565-4574 (1992).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+and+Population+Analyses+Demonstrate+That+an+EGF-Responsive+Mammalian+Embryonic+CNS+Precursor+Is+a+Stem+Cell.">Clonal and Population Analyses Demonstrate That an EGF-Responsive Mammalian Embryonic CNS Precursor Is a Stem Cell.</a> Dev. Biol. 175 (1), 1-13 (1996).</li><li>Narayanan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+mRNA+Profiling+Identifies+Progenitor+Subclasses+in+Neurospheres.">Single-Cell mRNA Profiling Identifies Progenitor Subclasses in Neurospheres.</a> Stem Cells and Dev. 21 (18), 3351-3362 (2012).</li><li>Uchida, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+isolation+of+human+central+nervous+system+stem+cells.">Direct isolation of human central nervous system stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (26), 14720-14725 (2000).</li><li>Capela, A., Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LeX/ssea-1+Is+Expressed+by+Adult+Mouse+CNS+Stem+Cells,+Identifying+Them+as+Nonependymal.">LeX/ssea-1 Is Expressed by Adult Mouse CNS Stem Cells, Identifying Them as Nonependymal.</a> Neuron. 35 (5), 865-875 (2002).</li><li>Capela, A., Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LeX+is+expressed+by+principle+progenitor+cells+in+the+embryonic+nervous+system,+is+secreted+into+their+environment+and+binds+Wnt-1.">LeX is expressed by principle progenitor cells in the embryonic nervous system, is secreted into their environment and binds Wnt-1.</a> Dev. Biol. 291 (2), 300-313 (2006).</li><li>Corti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+murine+neural+stem/progenitor+cells+based+on+Prominin-1+expression.">Isolation and characterization of murine neural stem/progenitor cells based on Prominin-1 expression.</a> Exp. Neurol. 205 (2), 547-562 (2007).</li><li>Nagato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+characterization+of+neural+stem+cells+by+flow+cytometry+analysis+using+a+combination+of+surface+markers.">Prospective characterization of neural stem cells by flow cytometry analysis using a combination of surface markers.</a> J. Neurosci. Res. 80 (4), 456-466 (2005).</li><li>Kim, M., Morshead, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Populations+of+Forebrain+Neural+Stem+and+Progenitor+Cells+Can+Be+Isolated+Using+Side-Population+Analysis.">Distinct Populations of Forebrain Neural Stem and Progenitor Cells Can Be Isolated Using Side-Population Analysis.</a> J. Neurosci. 23 (33), 10703-10709 (2003).</li><li>Murayama, A., Matsuzaki, Y., Kawaguchi, A., Shimazaki, T., Okano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+neural+stem+cells+in+the+developing+and+adult+mouse+brain.">Flow cytometric analysis of neural stem cells in the developing and adult mouse brain.</a> J. Neurosci. Res. 69 (6), 837-847 (2002).</li><li>Rietze, R. L., Valcanis, H., Brooker, G. F., Thomas, T., Voss, A. K., Bartlett, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+a+pluripotent+neural+stem+cell+from+the+adult+mouse+brain.">Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain.</a> Nature. 412 (6848), 736-739 (2001).</li><li>Tham, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CSPG+Is+a+Secreted+Factor+that+Stimulates+Neural+Stem+Cell+Survival+Possibly+by+Enhanced+EGFR+Signaling.">CSPG Is a Secreted Factor that Stimulates Neural Stem Cell Survival Possibly by Enhanced EGFR Signaling.</a> PLoS ONE. 5 (12), e15341 (2010).</li><li>Gan, H. T., Tham, M., Hariharan, S., Ramasamy, S., Yu, Y. H., Ahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+ApoE+as+an+autocrine/paracrine+factor+that+stimulates+neural+stem+cell+survival+via+MAPK/ERK+signaling+pathway.">Identification of ApoE as an autocrine/paracrine factor that stimulates neural stem cell survival via MAPK/ERK signaling pathway.</a> J. Neurochem. 117 (3), 565-578 (2011).</li><li>Ramasamy, S., Narayanan, G., Sankaran, S., Yu, Y. H., Ahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+survival+factors.">Neural stem cell survival factors.</a> Arch. Biochem. Biophys. 534 (1-2), 71-87 (2013).</li><li>Ahmed, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+and+neural+stem+cell+self-renewal,+growth+and+differentiation.">Transcription factors and neural stem cell self-renewal, growth and differentiation.</a> Cell Adh. Migr. 3 (4), 1-12 (2009).</li><li>Gritti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+Neural+Stem+Cells+Reside+into+the+Rostral+Extension+and+Olfactory+Bulb+of+Adult+Rodents.">Multipotent Neural Stem Cells Reside into the Rostral Extension and Olfactory Bulb of Adult Rodents.</a> J. Neurosci. 22 (2), 437-445 (2002).</li><li>Gritti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+and+Fibroblast+Growth+Factors+Behave+as+Mitogenic+Regulators+for+a+Single+Multipotent+Stem+Cell-Like+Population+from+the+Subventricular+Region+of+the+Adult+Mouse+Forebrain.">Epidermal and Fibroblast Growth Factors Behave as Mitogenic Regulators for a Single Multipotent Stem Cell-Like Population from the Subventricular Region of the Adult Mouse Forebrain.</a> J. Neurosci. 19 (9), 3287-3297 (1999).</li><li>Vescovi, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cloning+of+multipotential+stem+cells+from+the+embryonic+human+CNS+and+establishment+of+transplantable+human+neural+stem+cell+lines+by+epigenetic+stimulation.">Isolation and cloning of multipotential stem cells from the embryonic human CNS and establishment of transplantable human neural stem cell lines by epigenetic stimulation.</a> Exp. Neurol. 156 (1), 71-83 (1999).</li><li>Azari, H., Louis, S. A., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural-Colony+Forming+Cell+Assay:+An+Assay+To+Discriminate+Bona+Fide+Neural+Stem+Cells+from+Neural+Progenitor+Cells.">Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells.</a> J. Vis. Exp. (49), e2639 (2011).</li><li>Louis, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+Neural+Stem+and+Progenitor+Cells+in+the+Neural+Colony-Forming+Cell+Assay.">Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony-Forming Cell Assay.</a> Stem Cells. 26 (4), 988-996 (2008).</li><li>Coles-Takabe, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Don't+look:+growing+clonal+versus+nonclonal+neural+stem+cell+colonies.">Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies.</a> Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).</li><li>Mori, H., Fujitani, T., Kanemura, Y., Kino-Oka, M., Taya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observational+examination+of+aggregation+and+migration+during+early+phase+of+neurosphere+culture+of+mouse+neural+stem+cells.">Observational examination of aggregation and migration during early phase of neurosphere culture of mouse neural stem cells.</a> J. Biosci. Bioeng. 104 (3), 231-234 (2007).</li><li>Singec, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+actual+sensitivity+and+specificity+of+the+neurosphere+assay+in+stem+cell+biology.">Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology.</a> Nat. Methods. 3 (10), 801-806 (2006).</li><li>Yu, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+Visualization,+and+Molecular+Signature+of+Neural+Stem+Cells.">Purification, Visualization, and Molecular Signature of Neural Stem Cells.</a> Stem Cells and Dev. 25 (2), 189-201 (2016).</li><li>Yu, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C1qR1+is+comparable+with+LeX+and+Prom1+as+a+neural+stem+cell+marker.">C1qR1 is comparable with LeX and Prom1 as a neural stem cell marker.</a> Identification of mouse embryonic neural stem cell surface markers. , (2012).</li><li>Tham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+colony-forming+cell+assay.">Neural colony-forming cell assay.</a> A role for chondroitin sulfate proteoglycan in regulating the survival and growth of neural stem cells. , (2009).</li><li>Yuan, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Surface+Marker+Signatures+for+the+Isolation+of+Neural+Stem+Cells,+Glia+and+Neurons+Derived+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Cell-Surface Marker Signatures for the Isolation of Neural Stem Cells, Glia and Neurons Derived from Human Pluripotent Stem Cells.</a> PLoS ONE. 6 (3), e17540 (2011).</li><li>Hall, P. E., Lathia, J. D., Miller, N. G. A., Caldwell, M. A., Ffrench-Constant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+Are+Markers+of+Human+Neural+Stem+Cells.">Integrins Are Markers of Human Neural Stem Cells.</a> Stem Cells. 24 (9), 2078-2084 (2006).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

Мы опишем хи перечисление NSCs под клоновых условиях. Критические шаги включают в себя использование свежего роста и дифференциации среды НБК, а также использование свежеприготовленного раствора ФАПЧ / Laminin для покрытия камерные покровные, а также блюда культуры. Это обеспечивает оптимальный рост и дифференциацию условий жизни нейросферах. Использование хороших антител качества для эффективного обнаружения нейронов и глии, а также выборочное комплектование клональных нейросферах, которые не находятся в контакте с другими нейросферах, имеют решающее значение. Кроме того, важно обеспечить отборные нейросферы не высыхают. Рекомендуется добавить 10 мкл среды дифференцировки в каждую лунку после получения каждые 10 нейросферы. Важно, чтобы использовать один камерные покровное в одном 10-см чашку на образец, чтобы избежать взаимных помех между нейросферах из разных образцов. Если два покровные (каждая из которых содержит нейросферах из разных образцов) помещают вТе же 10 см блюдо, нейросферы из одного покровное может выпустить факторы, которые могут изменить склонность нейросферах в другом покровного дифференцироваться в специфические клоны. Два покровные в том же 10-см чашку также может привести к смеси между образцами. В случае NFU или частота НСК ниже, чем ожидалось, убедитесь, что используются с низким числом пассажей нейросферы. Кроме того, важно, что здоровые низкие нейросферы проход используются для генерации кондиционированную среду. Далее, если нейросферы культивируют в скважинах малого диаметра, например, в 96-луночного блюдо, то это будет трудно маневрировать и выбрать нейросферы с помощью микропипетки. В этом случае, передача нейросферы в большую чашку для культивирования, такие как блюдо 6-луночного, до сбора. Некоторые из отборных нейросферах может отрываться от камерно покровного во время культивирования и иммунное окрашивание. Сведение к минимуму движение камерно покровного во время культивирования, и менее интенсивное мытьеING во время иммуноокрашиванием, помогло бы избежать отряд нейросферах. Первоначальные исследования количественно NSCs с использованием только НКА 7,11,13. Тем не менее, NFA завышает частоту НСК , как оба NSCs и ранние NPs генерировать нейросферы 5. Луи и др. Разработали другой метод количественной оценки NSCs известный как NCFCA 21,22. NCFCA включает культивирование отдельных клеток в матрице на основе коллагена для обеспечения клональности, и было показано, что нейросферы выше 2 мм в диаметре образованы только NSCs. Подобно NCFCA, клональности обеспечивается на протяжении всего этого протокола. Это достигается за счет генерации нейросферы на клональной плотности и дифференциации нейросферы в камерных покровные. Использование камерных покровные дает ряд преимуществ. Камерных покровного позволяет каждый образец нейросфера дифференцировать без физического контакта с другими нейросферах образца, обеспечивая тем самым клональности во время дифференцировки.Камерные покровное может быть помещен приостановлено на дифференциации среды, чтобы позволить образец нейросферы быть постоянно кондиционером и для обеспечения максимальной дифференциации. При отсутствии кондиционированной среды и сыворотки в процессе дифференцировки, выживаемости нейросферах уменьшается, а в основном нейросферы генерировать астроциты (Тэм M и Ahmed S, неопубликованные данные). Кроме того, иммунологически нейросферы можно удобно хранить в течение длительного периода времени и камерные покровные могут быть установлены непосредственно на микроскопе предметные стекла. Кроме того, визуализация из иммуноокрашиванию нейросферах производится легко, как можно быстро найти нейросфера в малом камерные хорошо, захватить изображение, и двигаться дальше к следующей скважине. Мы определили частоту НСК в E14.5 мыши нейросфера культуры с использованием как протокол , описанный в этой рукописи 27 и NCFCA 28. Частота НСК в E14.5 нейросферах мыши определяется как мнеthods сопоставимы. NCFCA перебирает NSCs, которые мультипотентны и имеют долгосрочный потенциал самообновления. Поскольку частота NSC из нашего метода сопоставима с NCFCA, считывание из нашего протокола, кажется, не переоценивать частоту НСК. NCFCA требуется три недели, чтобы быть завершены и в основном включает в себя покрытие клеток и среднего пополнения. Протокол , описанный здесь , требуется 13 дней , чтобы выполнить и включает в себя различные серии шагов, например, нейросфера комплектование и иммунное окрашивание. Этот протокол может служить в качестве альтернативного метода для перечисления NSCs. Исследователи могут использовать как NCFCA и этот протокол для проверки частоты НСК в их образцах. Одним из ограничений этого протокола заключается в том, что ряд важных шагов должны быть все выполнены на 8-й день Методику кондиционированной среды, определение NFU образцов нейросферах и передачи образцов нейросферах к 50-а камерно покровное должны быть выполнены на дау 8. Можно было бы занять некоторое время, чтобы завершить эти шаги. Кроме того, она требует практики для выполнения этих шагов в эффективным образом. Нейросферах широко используется для изучения функции НСК и поведение. Тем не менее, нейросферы состоят из обоих NSCs и NPs. Следовательно, важно, чтобы обогатить NSCs от нейросферах для изучения NSC биологии. В настоящее время на поверхности клеток маркеры, краситель исключения собственности, а также размера клеток и зернистости, были использованы для обогащения NSCs 6,7,9-13,29,30. Этот протокол может быть использован для количественного обогащения NSCs потенциальных маркеров НСК, а также для облегчения поиска окончательного НСК маркера. Четыре недавние исследования использовали этот протокол для перечисления частоты НСК 5,14,15,26.

Нервные стволовые клетки (NSC,) являются клетки центральной нервной системы (ЦНС), что может самообновлению и мультипотентны. NSCs сначала определены в процессе развития эмбрионального переднего мозга и продолжают сохраняться в мозге взрослого в конкретных регионах, таких как субвентрикулярной зоны (SVZ) боковых желудочков и зубчатую извилину (DG) гиппокампа. Ряд NSC линий используются в клинических испытаниях для лечения инсульта и других неврологических заболеваний , таких как болезнь 1 Баттена. NSC, и нервные клетки-предшественники (NPS) размножают в культуре, как плавающий 3-мерные сфероидами структуры, называемые нейросферы. Система нейросфера культуры была разработана Рейнольдс и Weiss в начале 1990 - х годов, когда они обнаружили , что эмбриональные и взрослые корковые клетки могли бы разделить в присутствии эпидермального фактора роста (EGF) и основной фактор роста фибробластов (bFGF) 2-4. Нейросферах состоят из гетерогенной смеси Cгезов состоящие из подклассов на разных стадиях развития 5. Это является сложной задачей, чтобы конкретно изучить NSCs использованием данных, полученных из нейросферах из-за наличия NPs. Следовательно, крайне важно, чтобы обогатить NSCs от нейросферах. В настоящее время четыре основных метода были использованы для обогащения NSC , в пробирке. Во-первых, является использование маркеров клеточной поверхности. Льюис-X (LeX) и CD133 (также известный как Prominin1) являются наиболее известных на поверхности клетки маркеров НСК 6-9. Syndecan-1, Notch-1 и Интегринзависимая бета1 другие поверхностные белки , которые обогащают для NSCs 10. Во-вторых, исключение красителя. Было показано , что клетки из стороны населения, которые обладают уникальной способностью выкачать флуоресцентного ДНК-связывающий краситель Hoechst 33342, обогащены NSCs 11. В-третьих, является использование морфологического отбора. Было показано , что клетки с увеличенным размером клеток и зернистости гавани больше NSCs , чем их аналоги 5,12,13. В-четвертых, добавление НСК суrvival факторы к культуральной среде. Было показано , что добавление хондроитинсульфата протеогликанов и аполипопротеина Е повышает выживаемость NSC и , таким образом , увеличивает частоту NSC 14,15. Хотя многие маркеры , включая факторы транскрипции, были связаны с NSCs 16,17, ни один из этих маркеров не способны обогатить NSCs к чистоте. Из - за отсутствия окончательных маркеров НСК, остается проблемой для количественного определения NSCs и отличить их от NPs в пробирке. Первоначальные исследования использовали анализ формирования нейросфера (NFA) для количественного определения NSCs 7,11,13. В этом анализе, диссоциированные клетки культивируют с образованием нейросферы и количество нейросферах генерируется на каждые 100 посеянных клеток определяется. Это значение называется как формирование блока нейросфера (NFU). NFU равна частоте NSC, если все нейросферы возникают из NSCs. Тем не менее, было показано, что NFU завышенную частоту NSC, как нейросферы формируются как NSCs и раннее NPs 5. Таким образом, было бы неправильно перечислить NSCs исключительно на основе нейросфера формации. Это может быть возможным дать количественную оценку NSCs на основе их способности к самообновлению, пролиферируют интенсивно и генерировать мультипотентных нейросферы. NSCs, которые являются EGF и bFGF реагируют, как правило , выживают в течение по крайней мере десяти проходов и таким образом показывают способность обширную самообновлению в культуре 4,18-20. NPs, которые являются EGF и bFGF отзывчивым, а также, может также генерировать нейросферы за несколько проходов, но не в течение длительного периода времени. Следовательно, оно было широко признано , что добросовестные NSCs могут быть перечислены с достаточной точностью на основе нейросфера формирования , по крайней мере , десять проходов. В большинстве исследований, однако, самообновление обычно измеряется на основе формирования вторичного или третичного нейросфера вследствие длительного экспериментального времени, необходимого для десяти проходов. Следовательно, вторичное НЛА может быть использован в широком смысле сравнить ставку способность самообновленияWEEN популяции, но не может быть использован для точного перечисления частоты НСК. NSCs имеют большую пролиферативную способность по сравнению с NPs. Это свойство было использовано NSCs Луи и др. разработать метод количественного подсчета НСК - нейронную анализ клеток колониеобразующей (NCFCA) 21,22. В этом анализе, одиночные клетки культивируют в течение 3-х недель в коллагенсодержащего полутвердой матрице. В этих условиях культивирования, было показано, что клетки, которые образуют нейросферы выше 2 мм в диаметре и могут tripotent самообновлению в течение длительного срока. Эти клетки определяются как NSCs. Поэтому NSCs эффективно отличать от NPs. NSC, обладают способностью дифференцироваться в астроциты, олигодендроциты и нейроны. Для дифференциации нейросферах, факторы роста, удаляются и сыворотку добавляют к культуральной среде. Если все три нейронные родословные наблюдаются в нейросфера, то клетка, которая инициировала эту нейросфера яS НСК. Тем не менее, анализ дифференциации имеет некоторые ограничения. Во-первых, условия культивирования, используемые для дифференцировки не может быть оптимальным для генерации всех трех нейронными родословных. На самом деле, в одном процессе дифференцировки нейросфера, значительная гибель клеток происходит и в основном происходит генерация астроцитов (Tham М и Ахмеда S, неопубликованные). Во-вторых, есть вопрос о клональности. Для точного подсчета NSCs, формирования и дифференциации нейросферах должны быть выполнены в соответствии с клоновых условиях, где каждый нейросфера возникает из одной клетки. В объемных суспензионных культурах, агрегация происходит на клеточном и нейросфера уровнях 23-25. Следовательно, можно каждому нейросфера возникать из нескольких ячеек или нейросферах, что усложняет нейросфера подсчета и оценки мультипотентность. Последние данные показывают, что агрегация клеток не происходит при низкой плотности металлизации 0,5 клеток / мкл или ниже, и, когда культуральные планшеты не перемещаются во время Neuформирование rosphere 15. Таким образом, культивировании клеток при такой низкой плотности обеспечит клональности. В настоящее время NCFCA является наиболее часто используемый метод, чтобы отличить NSCs от Соседства и перечислить частоты НСК. NCFCA, однако, требует относительно длительного времени трех недель. Здесь мы опишем протокол для перечисления частоты NSC основан на способности NSC, чтобы сформировать мультипотентных нейросферы. Этот протокол занимает всего 13 дней, чтобы выполнить. NCFCA обеспечивает клональности в качестве коллагеновой матрицы предотвращает движение нейросферах. Условия культивирования, используемые в данном протоколе также позволяет клональности будет поддерживаться на протяжении. Например, использование 50-луночных камерных покровные гарантирует, что нейросферы будет дифференцироваться, не контактируя друг с другом. Кроме того, мы используем кондиционированной среды , которая поставляет нейротрофических факторов в процессе дифференциации для максимизации дифференциации потенциала нейросферах (рисунок 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml conical centrifuge tubes&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical centrifuge tubes&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml sterile syringe&#160;&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>300141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml sterile syringe&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>300144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Tuj1 IgG2a antibody&#160;</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFAP IgG antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z033401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer&#160;</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>3100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope fitted to laminar flow hood&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Marienfeld-superior</td>
			<td>1000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-O4 IgM antibody&#160;</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydromount</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>HS-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse</td>
			<td>TS100-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture dishes</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-cm culture dishes&#160;</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>150350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin film</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human epidermal growth factor (EGF)&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF)&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m filter&#160;</td>
			<td>Sartorius Stedim</td>
			<td>16534-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;0.45 &#181;m filter&#160;</td>
			<td>Sartorius Stedim</td>
			<td>16555-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 N Sodium hydroxide (NaOH)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 N Hydrochloric acid (HCl)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine (PLL)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA) powder&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA) powder&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-well chambered coverslips&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir plate with heat function&#160;</td>
			<td>Stuart</td>
			<td>UC152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23017-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x phosphate buffered saline without Ca2+ and Mg2+ (DPBS)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG2a&#160; antibody&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG antibody&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A31573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8217;,6&#8217;-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;RT1 75002383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10006021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;CO2 incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ventilated fume hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;pH meter&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enumeration of neural stem cells using clonal assays

Нервные стволовые клетки (NSCs) обладают способностью к самообновлению и генерировать три основных нервных родословных - астроциты, нейроны и олигодендроциты. NSC , и нервные клетки - предшественники (NPS), как правило , культивируют в пробирке , как нейросферах. Этот протокол подробно описывает, как определить частоту НСК в данной популяции клеток при клоновых условиях. Протокол начинается с посевом клеток при плотности, что позволяет генерировать клоновых нейросферах. В нейросферы затем переносили в камерных покровные и дифференцируются в соответствии с клоновых условиях в кондиционированной среде, которая максимизирует дифференциацию потенциал нейросферах. И, наконец, частота НСК рассчитывается на основе нейросфера формирования и мультипотентность возможностей. Утилиты этого протокола включают оценку кандидатов НСК маркеров, очистку NSCs и способность различать NSCs от NPs. Этот метод занимает 13 дней, чтобы выполнить, что значительно shorter, чем нынешние методы для перечисления частоты НСК.

Мы использовали этот протокол для оценки способности Лекси, известной клеточной поверхности НСК маркер 7, обогащать для NSCs. Данные этого исследования будут использованы для иллюстрации того, как NSCs перечислены с использованием клоновых анализов в протоколе. E14.5 нейросфера мышиные клетки инкубировали с анти-LEX антителом. Затем клетки , которые экспрессируют ЛЕКС деятельности (LEX +) и клетки , которые не экспрессируют ЛЕКС (ЛЕКС -) высевают в количестве 50 клеток / мл с помощью флуоресцентной-сортировка клеток (FACS) , и влево , чтобы генерировать клональные нейросферы в течение 1 нед. Покадровый изображений показывает , что нейросферы генерируется на 50 клеток / мл клоновая (рисунок 2). NFU для LeX + и LeX - клеток определяли. Показано , что ЛЕКС + клетки имеют значительно более высокую способность образования нейросфера по сравнению с клетками - LeX (рис 3 г). В нейросферы генерируемые затем дифференцируютсяпри клоновых условиях, впоследствии иммуноокрашиванию и образ (рис 3а-е). ЛЕКС + клетки генерируют значительно больше , чем tripotent нейросферы - LeX клетки (рис 3F). Частота НСК Затем был рассчитан на основании NFU и% от tripotent нейросферах (рис 3 г). Выбор на основе LeX, обогащают частоту НСК более чем в 14 раз, проверка ЛЕКС в качестве маркера НСК. Мы также определили частоту НСК E14.5 нейросферах мыши , используя этот протокол 27 и NCFCA 28. Оба метода сообщают сопоставимую частоту НСК около 2% в E14.5 нейросферах мыши. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/54456/54456fig1.jpg" /> Рисунок 1. Протокол нейросфера дифференцировке при клоновых условиях. Примеры нейросферы выращенные в условиях клоновых индивидуально помещают в каждую ФАПЧ / ламинин-сoated лунку 50-луночного патроннике покровное, и позволило придерживаться O / N. В тот же день, сыпучие культивированный нейросферы высевают в среде для дифференцировки в среде ФАПЧ / ламининовым покрытием 10 см чашку, и дают возможность прилипать O / N. На следующий день, кондиционированной средой от объемных культивируемых нейросферах фильтруют и помещают обратно в 10 см чашку. Образцы нейросферы переворачивают на кондиционированной среды и позволило дифференцировать в течение 3-4 дней 28. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54456/54456fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54456/54456fig1large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54456/54456fig1large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="фигура 2" src="/files/ftp_upload/54456/54456fig2.jpg" /> Рисунок 2. Рост клонального нейросфера. Клетки , полученные из E14.5 нейросферах диссоциируют и высевают в количестве 50 клеток / мл в 96-луночных блюдо. Отдельные клетки были прослежены в течение 6 дней с помощью покадровой обработки изображений. Изображения Oпе такая клетка растет в нейросфера показан. Обратите внимание, что нейросфера поддерживает клональности. (А) 0 дней; (Б) 1.19.45; (С) 2.95.37; (D) 3.32.76; (Е) 4.46.53; (Е) 5.61.44; где первое число относится ко дню, вторая цифра относится к доле дня, а третье число относится к доле ч. 10-кратным увеличением. Масштаб бар, 100 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54456/54456fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54456/54456fig2large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54456/54456fig2large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/54456/54456fig3.jpg" /> Рисунок 3. Дифференциация клоновых нейросферах и подсчет НСК частоты. Одиночные нейросферы собирали и дифференцируются в 50-хорошо патроннике покровное в течение 3 дней. Представитель образ tripotent нейросфера ГНАIned с (а) DAPI и иммунологически окрашивали для (б) GFAP, (с) Tuj1 и (d) О4. (Е) показывает накладку (а) - (г). Шкала бар, 65 мкм. (Е)% унипотентных, бипотентными и tripotent нейросферах порожденных LeX + и - LeX клеток (среднее значение ± SEM, п = 3). (Г) НСК частоты в LeX + и - LeX. Клеток , рассчитанных как произведение NFU и% от tripotent нейросферах <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54456/54456fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54456/54456fig3large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54456/54456fig3large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays at JoVE.com

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

Нервные стволовые клетки (NSCs) относятся к клеткам, которые могут самообновлению и дифференцируются в трех нейронных линий. Здесь мы опишем протокол для определения частоты НСК в данной популяции клеток с использованием нейросфера формирования и дифференциации при клоновых условиях.

Перечень нервных стволовых клеток, с помощью клоновых Assays

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Выделение и расширение взрослой мыши нервные стволовые клетки Использование Neurosphere Пробирной

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

Создание эмбриональных Мышь нейронные культуры стволовых клеток Использование Neurosphere Пробирной

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Neural-колония Формирование анализа клеточной: Пробирной различать Добросовестный нервные стволовые клетки из нервных клеток-предшественников

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Генерация нервные стволовые клетки из эмбриона человека Выкинуть корковой ткани

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Выделение и культуры нервного гребня стволовых клеток из человеческих волоса

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Выделение и культуры клеток нервного гребня из эмбриональных мышей нервной трубки

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Ф-бесплатно Вывод нервного гребня клеток-предшественников из человеческих плюрипотентных стволовых клеток

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Разработка изысканный протокола для транс склеры субретинальное трансплантации эпителиальных клеток человека пигмента сетчатки глаза крыс

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Изоляции и культуры нервных стволовых клеток эмбриона мыши

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Определение клеточных поверхностных маркеров первичных нейронных стволовых и клеток-прародителей путем метаболической маркировки сиалогликан

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...