Name: single-molecule super-resolution imaging of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the plasma membrane with novel fluorescent probes
Uploaded: 2016-10-15T13:00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes at JoVE.com

This work is supported by the National Institutes of Health (NIH) grants R01DK093953 (X.L.), P30NS069271, BRFSG-2014-07 (X.L.). C.J. is partially supported by American Heart Associate pre-doctoral fellowship (14PRE20380168, to C.J.).

The authors have nothing to disclose.

झिल्ली शीट उत्पादन और नमूना निर्धारण: समस्या निवारण के लिए, दो प्रक्रियाओं के अतिरिक्त ध्यान देने की जरूरत है। प्रोटोकॉल में वर्णित है, कदम 1.1.6 में coverslips के ऊष्मायन समय झिल्ली शीट उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण है। हमारे प्रयोगात्मक शर्त के तहत इष्टतम ऊष्मायन समय 7-10 मिनट (चित्रा 2) है। 10 मिनट ऊष्मायन की तुलना में अब कम या पीडीएल लेपित coverslips पर कोई झिल्ली शीट को बढ़ावा मिलेगा पीडीएल coverslips और कम ऊष्मायन पर झिल्ली शीट के बजाय बरकरार कोशिकाओं का उत्पादन होगा। प्रोटोकॉल में वर्णित है, नियतन के दौरान fixatives और तापमान पीआई (4,5) प्रधानमंत्री में पी 2 वितरण को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हैं। आरटी पर निर्धारण या अकेले 4% -PFA के उपयोग के प्रधानमंत्री में सामान्य लिपिड वितरण बिगाड़ना सकता है। लिपिड अनुसंधान झिल्ली को पाम माइक्रोस्कोपी लागू करके, हम पीआई के नैनोमीटर पैमाने पर वितरण का निरीक्षण करने में सक्षम हैं (4,5) पी 2, एक प्रमुख phosphoinositide कि मीटर मध्यस्थताकिसी भी मौलिक सेलुलर गतिविधियों। इस स्थानिक आईएनएस-1 कोशिकाओं में सीमित एकाग्रता ढ़ाल के साथ की पीआई (4,5) पी 2 वितरण लिपिड, प्रोटीन बातचीत और पीआई (4,5) इन कोशिकाओं में पी 2 के स्थानीय संकेत घटनाओं पुनर्विचार के लिए एक रूपरेखा प्रदान करता है। इसके अलावा, इस काम में विकसित तरीकों में भी अन्य झिल्ली फॉस्फोलिपिड अनुसंधान करने के लिए उचित जांच के साथ जैविक प्रक्रियाओं में phosphoinositides का अध्ययन करने के उपन्यास उपकरणों की पेशकश लागू किया जा सकता है, जिससे,। डिटर्जेंट उपचार और cytosol से संभावित संकेत संदूषण: इस काम में झिल्ली पत्रक के उपयोग फॉस्फोलिपिड रूपात्मक अध्ययन में दो प्रमुख चिंताओं को नजरअंदाज। डिटर्जेंट अक्सर क्लस्टरिंग और प्रधानमंत्री फॉस्फोलिपिड संकेत के महत्वपूर्ण नुकसान का कारण। साइटोसोलिक संकेत के प्रदूषण को इस तरह के पीआई (3,4,5) पी 3 और पीआई (3,4) पी 2 के रूप में प्रधानमंत्री 23 पर कम बहुतायत phosphoinositides के मामले में विशेष रूप से समस्याग्रस्त है। झिल्ली पत्र के नमूने circu करने में सक्षम हैंकाफी ऐसे cortical actin meshwork और क्लैथ्रिन लेपित गड्ढ़े 42,43 के रूप में प्लाज्मा झिल्ली के साथ जुड़े संरचनाओं, बाधा पहुँचा के बिना इन समस्याओं mvent। प्रधानमंत्री के पीआई (4,5) पी 2 रिश्तेदार समरूप वितरण अन्य जल्दी ठंड ईएम fibroblast झिल्ली 44 में जीएसटी पीएच पीएलसी δ1 जांच का उपयोग पढ़ाई के साथ अच्छे समझौते में है। यह नोट करना अनुचित नमूना प्रसंस्करण की स्थिति भ्रामक परिणाम उत्पन्न कर सकते हैं कि महत्वपूर्ण है। सबसे पहले, यह एक कम तापमान (4 डिग्री सेल्सियस) पर निर्धारण चरणों का प्रदर्शन और झिल्ली शीट उत्पादन के लिए लगानेवाला जीए का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। के रूप में 3 चित्र में दिखाया, गर्म तापमान और पीएफए निर्धारण जीए बिना सेल PM में phosphoinositides ठीक करने के लिए पर्याप्त नहीं है। यह बरकरार पीआई (4,5) पी 2 वितरण बिगाड़ना और तेज समूहों कि जीवित कोशिकाओं में शारीरिक शर्तों के तहत नहीं मनाया जाता है उत्पन्न कर सकता है। दूसरा, PAmCherry1 के उपयोग के रूप मेंSMLM जांच, बल्कि अन्य जांच की तुलना में, मात्रात्मक पाम इमेजिंग के लिए निर्णायक है। PAmCherry1 आवेदन के लाभ के इस तरह चमक, उच्च फोटो सक्रियण दक्षता और सभी के अधिकांश, बहुत सीमित तस्वीर-निमिष के रूप में अपनी अच्छी तरह से विशेषता एकल आणविक तस्वीर-भौतिक गुणों 35,40,45, से आता है। इन गुणों तस्वीर-निमिष से संभावित क्लस्टर कलाकृतियों को खत्म करने और मात्रात्मक झिल्ली पीआई (4,5) पी 2 की आणविक घनत्व का विश्लेषण करने के लिए सक्षम करें। यह दृष्टिकोण भी अपनी सीमाएं हैं। सबसे पहले, झिल्ली पत्र इस अध्ययन में इस्तेमाल विधि पूरी तरह से पीआई (4,5) पी 2 शारीरिक वितरण क्योंकि सेल इमेजिंग से पहले बाधित है की नकल नहीं कर सकते। हालांकि, हमारे जीने पाम इमेजिंग, के पीआई (4,5) पी 2 समान अपेक्षाकृत सजातीय वितरण से पता चलता झिल्ली पत्र के नमूनों के साथ मनाया परिणामों का समर्थन। दूसरा, के रूप में हम हमारे पिछले काम 23 में चर्चा की, SMLM इमेजिंग विशेषज्ञता और अतिरिक्त आवश्यकता परtention इमेजिंग कलाकृतियों कि प्रयोग किया जाता जांच, नमूना तैयार करने और निर्धारण, छवि नमूना और पुनर्निर्माण सहित विभिन्न प्रक्रियाओं, से पैदा हो सकता है से बचने के लिए। अन्त में, हालांकि पीएच डोमेन आधारित जांच और एंटीबॉडी व्यापक रूप से phosphoinositide अध्ययनों 46,47 में इस्तेमाल किया गया है कि यह संभव नहीं है कि सभी रहता है पीआई (4,5) झिल्ली में पी 2 इस दृष्टिकोण से पता लगाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, पीआई (4,5) पी 2 अन्य अंतर्जात प्रोटीन से बंधे पीएच जांच या एंटीबॉडी के लिए सुलभ नहीं हो सकता है, और यह खुद को जांच के अंतरिक्ष बाधा के कारण पीआई (4,5) पी 2 के एक मूल्यवान समझना के कारण हो सकता है। लेबलिंग पीआई (4,5) पी 2 का एक वैकल्पिक तरीका मूल की पूंछ पर एक संशोधन के साथ उपयोग किया जाएगा शीर्ष-स्त्राव पीआई (4,5) पी 2 48, एक पूर्व लेबल पीआई (4,5) पी 2 एनालॉग पीआई (4,5) पी 2। हालांकि, यह तेजी से जीवित कोशिका चयापचय द्वारा अन्य phosphoinositide उपप्रकारों में तेजी से परिवर्तित किया जा सकता है, क्योंकि इसकी inositol अंगूठी endogenou रूप में ही हैएस पीआई (4,5) पी 2। यह चिंता का विषय है कि क्या जीवित कोशिकाओं में इस पूर्व लेबल पीआई (4,5) पी 2 अनुरूप ईमानदारी से प्रतिनिधित्व कर सकते हैं पीआई (4,5) पी 2 के बजाय अपने चयापचय उत्पादों को उठाती है। इसलिए, कुछ सीमाओं के बावजूद, पीएच डोमेन आधारित जांच अभी भी सबसे अच्छा है कि व्यापक रूप से जांच पीआई (4,5) पी 2 वितरण और पर कोशिकाओं के प्रधानमंत्री गतिशीलता की निगरानी करने के लिए इस्तेमाल किया गया शामिल हैं। इस पद्धति के भविष्य के आवेदन ऐसे पीआई (3,4,5) पी 3 और पीआई (3,4) पी 2 के रूप में अन्य phosphoinositide अध्ययन, के लिए बढ़ाया जा सकता है। सारांश में, उपन्यास SMLM यहां इस्तेमाल किया दृष्टिकोण कोशिकाओं में phosphoinositide अध्ययन करने के लिए नए तरीके खोलता है। एक उदाहरण के रूप पीआई (4,5) पी 2 का उपयोग करना, हम कोशिका झिल्ली के अणुओं की रूपात्मक और मात्रात्मक अध्ययन में पाम इमेजिंग का अद्वितीय गुण, साथ ही अपनी कमियां प्रदर्शित करता है। इस दृष्टिकोण के हितों के अन्य अणुओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और कोशिका जीव विज्ञान में व्यापक आवेदन करना होगा।

Phosphoinositides कुल झिल्ली लिपिड के एक छोटे से हिस्से के लिए योगदान है, लेकिन सेलुलर प्रक्रियाओं की एक किस्म में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। वे सात सदस्यों 3 आरडी पर प्रतिवर्ती फोस्फोराइलेशन या inositol के छल्ले के dephosphorylation से निकाली गई, 4 वें और 5 वें स्थान 1 शामिल हैं। Phosphatidylinositol 4-फॉस्फेट (PI4P) और phosphatidylinositol 4,5-बाइफोस्फेट (पीआई (4,5) पी 2) दो प्रमुख phosphoinositides कि अपेक्षाकृत स्वतंत्र रूप से कार्य सेल प्लाज्मा झिल्ली (प्रधानमंत्री) 2,3 के निर्धारक लिपिड के रूप में कर रहे हैं। Phosphatidylinositol (3,4,5) -trisphosphate (रंज 3) बहुत कम PI4P और पीआई (4,5) पी 2 की तुलना में प्रचुर मात्रा में है, लेकिन यह कैंसर और मधुमेह 4 5 सहित विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं में अद्वितीय कार्य किया है। ये लिपिड उनकी प्रभावोत्पादक और कई अन्य प्रोटीन के साथ जटिल आणविक बातचीत की है। इसलिए, यह इन फोटो के स्थानिक संगठन को समझने के लिए महत्वपूर्ण हैnanometer पैमाने पर प्रधानमंत्री में sphoinositides। बढ़ते सबूत से पता चला है कि प्रोटीन परिसरों या सीमित PM क्षेत्रों में अणु समूहों के आकर्षण के केंद्र 6 संकेत के रूप में सेवा कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, syntaxin 1 ए, एक महत्वपूर्ण प्रोटीन है कि झिल्ली संलयन 7-9 नियंत्रित करता है, प्रधानमंत्री में क्लस्टर संगठन को प्रदर्शित करता है। syntaxin 1 ए का क्लस्टर संगठन का सर्वसम्मत विचार से अलग, प्रधानमंत्री में phosphoinositides के स्थानिक वितरण विवादास्पद है। पीआई (4,5) पी 2 वितरण पैटर्न वर्दी 10-12, बड़े पैच 13,14 से लेकर, समूहों 14-18, सेल प्रकार पर निर्भर करता है और प्रायोगिक तरीकों का इस्तेमाल किया घने। उच्च संकल्प पर की पीआई (4,5) पी 2 स्थानिक संगठन भी असंगत है। उत्तेजित उत्सर्जन कमी का उपयोग कर एक अध्ययन (STED) माइक्रोस्कोपी 19 घने पीआई (4,5) पी 2 नैनो-समूहों की एक बड़ी संख्या से पता चला है (~ व्यास में 73 एनएम) पीसी -12 कोशिकाओं 20 के प्रधानमंत्री शीट में </s&gt; अप। यह परिणाम जल्दी ठंड इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) 21,22, एक दृष्टिकोण है कि जीवित कोशिकाओं के बरकरार PM संरचना ज्यादा रासायनिक निर्धारण की तुलना में बेहतर बरकरार रखता का उपयोग अध्ययन से अलग है। बाद के पीआई (4,5) पी 2 के अलग ताल से पता चला है; अपेक्षाकृत केंद्रित पीआई (4,5) caveolae और लेपित गड्ढों में पी 2 के साथ ही फ्लैट PM क्षेत्र पर समान वितरण। इसके अलावा, nanoscale पीआई (4,5) पी झिल्ली शीट में 2 संगठन रहते हैं और तय कोशिकाओं में अलग हो सकता है। हमारे हाल ही में काम एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (SMLM), 23 का उपयोग करते हुए दोनों तय की और रहते आईएनएस-1 कोशिकाओं में इस मुद्दे की जांच की। SMLM प्रसंभात्य किसी भी समय में केवल fluorophores के एक छोटे सबसेट पर स्विच इतना है कि व्यक्ति fluorophores उच्च परिशुद्धता के साथ अनुवादित किया जा सकता है पर आधारित है। कई सुपर संकल्प इमेजिंग दृष्टिकोण समान सिद्धांतों का उपयोग पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी के विवर्तन सीमा पार करने के लिए विकसित किया गया है, इस तरह के एकएस photoactivation स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम), 24, प्रतिदीप्ति photoactivation स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (FPALM) 25, स्टोकेस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (तूफान) 26,27 और प्रत्यक्ष तूफान (dSTORM) 28। फोटो-switchable या photoactivatable fluorophores (रंगों या फ्लोरोसेंट प्रोटीन) के साथ, SMLM तकनीक जीवित कोशिकाओं 31,32 में नैनोमीटर संकल्प 24,29,30 वीडियो-दर के साथ छवि जैविक संरचनाओं के लिए वैज्ञानिकों को अनुमति देते हैं। एक उदाहरण के रूप पीआई (4,5) पी 2 का उपयोग करना, हम पर प्रधानमंत्री phosphoinositides के nanoscale वितरण का अध्ययन करने के SMLM दृष्टिकोण पेश किया। PLCδ1 (phospholipase सी δ1) है कि विशेष रूप पीआई के लिए बांध का पीएच डोमेन (4,5) पी 2 PM में इमेजिंग पीआई (4,5) पी 2 उप सेलुलर वितरण और गतिशीलता 33,34 के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित है जांच । हम आनुवंशिक रूप से दो फ्लोरोसेंट प्रोटीन, PAmCherry1 35 और 36 iRFP के साथ इस डोमेन टैग </sup&gt; एक दोहरी रंग संलयन प्रोटीन (iRFP-PAmCherry1-पीएच PLCδ1) का उत्पादन करने के लिए (चित्रा 1 ए-बी)। PAmCherry1 पाम के लिए शारीरिक रूप से विकलांग डोमेन के photoactivatable जांच के रूप में कार्य करता है और iRFP एक सामान्य सूचक पाम अधिग्रहण से पहले ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की पहचान के रूप में कार्य । हम निश्चित झिल्ली शीट में SMLM इमेजिंग के लिए यह दोहरी रंग फ्लोरोसेंट जांच लागू होते हैं। लाइव पाम इमेजिंग के लिए, हम mEOS3 37 के बजाय PAmCherry1 टैग की पीएच PLCδ1 डोमेन के लिए अपनी बेहतर फोटॉन दक्षता और चमक (चित्रा 1 सी-डी) के लिए mEOS3.1-पीएच PLCδ1 जांच उत्पन्न करने के लिए। इंसुलिन स्रावित आईएनएस-1 कोशिकाओं 38 के पीएम इन उपन्यास जांच के साथ SMLM इमेजिंग पीआई (4,5) प्रधानमंत्री क्षेत्रों के बहुमत में पी 2 के साथ ही केंद्रित पीआई (4,5) पी 2 के सजातीय लेबलिंग का पर्दाफाश किया है microdomains कि कम फ्लैट प्रधानमंत्री और कुछ filopodia संरचनाओं की तरह 23 में intermixed रहे हैं। फिर एकके पीआई (4,5) पी 2 noscale वितरण पुनर्विचार यह कैसे जीवित कोशिकाओं में कार्यों के लिए एक संरचनात्मक आधार देता है।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="791">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microscope</td>
			<td style="width:199px;">Nikon</td>
			<td style="width:184px;">Ti-U</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sCMOS camera</td>
			<td style="width:199px;">Andor</td>
			<td style="width:184px;">Neo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spinning disk</td>
			<td style="width:199px;">Yokogawa</td>
			<td style="width:184px;">CSU X-1, 10,000 rpm&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">&#160;High Power Monolithic Laser Combiner SP with 405, 488, 561 and 642 nm lasers.</td>
			<td style="width:199px;">Agilent</td>
			<td style="width:184px;">MLC400</td>
			<td style="width:193px;">laser original powers &#38; powers at the end of optical fiber) 
			405nm: 15 mW &#38; 13 mW; 
			488nm: 45 mW &#38; 42 mW; 
			561nm: 45 mW &#38; 40 mW; 
			640nm: 35 mW &#38; 16 mW.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100X Objective</td>
			<td style="width:199px;">Nikon</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td>APO 100X Oil, NA 1.49, WD 0.12mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nikon acquisition and analysis software(NIS Element)</td>
			<td style="width:199px;">Nikon</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Matlab</td>
			<td style="width:199px;">MathWorks</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Coverslip</td>
			<td style="width:199px;">Warner</td>
			<td style="width:184px;">64-0714</td>
			<td>Round 18mm coverslip, #1.5&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:199px;">Millipore</td>
			<td style="width:184px;">FC010-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Lipofectamin 3000(transfection reagent)</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:184px;">L3000-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:199px;">Electron Microscopy Science</td>
			<td style="width:184px;">#16120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PI(4,5)P2 1st antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-53412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">secondary antibody&#160; F(ab&#8217;)2-goat-anti-mouse Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen</td>
			<td>A-21237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tetraspeck beads</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:184px;">T7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">magnetic quick release imaging chamber&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:184px;">Cat#641994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">temperature controller</td>
			<td style="width:199px;">Warner Instruments</td>
			<td>TC-344C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phosphate buffer saline</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EGTA</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:184px;">3780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NH4Cl</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">A0171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Goat serum</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">bovine serum albumin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CaCl2*2H2O</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:184px;">223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MgCl2*6H2O</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraformaldyhyde</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule super-resolution imaging of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the plasma membrane with novel fluorescent probes

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a determinant phosphoinositide of the plasma membrane (PM), and it is required to modulate ion channels, actin dynamics, exocytosis, endocytosis, intracellular signaling, and many other cellular processes. However, the spatial organization of PI(4,5)P2 in the PM is controversial, and its nanoscale distribution is poorly understood due to the technical limitations of research approaches. Here by utilizing single molecule localization microscopy and the Pleckstrin Homology (PH) domain based dual color fluorescent probes, we describe a novel method to visualize the nanoscale distribution of PI(4,5)P2 in the PM in fixed membrane sheets as well as live cells.

हमारे सुपर संकल्प प्रणाली के स्थानीयकरण अनिश्चितता (σ) 14.73 एनएम 23 है। TIRF और पाम छवियों के बीच प्रत्यक्ष तुलना स्थानिक संकल्प का एक महत्वपूर्ण सुधार का प्रदर्शन किया। चित्रा 3 ए-बी पीआई (4,5) पी 2 एंटीबॉडी और iRFP-PAmCherry1-पीएच पीएलसी के साथ लेबल प्रतिनिधि पीआई (4,5) पी 2 TIRF छवियों से पता चलता ठेठ झिल्ली चादरें और जीवित कोशिकाओं में δ1। झिल्ली शीट में पारंपरिक TIRF माइक्रोस्कोपी छवियों के साथ उल्लेखनीय बरकरार लाइव बढ़ाया हरी प्रतिदीप्ति प्रोटीन के साथ लेबल की कोशिकाओं में उन लोगों के लिए समान हैं (EGFP) टैग की पीएच डोमेन (EGFP-पीएच PLCδ1) (चित्रा 3 सी)। सभी नमूनों जांच का एक भी वितरण दिखाया। इसके विपरीत, नमूनों की गैर इष्टतम निर्धारण तेज घने पीआई (4,5) पी 2 समूहों और संकेत तीव्रता में कमी (चित्रा 4) में हुई। इष्टतम निर्धारण शर्तों के तहत, टीवह पीआई (4,5) तय की कोशिकाओं में पी 2 (चित्रा 5) के सुपर संकल्प छवियों केवल सीमित एकाग्रता ढ़ाल के साथ प्रधानमंत्री का एक महत्वपूर्ण भाग में जांच की एक समरूप वितरण का पता चला। कुछ झिल्ली पैच पीआई (4,5) पी 2 जांच के साथ समृद्ध कम वितरित और विभिन्न आकारों थी। लाइव सेल पाम छवियों तय कोशिकाओं के रूप में एक समान स्थानिक वितरण (चित्रा 6) प्रदर्शित करते हैं। पीआई (4,5) पी स्थानीय क्षेत्रों में तेजी से गतिशीलता में समय परिणामों पर 2 संकेतों का विस्तृत विश्लेषण, व्यापक क्षेत्रों में उनकी बहुतायत के महत्वपूर्ण परिवर्तन के बिना। <img alt="आकृति 1" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig1.jpg" /> चित्रा 1. फ्लोरोसेंट इस अध्ययन में इस्तेमाल जांच के लिए योजना। निश्चित झिल्ली पत्र प्रयोगों में इस्तेमाल किया (एबी) iRFP-PAmCherry1-पीएच पीएलसी δ1 जांच। पारंपरिक TIRF इमेजिंग (ए), 640 एनएम के दौरान<html> (:; एम 692 एनएम: 713 एनएम पूर्व) लेजर iRFP उत्तेजित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। TIRF छवि को इस हालत में ले लिया पाम इमेजिंग (बी) के द्वारा प्राप्त की सुपर संकल्प इमेजिंग के लिए एक TIRF संदर्भ छवि के रूप में कार्य करता है। 405 एनएम लेजर करने के लिए प्रयोग किया जाता है PAmCherry1 fluorophore फोटो को सक्रिय करने और एक 561 एनएम लेजर उत्तेजित करने के लिए प्रयोग किया जाता है PAmCherry1 (पूर्व: 564 एनएम, एम: 595 एनएम) पाम इमेजिंग के लिए। (सीडी) mEos3.1-पीएच PLCδ1 जीवित कोशिका प्रयोगों में इस्तेमाल की जांच। (सी) पारंपरिक TIRF इमेजिंग के दौरान, एक 488 एनएम लेजर उत्तेजित करने के लिए mEOS3.1 (:;: 519 एनएम एम 506 एनएम पूर्व) का इस्तेमाल किया जाता है। (: 573 एनएम, एम: पूर्व 584 एनएम) (डी) एक 405 एनएम लेजर द्वारा photoconversion के बाद, mEos3.1 लाल रूप में बदल जाता है। और एक 561 एनएम लेजर पाम अधिग्रहण के लिए प्रयोग किया जाता है <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig1large.jpg" target="_blank">का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा।</a> एस / ftp_upload / 54466 / 54466fig2.jpg &quot;/&gt; चित्रा 2. आईएनएस-1 कोशिकाओं से झिल्ली पत्र तैयार करने के लिए योजना। (ए) एक पीडीएल लेपित coverslip पर नीचे का सामना करना पड़ संवर्धित कोशिकाओं के साथ coverslip रखें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 7 ~ 10 मिनट के लिए प्रतीक्षा करने के लिए PDL- सेल लगाव अनुमति देने के लिए लेपित coverslip। (बी) चिमटी के साथ शीर्ष coverslip छील और झिल्ली पत्र पीडीएल पूर्व लेपित coverslip से जुड़ी तय कर लो। (सी) छवि TIRFM और हथेली के साथ नमूने हैं। <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig2large.jpg" target="_blank">यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a> <img alt="चित्र तीन" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig3.jpg" /> चित्रा 3. पीआई (4,5) पी 2 स्थानिक संगठन पारंपरिक TIRF खुर्दबीन के नीचे झिल्ली चादरें और बरकरार जीवित कोशिकाओं के बीच इसी तरह की है। (ए) एकझिल्ली चादरों की ठेठ TIRF छवि 4% पीएफए ​​और 0.2% जीए के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर तय की। पीआई (4,5) पी 2 पी (4,5) पी 2 विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ चिह्नित किया गया। (बी) आईएनएस-1 सेल iRFP-PAmCherry1-पीएच पीएलसी δ1 व्यक्त करने से एक झिल्ली चादर। विभिन्न स्तरों पर EGFP-पीएच PLCδ1 व्यक्त दो बरकरार जीवित कोशिकाओं के (सी) TIRF छवि। स्केल सलाखों: (ए): 3 माइक्रोन; (बी) और (सी):। 5 माइक्रोन <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig3large.jpg" target="_blank">यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a> <img alt="चित्रा 4" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig4.jpg" /> चित्रा 4. पीआई (4,5) पी झिल्ली शीट में 2 स्थानिक संगठन आम निर्धारण की स्थिति के प्रति संवेदनशील है। (ए) झिल्ली शीट अकेले 4% पीएफए के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर तयऔर (चित्रा 3 ए के रूप में) पीआई (4,5) पी 2 विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ लेबल। (बी) झिल्ली पत्र अकेले पीएफए के साथ आरटी पर तय की और पीआई (4,5) पी 2 विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ लेबल। ध्यान दें कि पीआई के घने समूहों (4,5) पी 2 जांच स्पष्ट रूप से दिखाई TIRF माइक्रोस्कोप के तहत, बहुत अधिक भी प्रतिदीप्ति चित्रा 3 ए में दिखाया छवियों के विपरीत हैं। स्केल सलाखों: अटल बिहारी:। 3 माइक्रोन <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig4large.jpg" target="_blank">यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a> <img alt="चित्रा 5" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig5.jpg" /> चित्रा पीआई के 5. पाम इमेजिंग (4,5) पी 2 जांच के लिए एक आईएनएस-1 सेल PM में उनकी नैनोमीटर पैमाने पर वितरण एक आईएनएस-1 सेल iRFP-PAmCherry1-पीएच व्यक्त करने से एक झिल्ली शीट की iRFP TIRF छवि का पता चलता है। (ए) पीएलसीδ1। (बी) PAmCherry1 संकेत पुनर्निर्माण के आधार पर एक ही क्षेत्र में प्रधानमंत्री की हथेली की छवि इसी। नोट सजातीय पीआई (4,5) पी प्रमुख PM क्षेत्रों और कई पीआई (4,5) पी 2 microdomains में 2 स्थानिक वितरण। (सी) (बी) में बॉक्सिंग क्षेत्र के एक बढ़े हुए दृश्य। तीर कम PM microdomains पीआई (4,5) पी 2 जांच के साथ समृद्ध वितरित संकेत मिलता है। स्केल सलाखों: ए और बी: 3 माइक्रोन, सी: 500 एनएम। <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig5large.jpg" target="_blank">कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।</a> <img alt="चित्रा 6" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig6.jpg" /> चित्रा लाइव आईएनएस-1 कोशिकाओं में 6. पाम इमेजिंग। (ए) एक लाइव आईएनएस-1 सेल में की पीआई (4,5) पी 2 TIRF छवि व्यक्त mEos3.1-पीएच पीएलसीδ1। छवि की तेजी से पाम अधिग्रहण (35 डिग्री सेल्सियस) से पहले ग्रीन चैनल में अधिग्रहण कर लिया था। (बी) के 10 सेकंड के अंतराल पर अनुक्रमिक रहते सेल पाम छवियों। Insets स्थानीय पीआई (4,5) (बी) में अलग अलग समय पर एक ही सीधी रेखा 1 की स्थिति के साथ पी 2 घनत्व और (सी) की तीव्रता प्रोफाइल दिखाने। 10 सेकंड के भीतर अपने बड़े स्थानीय तीव्रता परिवर्तन पर ध्यान दें। (डी) पीआई की औसत तीव्रता परिवर्तन के समय पाठ्यक्रम (4,5) (बी) में बड़े क्षेत्र (box2, 3x3 माइक्रोन) और छोटे हलकों (3, 4, और 5, 500 एनएम व्यास) में पी 2 के दौरान 5 पाम इमेजिंग के मिनट (फ्रेम / 10 सेकंड)। नोट स्थानीय पीआई (4,5) पी 2 जांच के तेजी से उतार-चढ़ाव तीव्रता (वृत्त 3, 4 और 5) व्यापक क्षेत्र (बॉक्स 2) में बहुत छोटे परिवर्तन की तुलना में। (ई) बढ़े पाम संकेत समय पर (बी) में box2 क्षेत्र की छवियों। तीर पीआई (4,5) पी 2 पी समृद्ध झिल्ली के तहत पैच का संकेतhysiological की स्थिति। स्केल सलाखों: सी: 3 माइक्रोन, ई: 500 एनएम। <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig6large.jpg" target="_blank">कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।</a>

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Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

पीआई (4,5) पी 2 विभिन्न सेलुलर कार्यों को नियंत्रित करता है, लेकिन सेल प्लाज्मा झिल्ली में अपनी nanoscale संगठन खराब समझा जाता है। लेबलिंग पीआई (4,5) एक दोहरी रंग फ्लोरोसेंट Pleckstrin अनुरूपता डोमेन के लिए जुड़े हुए जांच के साथ पी 2 के द्वारा, हम पीआई अध्ययन करने के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण (4,5) पी प्लाज्मा झिल्ली में 2 स्थानिक वितरण nanometer पैमाने पर वर्णन ।

उपन्यास फ्लोरोसेंट जांच के साथ प्लाज्मा झिल्ली में Phosphatidylinositol 4,5-बाइफोस्फेट की एकल अणु सुपर संकल्प इमेजिंग

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

पाड़ Liposomes का उपयोग लिपिड-समीपस्थ प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत पुनर्गठित करने<em&gt; इन विट्रो</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

बायोमोलेस्क्यू संरचना निर्धारण के लिए एकल अणु स्तर पर उच्च शुद्धता FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

जी के एकल अणु हेरफेर-चुंबकीय चिमटी द्वारा quadruplexes

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

तीन रंग एकल अणु झल्लाहट का उपयोग प्रोटीन बातचीत के सहसंबंध का अध्ययन करने के लिए

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

C2C12 Myotubes द्वारा ट्रांस प्लाज्मा झिल्ली इलेक्ट्रॉन परिवहन को मापने

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए प्रोटीन की आबंध स्थिरीकरण

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

प्रोसिटोम एकल अणु स्तर पर लेबलिंग एकरूपता का व्यापक परिमाणन

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

एकल अणु ट्रैकिंग माइक्रोस्कोपी - Cytosolic अणु के विविध राज्यों का निर्धारण करने के लिए एक उपकरण

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

एमीलॉयड फाइब्रिल्स द्वारा मस्तिष्क माइटोकोंड्रिया के साथ और झिल्ली permeabilization के साथ बातचीत

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

एकल अणु अवलोकन के लिए डीएनए Origami Nanostructures पर Dynein और Kinesin मोटर एनसेंबल्स का उत्पादन

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