Name: single-molecule super-resolution imaging of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the plasma membrane with novel fluorescent probes
Uploaded: 2016-10-15T13:00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes at JoVE.com

This work is supported by the National Institutes of Health (NIH) grants R01DK093953 (X.L.), P30NS069271, BRFSG-2014-07 (X.L.). C.J. is partially supported by American Heart Associate pre-doctoral fellowship (14PRE20380168, to C.J.).

The authors have nothing to disclose.

استكشاف الأخطاء وإصلاحها، تحتاج عمليتين اهتمام إضافي: إنتاج ورقة الغشاء وتثبيت عينة. كما هو موضح في البروتوكول، وفترة حضانة لل coverslips في الخطوة 1.1.6 مهم لإنتاج ورقة الغشاء. الأمثل فترة حضانة تحت ظروف تجريبية لدينا هو 7-10 دقيقة (الشكل 2). أطول من 10 دقيقة حضانة وإنتاج خلايا سليمة بدلا من صفائح الأغشية coverslips على PDL وحضانة أقصر سوف يؤدي إلى أي ورقة الغشاء على لل coverslips المغلفة PDL أقل أو. كما هو موضح في البروتوكول، ومثبتات ودرجة الحرارة أثناء تثبيت حاسمة للحفاظ على PI (4،5) ف 2 توزيع في PM. تثبيت في RT أو استخدام 4٪ -PFA وحده يمكن أن يشوه توزيع الدهون الطبيعي في PM. من خلال تطبيق PALM المجهري لغشاء البحوث الدهون، ونحن قادرون على مراقبة توزيع نطاق نانومتر من PI (4،5) ف 2، فسفوإينوزيتيد الرئيسي الذي يتوسط مأي أنشطة الخلوية الأساسية. هذا التوزيع المكاني للPI (4،5) ف 2 مع التدرجات تركيز محدودة في INS-1 خلايا يوفر إطارا لإعادة النظر في التفاعلات دهون، بروتين والأحداث الإشارات المحلية من PI (4،5) ف 2 في هذه الخلايا. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا أن تطبق الأساليب المتقدمة في هذا العمل لبحث غشاء فوسفورية أخرى مع تحقيقات سليمة، وبالتالي، توفير أدوات جديدة لدراسة phosphoinositides في العمليات البيولوجية. استخدام ورقة الغشاء في هذا العمل يتجاوز اثنين من الشواغل الرئيسية في الدراسات المورفولوجية فوسفورية: العلاج المنظفات والتلوث إشارة محتملة من العصارة الخلوية. وغالبا ما تسبب المنظفات تجميع وخسائر كبيرة في إشارة PM فوسفورية. تلوث إشارة عصاري خلوي إشكالية خاصة في حالة انخفاض phosphoinositides فرة على رئيس الوزراء 23، مثل PI (3،4،5) ف 3 و PI (3،4) ف 2. عينات ورقة غشاء قادرة على التعmvent هذه المشاكل دون تعطيل كبير الهياكل المرتبطة غشاء البلازما، مثل شبكه الأكتين القشرية وحفر المغلفة بالكلاذرين 42،43. توزيع متجانس نسبيا من PI (4،5) ف 2 في رئيس الوزراء هو في اتفاق جيد مع دراسات تجميد EM سريعة أخرى باستخدام GST-PH PLC تحقيقات δ1 في غشاء الخلايا الليفية 44. من المهم أن نلاحظ أن الظروف تجهيز العينات غير سليمة يمكن أن تولد نتائج مضللة. أولا، من المهم جدا لتنفيذ الخطوات التثبيت في انخفاض درجة الحرارة (4 درجة مئوية) واستخدام مثبت GA لإنتاج ورقة الغشاء. كما هو مبين في الشكل (3)، ودرجة الحرارة الدافئة ومنهاج العمل التثبيت دون GA لا تكفي لإصلاح phosphoinositides في الخلية PM. وهذا يمكن أن تشوه PI سليمة (4،5) ف 2 توزيع وتوليد مجموعات الحادة التي لا تراعى في الخلايا الحية في ظل الظروف الفسيولوجية. ثانيا، استخدام PAmCherry1 كماالتحقيق SMLM، بدلا من تحقيقات أخرى، أمرا حيويا من أجل التصوير PALM الكمي. صالح تطبيق PAmCherry1 تأتي من خصائصه جيدا اتسم احدة الجزيئية الصورة المادية 35،40،45، مثل السطوع، وارتفاع كفاءة الصورة تفعيل والأهم من ذلك كله، محدودة جدا الصور وامض. هذه الخصائص تمكننا من القضاء على القطع الأثرية مجموعة محتملة من الصور وامض وكميا تحليل كثافة الجزيئية من PI غشاء (4،5) ف 2. ويتميز هذا النهج أيضا حدوده. أولا، وطريقة ورقة الغشاء المستخدمة في هذه الدراسة قد لا تحاكي تماما التوزيع الفسيولوجي للPI (4،5) ف 2 لأنه عطل الخلية قبل التصوير. ومع ذلك، يظهر لدينا التصوير PALM الحية توزيع متجانس نسبيا مماثل من PI (4،5) ف 2، ودعم النتائج الملاحظة مع عينات ورقة الغشاء. ثانيا، كما ناقشنا في الأعمال السابقة لدينا 23، SMLM يتطلب خبرة التصوير وخارج فيالاحتجاز التابعة لتفادي القطع الأثرية التصوير التي قد تنشأ من عمليات مختلفة، بما في ذلك تحقيقات المستخدمة، وإعداد العينات وتثبيت، وأخذ العينات الصورة وإعادة الإعمار. وأخيرا، على الرغم من تحقيقات والأجسام المضادة على أساس المجال PH استخدمت على نطاق واسع في الدراسات فسفوإينوزيتيد 46،47 أنه لا يزال من الممكن أن ليس كل PI (4،5) ف 2 في الغشاء يمكن الكشف عن هذا النهج. على سبيل المثال، PI (4،5) ف 2 ملزمة البروتينات الذاتية أخرى قد لا تكون في متناول تحقيقات PH أو الأجسام المضادة، وهذا قد يؤدي إلى التقليل من PI (4،5) ف 2 بسبب عائق الفضاء من تحقيق ذاتها. وهناك طريقة بديلة من (4،5) ف 2 العلامات PI أن تستخدم أعلى فلور PI (4،5) P 2 48، وPI وصفت مسبقا (4،5) ف 2 التناظرية مع تعديل على ذيل الأصلي PI (4،5) ف 2. ومع ذلك، فإنه يمكن تحويلها بسرعة إلى أنواع فرعية فسفوإينوزيتيد الأخرى عن طريق سريع استقلاب الخلية الحية منذ حلقة إينوزيتول لها هي نفس endogenouالصورة PI (4،5) ف 2. وهذا يثير قلق ما إذا كان هذا المسمى قبل PI (4،5) ف 2 التناظرية في الخلايا الحية يمكن أن تمثل بأمانة PI (4،5) ف 2 بدلا من المنتجات الأيضية لها. لذلك، على الرغم من بعض القيود، تحقيقات يستند إلى مجال PH لا تزال من بين أفضل تحقيقات التي استخدمت على نطاق واسع لمراقبة PI (4،5) ف 2 توزيع وديناميكية على رئيس الوزراء من الخلايا. ويمكن تمديد تطبيقها في المستقبل من هذه المنهجية لدراسات فسفوإينوزيتيد أخرى، مثل PI (3،4،5) ف 3 و PI (3،4) ف 2. وباختصار، فإن نهج SMLM رواية المستخدمة هنا يفتح طرق جديدة لدراسة فسفوإينوزيتيد في الخلايا. باستخدام PI (4،5) ف 2 كمثال على ذلك، ونحن لشرح خصائص فريدة من نوعها من التصوير PALM في الدراسة المورفولوجية وكمية من جزيئات الغشاء الخلوي، فضلا عن عيوبها. هذا النهج يمكن أن تتكيف مع جزيئات أخرى من المصالح، وسيكون له تطبيقات واسعة في بيولوجيا الخلية.

تسهم Phosphoinositides إلى جزء صغير من الدهون الكلية الغشاء، ولكن تلعب أدوارا حاسمة في مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية. وتشمل سبعة أعضاء المستمدة من الفسفرة عكسها أو نزع الفسفات من الحلقات إينوزيتول في الثالث 3 و 4 و ال مواقف ال 5 +1. فوسفتيدلينوستول 4-الفوسفات (PI4P) وفوسفتيدلينوستول 4،5-bisphosphate (PI (4،5) ف 2) هما phosphoinositides الكبرى التي تعمل بشكل مستقل نسبيا مثل الدهون المحدد من غشاء الخلية البلازما (بعد الظهر) 2،3. فوسفتيدلينوستول (3،4،5) -trisphosphate (PIP 3) وهو أقل انتشارا بكثير من PI4P وPI (4،5) ف 2، لكنه لا يملك ظائف فريدة من نوعها في العمليات الخلوية المختلفة بما في ذلك السرطان والسكري 4 5. هذه الدهون لها التفاعلات الجزيئية المعقدة مع المؤثرات الخاصة والعديد من البروتينات الأخرى. ولذلك، من المهم أن نفهم التنظيم المكاني لهذه هواتفsphoinositides في رئيس الوزراء على مقياس متناهي الصغر. وقد أظهرت أدلة متزايدة على أن المجمعات البروتين أو الكتل جزيء في المناطق PM تقتصر يمكن أن تكون بمثابة إشارات النقاط الساخنة (6). على سبيل المثال، syntaxin 1A، وهو بروتين الرئيسي الذي ينظم الغشاء الانصهار 7-9، يعرض تنظيم العنقودية في PM. متميزة عن رأي توافقي المنظمة مجموعة من syntaxin 1A، والتوزيع المكاني للphosphoinositides في PM مثير للجدل. وتتراوح أنماط PI (4،5) ف 2 توزيع من الزي 10-12، بقع كبيرة 13،14، إلى كثيفة مجموعات 14-18، اعتمادا على أنواع الخلايا والطرق التجريبية المستخدمة. التنظيم المكاني للPI (4،5) ف 2 في دقة أعلى هو أيضا غير متناسقة. دراسة استخدام حفز الانبعاثات استنفاد (STED) المجهري 19 قد كشفت عن وجود عدد كبير من PI كثيفة (4،5) ف 2 نانو مجموعات (~ 73 نانومتر في القطر) في رئيس الوزراء ورقة من PC-12 زنزانة 20 </sتصل&gt;. هذه النتيجة مختلفة من الدراسات باستخدام المجهر سريعة تجميد الإلكترون (EM) 21،22، وهو النهج الذي يحفظ PM بنية سليمة من الخلايا الحية أفضل بكثير من التثبيت الكيميائية. وأظهر هذا الأخير حمامات متميزة من PI (4،5) ف 2. PI مركزة نسبيا (4،5) ف 2 في caveolae والمغلفة حفر وكذلك توزيع موحد على المنطقة PM مسطحة. وعلاوة على ذلك، PI النانو (4،5) ف 2 المنظمة في ورقة الغشاء قد تختلف في الخلايا الحية والثابتة. التحقيق عملنا مؤخرا هذه المسألة في الخلايا INS-1 الثابتة والعيش على حد سواء باستخدام جزيء واحد توطين المجهري (SMLM) 23. ويستند SMLM على التحول عشوائيا على مجموعة فرعية صغيرة فقط من fluorophores في أي وقت معين بحيث يمكن أن تكون مترجمة fluorophores الفردية بدقة عالية. وقد وضعت العديد من المناهج التصوير فائقة الدقة باستخدام مبادئ مماثلة لتجاوز الحد حيود المجهر الضوئي التقليدية، مثل هذاالصورة تنشيط ضوئي توطين المجهري (النخيل) 24، مضان تنشيط ضوئي توطين المجهري (FPALM) 25، ستوكاستيك إعادة البناء الضوئي المجهري (STORM) 26،27 وSTORM المباشر (dSTORM) 28. مع الصور للتحويل أو fluorophores photoactivatable (الأصباغ أو البروتينات الفلورية)، وتقنيات SMLM تسمح للعلماء للهياكل البيولوجية الصورة في قرار نانومتر 24،29،30 مع معدل الفيديو في الخلايا الحية 31،32. باستخدام PI (4،5) ف 2 كمثال على ذلك، قدمنا نهج SMLM لدراسة توزيع النانو من phosphoinositides على رئيس الوزراء. المجال PH من PLCδ1 (فسفوليباز C δ1) الذي يربط خصيصا لPI (4،5) ف 2 هو التحقيق راسخة للتصوير PI (4،5) ف 2 توزيع فرعية الخلوي وديناميات 33،34 في PM . لقد الموسومة راثيا هذا المجال مع اثنين من البروتينات الفلورية، PAmCherry1 35 و 36 iRFP </سوب&gt; لإنتاج ثنائي اللون الانصهار البروتين (iRFP-PAmCherry1-PH PLCδ1) (الشكل 1A-B). يقدم PAmCherry1 كما التحقيق photoactivatable المجال PH للنخلة ويخدم iRFP كمؤشر عام لتحديد الخلايا transfected قبل اكتساب PALM . نحن نطبق هذا ثنائي اللون الفلورسنت التحقيق للتصوير SMLM في الأوراق غشاء ثابتة. للتصوير PALM الحية، ونحن الموسومة mEOS3 37 بدلا من PAmCherry1 إلى المجال PH PLCδ1 لتوليد PLCδ1 التحقيق mEOS3.1-PH للتحسين الكفاءة الفوتون والسطوع (الشكل 1C-D). كشفت SMLM التصوير مع هذه التحقيقات الجديدة في رئيس الوزراء من إفراز الأنسولين INS-1 خلايا 38 العلامات متجانس من PI (4،5) ف 2 في معظم المناطق PM فضلا PI المركزة (4،5) ف 2 microdomains التي اختلط قليلة في PM مسطحة وبعض هياكل تشبه أرجل كاذبة خيطية 23. ثمتوزيع noscale من PI (4،5) ف 2 يوفر قاعدة الهيكلية لإعادة التفكير كيف يعمل في الخلايا الحية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="791">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microscope</td>
			<td style="width:199px;">Nikon</td>
			<td style="width:184px;">Ti-U</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sCMOS camera</td>
			<td style="width:199px;">Andor</td>
			<td style="width:184px;">Neo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spinning disk</td>
			<td style="width:199px;">Yokogawa</td>
			<td style="width:184px;">CSU X-1, 10,000 rpm&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">&#160;High Power Monolithic Laser Combiner SP with 405, 488, 561 and 642 nm lasers.</td>
			<td style="width:199px;">Agilent</td>
			<td style="width:184px;">MLC400</td>
			<td style="width:193px;">laser original powers &#38; powers at the end of optical fiber) 
			405nm: 15 mW &#38; 13 mW; 
			488nm: 45 mW &#38; 42 mW; 
			561nm: 45 mW &#38; 40 mW; 
			640nm: 35 mW &#38; 16 mW.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100X Objective</td>
			<td style="width:199px;">Nikon</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td>APO 100X Oil, NA 1.49, WD 0.12mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nikon acquisition and analysis software(NIS Element)</td>
			<td style="width:199px;">Nikon</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Matlab</td>
			<td style="width:199px;">MathWorks</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Coverslip</td>
			<td style="width:199px;">Warner</td>
			<td style="width:184px;">64-0714</td>
			<td>Round 18mm coverslip, #1.5&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:199px;">Millipore</td>
			<td style="width:184px;">FC010-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Lipofectamin 3000(transfection reagent)</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:184px;">L3000-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:199px;">Electron Microscopy Science</td>
			<td style="width:184px;">#16120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PI(4,5)P2 1st antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-53412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">secondary antibody&#160; F(ab&#8217;)2-goat-anti-mouse Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen</td>
			<td>A-21237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tetraspeck beads</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:184px;">T7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">magnetic quick release imaging chamber&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:184px;">Cat#641994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">temperature controller</td>
			<td style="width:199px;">Warner Instruments</td>
			<td>TC-344C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phosphate buffer saline</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EGTA</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:184px;">3780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NH4Cl</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">A0171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Goat serum</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">bovine serum albumin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CaCl2*2H2O</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:184px;">223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MgCl2*6H2O</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraformaldyhyde</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule super-resolution imaging of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the plasma membrane with novel fluorescent probes

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a determinant phosphoinositide of the plasma membrane (PM), and it is required to modulate ion channels, actin dynamics, exocytosis, endocytosis, intracellular signaling, and many other cellular processes. However, the spatial organization of PI(4,5)P2 in the PM is controversial, and its nanoscale distribution is poorly understood due to the technical limitations of research approaches. Here by utilizing single molecule localization microscopy and the Pleckstrin Homology (PH) domain based dual color fluorescent probes, we describe a novel method to visualize the nanoscale distribution of PI(4,5)P2 in the PM in fixed membrane sheets as well as live cells.

حالة عدم اليقين التعريب (σ) من نظام فائقة قرارنا هو 14.73 نانومتر 23. أظهرت مقارنات مباشرة بين TIRF والصور PALM تحسن كبير من القرار المكانية. ويبين الشكل 3A-B المعهد البترولي التمثيلي (4،5) ف 2 صور TIRF المسمى مع PI (4،5) ف 2 الأجسام المضادة وiRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 في أوراق غشاء النموذجية والخلايا الحية. الصور مع المجهر TIRF التقليدية في صفائح الأغشية وتتماثل مع تلك الموجودة في الخلايا الحية سليمة المسمى مع تعزيز البروتين مضان أخضر (EGFP) الموسومة المجالات PH (EGFP-PH PLCδ1) (الشكل 3C). أظهرت جميع العينات حتى توزيع تحقيقات. في المقابل، أدى تثبيت غير الأمثل للعينات في PI الكثيف الحاد (4،5) ف 2 مجموعات وانخفاض في كثافة إشارة (الشكل 4). في ظل ظروف التثبيت الأمثل، روقال انه صور فائقة الدقة من PI (4،5) ف 2 في الخلايا الثابتة (الشكل 5) كشف توزيع متجانس للتحقيقات في جزء كبير من رئيس الوزراء فقط مع التدرجات تركيز محدودة. بعض بقع غشاء المخصب مع PI (4،5) ف 2 تحقيقات وزعت قليلة، وكان أحجام مختلفة. عرض الخلية الحية PALM الصور التوزيع المكاني مماثلة لخلايا ثابتة (الشكل 6). تحليل مفصل لPI (4،5) ف 2 إشارات حول نتائج الوقت في ديناميكية سريعة في المناطق المحلية، من دون تغييرات كبيرة وفرة في مجالات واسعة. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig1.jpg" /> الشكل 1. مخطط لتحقيقات الفلورسنت المستخدمة في هذه الدراسة. (AB) iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 التحقيق المستخدمة في التجارب ورقة غشاء ثابتة. أثناء التصوير TIRF التقليدي (A)، ونانومتر 640<html> يستخدم الليزر لإثارة iRFP (مثال: 692 نانومتر. إم: 713 نانومتر). TIRF الصورة التي اتخذت في هذه الحالة بمثابة صورة TIRF إشارة للتصوير فائقة الدقة التي تم الحصول عليها بواسطة التصوير PALM (B). ويستخدم الليزر 405 نانومتر إلى الصور تفعيل fluorophore PAmCherry1 ويستخدم ليزر 561 نانومتر لإثارة PAmCherry1 (مثال: 564 نانومتر. إم: 595 نانومتر) لتصوير النخلة. (CD) mEos3.1-PH PLCδ1 التحقيق المستخدمة في التجارب الخلية الحية. (C) أثناء التصوير TIRF التقليدية، يتم استخدام الليزر 488 نانومتر لإثارة mEOS3.1 (مثال: 506 نانومتر. إم: 519 نانومتر). (D) بعد photoconversion بواسطة الليزر 405 نانومتر، mEos3.1 يتحول إلى شكل أحمر (مثال: 573 نانومتر. إم: 584 نانومتر). والليزر 561 نانومتر يستخدم لعمليات الاستحواذ PALM <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> ق / ftp_upload / 54466 / 54466fig2.jpg &quot;/&gt; الشكل 2. مخطط لإعداد ورقة الغشاء من INS-1 الخلايا. (A) ضع ساترة مع الخلايا المستزرعة لأسفل على ساترة المغلفة PDL والانتظار لمدة 7 ~ 10 دقيقة على 4 درجات مئوية للسماح مرفق الخلية إلى PDL- ساترة المغلفة. (ب) انزع ساترة أعلى مع ملاقط وإصلاح ورقة الغشاء تعلق على PDL ساترة قبل المغلفة. (C) صورة العينات مع TIRFM والنخيل. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig3.jpg" /> الشكل 3. PI (4،5) ف 2 التنظيم المكاني مشابه بين صفائح الأغشية والخلايا الحية سليمة تحت المجهر TIRF التقليدية. (أ)صورة TIRF نموذجية من صفائح الأغشية ثابتة عند 4 درجات مئوية مع PFA 4٪ و 0.2٪ GA. وصفت PI (4،5) ف 2 مع PI (4،5) ف 2 الأجسام المضادة المحددة. (ب) ورقة غشاء من الخلية INS-1 التعبير عن iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1. صورة (C) TIRF اثنين من الخلايا الحية سليمة معربا عن EGFP-PH PLCδ1 على مختلف المستويات. أشرطة النطاق: (أ): 3 ميكرون. (ب) و (ج): 5 ميكرون <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig4.jpg" /> الشكل 4. PI (4،5) ف 2 التنظيم المكاني في ورقة غشاء حساس للشروط التثبيت المشتركة. (A) ورقة غشاء ثابتة عند 37 درجة مئوية مع 4٪ PFA وحدهوصفت مع PI (4،5) ف 2 الأجسام المضادة المحددة (كما في الشكل 3A). ورقة (ب) غشاء ثابتة في RT مع PFA وحده، وصفت مع PI (4،5) ف 2 الأجسام المضادة المحددة. لاحظ أن مجموعات كثيفة من PI (4،5) ف 2 تحقيقات واضحة للعيان تحت المجهر TIRF، وعلى النقيض من أكثر من ذلك بكثير حتى الصور مضان هو مبين في الشكل 3A. أشرطة النطاق: AB: 3 ميكرون <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig5.jpg" /> الرقم 5. PALM التصوير من PI (4،5) ف 2 تحقيقات تكشف توزيع مقياس متناهي الصغر في لPM INS-1 الخلية. (أ) صورة iRFP TIRF من ورقة الغشاء من خلية INS-1 التعبير عن iRFP-PAmCherry1-PH المجلس التشريعي الفلسطينيδ1. (ب) الموافق صورة كف PM في نفس المنطقة على أساس إعادة الإعمار إشارة PAmCherry1. لاحظ PI متجانس (4،5) ف 2 التوزيع المكاني في PM المناطق الرئيسية وعدد من PI (4،5) ف 2 microdomains. (C) وجهة نظر الموسع المنطقة محاصر في (ب). السهام تشير زعت قليلة PM microdomains المخصب مع PI (4،5) ف 2 تحقيقات. أشرطة النطاق: A و B: 3 ميكرون؛ C: 500 نانومتر. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (6)" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig6.jpg" /> الشكل التصوير 6. النخيل في حي خلايا INS-1. (أ) صورة TIRF من PI (4،5) ف 2 في حي خلية INS-1 التعبير عن mEos3.1-PH PLCδ1. تم الحصول على صورة بسرعة في القناة الخضراء قبل اكتساب نخلة (35 درجة مئوية). (ب) متتابعة الخلية الحية الصور PALM في 10 فترة ثانية. تظهر الأشكال لمحات كثافة PI المحلي (4،5) ف 2 الكثافة على نفس خط مستقيم 1 موقف في أوقات مختلفة في (ب) و (ج). ملاحظة التغييرات كثافتها كبيرة المحلية في غضون 10 ثانية. (د) وقت مسار متوسط تغيرات كثافة PI (4،5) ف 2 في منطقة واسعة (box2، 3X3 ميكرون)، ودوائر صغيرة (3، 4، و 5، و 500 نانومتر قطر) في (ب) خلال 5 دقيقة من التصوير PALM (إطار / 10 ثانية). ملاحظة التقلبات كثافة السريع لPI المحلي (4،5) ف 2 المسابير (دائرة 3 و 4 و 5) بالمقارنة مع تغييرات طفيفة جدا في منطقة واسعة (مربع 2). الصور (E) الموسع PALM المنطقة box2 في الفقرة (ب) في بعض الأحيان المشار إليها. تشير الأسهم PI (4،5) ف 2 المخصب بقع غشاء تحت عشروط hysiological. أشرطة النطاق: C: 3 ميكرون، E: 500 نانومتر. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes at JoVE.com

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

PI (4،5) ف 2 تنظم مختلف الوظائف الخلوية، ولكن من المفهوم منظمة النانوية في غشاء الخلية البلازما سيئة. بوصف PI (4،5) ف 2 مع التحقيق الذي تجريه الفلورسنت ثنائي اللون تنصهر إلى المجال Pleckstrin التماثل، ونحن تصف نهجا جديدا لدراسة PI (4،5) ف 2 التوزيع المكاني في غشاء البلازما على مقياس متناهي الصغر .

جزيء واحدة سوبر قرار تصوير فوسفتيدلينوستول 4،5-bisphosphate في غشاء البلازما مع رواية المسابر نيون

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب<em&gt; في المختبر</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

عالية الدقة حنق في مستوى جزيء واحد لجزيء الجزيئي تحديد هيكل

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

التلاعب جزيء واحد من كوادروبليكسيس ز بملاقط مغناطيسية

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

استخدام ألوان جزيء واحد الحنق لدراسة الترابط بين تفاعلات البروتين

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

قياس الإلكترون غشاء البلازما عبر النقل بواسطة ميوتوبيس C2C12

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

تجميد التساهمية من البروتينات للتحليل الطيفي قوة جزيء واحد

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

تحديد كمية البروتين على نطاق المنظومة وسم التجانس على مستوى جزيء واحد

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

مجهريتتبع جزيء واحد - أداة لتحديد الدول المنافية للجزيئات الخلوية

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

التفاعلات مع وغشاء التغلغل من الميتوكوندريا الدماغ بواسطة ألياف الليفية اميلويد

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

إنتاج Dynein و Kinesin موتور الفرق علي الحمض النووي اوريغامي النانو لرصد جزيء واحد

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...