Name: single-molecule super-resolution imaging of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the plasma membrane with novel fluorescent probes
Uploaded: 2016-10-15T13:00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes at JoVE.com

This work is supported by the National Institutes of Health (NIH) grants R01DK093953 (X.L.), P30NS069271, BRFSG-2014-07 (X.L.). C.J. is partially supported by American Heart Associate pre-doctoral fellowship (14PRE20380168, to C.J.).

1. Membran Sheet Forberedelse og Fiksering <ol><li> Forbered membraner merket med iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 <ol><li> Klargjør DNA plasmid som koder iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 23 ved hjelp av standard molekylærbiologiske teknikker. </li><li> Kultur INS-1 celler på # 1,5 18 mm runde dekkglass pre-belagt med 30 mikrogram / ml fibronektin til 50-70% konfluens følgende standard INS-1 cellekultur protokoller 38,39. Transfektere cellene en dag etter 50 til 70% konfluens er nådd. </li><li> Transfektere celler med iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 bruker liposomer transfeksjon reagens følge produsentens protokoller. Etter transfeksjon, tillate cellene å vokse i 48 timer. </li><li> På dagen for forsøket, belegge dekkglass (på én side) med ~ 0,5 til 1 ml 500 ug / ml poly-D-lysin (PDL; fortynnet i dH 2 O) i 1-2 timer. Deretter drenere PDL ved å plassere et silkepapir påkanten av dekkglass. Plassere objektglassene på en pre-avkjølt (4 ° C) metallplate for senere bruk. </li><li> Vask pre-transfektert Ins-1-celler som vokser på dekkglass med ~ 0,5 til 1 ml iskald fosfatbufret saltløsning (PBS) inneholdende 1 mM EGTA. Gjenta vask tre ganger og avløp PBS. </li><li> Plasser Dekk med dyrkede celler (cellesiden ned) på PDL-belagte dekkglass på en pre-kjølt metallplate med en pinsett. La platen i et kjøleskap (4 ° C) i 7 - 10 minutter for å tillate cellene å feste til PDL-belagte dekkglass (figur 2). MERK: Inkubasjonstiden bør være i området på 7 - 10 min for bedre festing av cellene til PDL-belagte overflate. Kjøleskapet miljø er tørr og inkubasjonen bør ikke være for lang. </li><li> Fjern metallplaten fra kjøleskapet. Forsiktig skrelle av dekkglass som inneholder de forhånds transfekterte celler ved hjelp av pinsett. Dette gir et tynt lag av cellemembranen arket påPDL-belagt dekkglass. Vask forsiktig membranplater med ~ 0,5 til 1 ml iskald PBS og deretter løse med ~ 0,5 til 1 ml iskald 4% paraformaldehyd (PFA) + 0,2% glutaraldehyd (GA) i PBS i 15 min ved 4 ° C. Forsiktig: Paraformaldehyde og glutaraldehyd er giftige. Håndtere dem i et avtrekksskap med hud og vernebriller. </li><li> Etter fiksering, bilde membranplater umiddelbart (se pkt 3) eller oppbevare i ~ 0,5 til 1 ml PBS ved 4 ° C. MERK: Etter å feste membranen, vil det ikke være noen likevekt binding av PH prober fra cytosol til PI (4,5) P 2. De bundne PH sondene vil gradvis dissosiere fra membranarket og diffundere inn i oppløsningen (selv om det kan ta dager eller uker). Derfor anbefales det å avbilde de faste prøvene rett etter prøveopparbeidelse. </li></ol></li><li> Forbered membraner for PI (4,5) P 2 spesifikt antistoff merking <ol><li> Kultur INS-1 celler på # 1.5, 18 mm runde dekkglass pre-belagt med 30 &amp;# 181; g / ml fibronektin til 50% -70% konfluens. Transfektere celler med DNA-plasmid den neste dag som beskrevet i trinn 1.1.3. </li><li> Gjenta trinn fra 1.1.4 til 1.1.7 som beskrevet ovenfor. MERK: Utfør følgende prosedyrer ved 4 ° C. </li><li> Vask Dekk inneholder faste PM ark tre ganger med ~ 0,5 til 1 ml iskald PBS inneholdende 50 mM NH4Cl. Slukke arkene med ~ 0,5 til 1 ml 0,1% natrium-hydrid i PBS i 7 minutter, og vaskes med ~ 0,5 til 1 ml PBS (uten 50 mM NH4CI). </li><li> Blokkere prøvene med ~ 0,5 - 1 ml blokkeringsoppløsning (PBS-løsning inneholdende 5% (volum / volum) normalt geiteserum, 5% (v / v) bovint serumalbumin og 50 mM NH4CI) i 45 min. Deretter inkuberes med ~ 0,5 - 1 ml primær PI (4,5) P-2-antistoff (1: 300 fortynning) i blokkeringsløsning i 1 time. Vask tre ganger (10 min hver gang) med ~ 0,5 - 1 ml PBS inneholdende 50 mM NH4CI. </li><li> Inkuber prøver med ~ 0,5 - 1 ml sekundært F (ab &#39;) 2-geit-anti-musantistoff konjugert med fluoroforer (1: 300) i blokkeringsbuffer i 1 time. Vask tre ganger med ~ 0,5 til 1 ml PBS. </li><li> Post-fix prøver med 4% PFA + 0,2% GA i 15 minutter, deretter vaske prøvene tre ganger med PBS (7 min hver gang). Fortsett til avsnitt 3 for avbildning eller lagre i ~ 0,5 ~ 1 ml PBS ved 4 ° C for senere bruk. MERK: Forbered prøver ved 4 ° C. Bruk 4% PFA + 0,2% GA fiksativ for å bevare den fysiologiske fordelingen av phosphoinositides i PM. RT forberedelse eller fiksering med 4% PFA alene kan forårsake betydelige gjenstander (figur 4). </li></ol></li></ol> 2. Cell Culture Forberedelse for Live-celle bildebehandling med mEOS3.1-PH PLC δ1 <ol><li> Klargjør DNA plasmid som koder for mEOS3.1-PH PLC δ1 som beskrevet tidligere 23. </li><li> Kultur INS-1 celler på # 1,5 18 mm runde dekkglass pre-belagt med 30 mikrogram / ml fibronektin til de når 50% -70% confl-frekvensen følgende standard INS-1 cellekultur protokoller 38,39. </li><li> Dagen etter transfektere INS-1 celler med mEOS3.1-PH PLC δ1 DNA plasmid bruker liposomer transfeksjon reagens følgende produksjon protokoll. Inkuber i 48 timer før avbilding. </li></ol> 3. PALM Image Acquisition av membraner og levende celler <ol><li> PALM image oppkjøpet av membraner MERK: Her en total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskop basert SMLM system (100X olje, APO, NA = 1,49, WD 0,12 mm) 23 brukes for alle image oppkjøpet. <ol><li> Før avbildning, fortynnet 1 mL av fluorescerende vulst oppløsning i 10 ml PBS + 50 mM MgCl2. Tilsett 200 ul fortynnet oppløsning inn i avbildnings kammer inneholdende celleprøver (fra trinn 1.1.8 / 1.2.6) i 10 min. Deretter, vask med PBS tre ganger. </li><li> Start PALM imaging system. I den tilhørende bildebehandlingsprogrammer, velg &quot;iRFP kanal &amp;# 34; knappen (642 nm laser eksitasjon, 700/75 nm utslipp). Finn cellemembranen uttrykker PH sonder i iRFP kanal. MERK: Membranen arket skal ha et fluorescerende perle i nærheten. Dette er nødvendig for korreksjon av drifting senere. </li><li> Bruk &quot;Capture&quot; -knappen for å samle en konvensjonell TIRF bilde av cellemembranen i iRFP kanalen som en referanse for fremtidig bilde gjenoppbygging. Sett en normal TIRF vinkel (dvs. etter å ha nådd den kritiske vinkel, skru en annen 1,5 grader) ved å skrive inn 2140 i TIRF vinkelen for bildebehandling. Bruk denne vinkelen for alle trinn, med mindre annet er angitt. MERK: I TIRF system som beskrives her, er 3500 den vertikale opp vinkel, 2200 er TIRF kritisk vinkel, og 2140 er den normale TIRF vinkel, noe som er 1,5 grader mer etter TIRF kritisk vinkel. Den smale TIRF vinkel som er nevnt nedenfor i 3.2.3 er 2120, som er en annen 2 grad etter å ha nådd TIRF kritisk vinkel. </li><li> Bytt til PAmCherry1 kanal ved å klikke på the RFP kanalknappen (561 nm eksitasjon, 600/50 nm utslipp filter). Juster rullefeltet i &quot;AOTF&quot; pad hele veien til retten til å ha full effekt belysning av 561 nm laser for 10-20 sek å bleke bakgrunnen membran fluorescens. </li><li> Sett den optimale kamerainnstillingen (2x2 binning) i &quot;Format&quot; -fanen og den raske oppkjøp protokollen i &quot;ND sekvens oppkjøp&quot; -kategorien (typisk 10,000-40,000 bilder på 20 Hz). </li><li> Begynn oppkjøpet av PAmCherry1 bilder (561 nm laser ved full effekt, 50 msek / ramme) med samtidig 405 nm laser aktivering på et lavt nivå (0,1% - 1%) ved å klikke på &quot;Kjør nå&quot; -knappen. Justere intensiteten på 405 nm laser slik at romlig isolerte enkeltpunkter i hver ramme er lett identifiserbare. MERK: Antallet aktiverbare PAmCherry1 molekyler avtar gradvis i løpet av oppkjøpet. 405 nm laserintensiteten økes gradvis for å holde den optimale tetthet av individuelle signaler i hvert molekylramme. </li><li> Fortsett skaffe bilder til det ikke PAmCherry1 enkelt molekyl signal aktiveres. </li></ol></li><li> PALM bildebehandling i levende celler <ol><li> Før avbildning, fortynnet fluoriserende perler i bildekammeret i 10 minutter som beskrevet i trinn 3.1.1. Deretter starter PALM bildebehandling ved å åpne den tilhørende bildebehandlingsprogrammer. MERK: Bruk en magnetisk quick-release bildebehandling kammeret for live-cell imaging. Opprett midten av bildefeltet ved 35 ° C med en temperaturregulator under konstant perfusjon med ekstracellulær buffer (Ekstracellulær Løsning: 135 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 2,6 mM CaCl2, 1,2 mM MgCl2, 3 mM glukose og 20 mM HEPES; pH = 7,3). </li><li> Velg GFP kanalknappen (525/50 nm utslipp). Identifiser cellemembranen uttrykker fluorescerende prober basert på grønn fluorescerende fra mEOS3 etter 488 nm laser eksitasjon. Kontroller at fluoriserende perler i nærheten er også inkludert i bildebehandling, da dette er nødvendig senere for offline drift korreksjon. </li><li> Klikk på &quot;Capture&quot; for å samle inn en TIRF bilde av cellemembranen i mEOS3 (grønn) kanal som et referansebilde. Bruk en grunne flyktig bølgeeksitering belysning (etter å ha nådd den kritiske vinkel, skru ytterligere 2 grader) ved å skrive inn 2120 i TIRF vinkel innstilling for live-cell imaging. MERK: Dette minimaliserer fluorescens fra den ubundne mEos3-PH i cytosol ved siden av plasmamembranen. </li><li> Bytt til &quot;RFP kanal&quot; -knappen (561 nm eksitasjon, 600/50 nm utslipp). Bruk av full kraft 561 nm laser til å bleke bakgrunn fluorescens av membraner for 10 ~ 20 sek med rullefeltet i &quot;AOTF pad&quot; (se 3.1.4). </li><li> Begynn bilde oppkjøpet ved å klikke på &quot;Kjør nå&quot; -knappen i den røde kanalen (561 nm full effekt, satt til 10 ms / ramme i &quot;kamera&quot; innstilling tab) med samtidig 405 nm laser aktivering. Juster 405 nm laser intensitet for å aktivere romlig atskilte punkteri hver ramme. MERK: Som anskaffelses utbytte, un-konvertert mEOS3.1-PH PLC δ1 molekyl nummer langsomt avtar. Øk gradvis 405 nm laser kraft for å optimalisere enkelt molekyl signal. The Imaging Acquisition lengde avhenger av eksperimentelle formål. Hente bilder kontinuerlig i fem minutter under normale forhold. Hvis en lengre oppkjøp er nødvendig, samle flere bilde stabler i stedet for en enkelt, stor bildestakk. Filstørrelsen på hvert bilde stabel bør ikke overstige 4 GB eller det vil påvirke programvare analyse senere. </li></ol></li></ol> 4. SMLM Bildebehandling og Reconstruction <ol><li> Overfør bildefiler (.tif bildestakker) til en bildeanalyse stasjon. Start bilde rekonstruksjon program (custom-skrevet) i Matlab som beskrevet tidligere 37 og laste bildet stabelen ved å klikke på &quot;File&quot; fanen i hovedmenyen, deretter &quot;åpne&quot;, deretter &quot;ny fil&quot;. </li><li> Identifisere og locagående stabiliserer enkelte molekylære hendelser fra hver ramme. Satt filtrering intensitet terskel med et terskelnummer (1-10) i &quot;wavelet&quot;. Kontroller de optimale parameterinnstillingene for punkt deteksjon visuelt før gjenoppbyggingen. Deretter går du til &quot;PALM&quot; og klikk &quot;ett skritt prosess&quot; for å starte bilde gjenoppbygging. MERK: Intensitet terskel for punkt deteksjon er vilkårlig, og avhenger av personlig erfaring. Flere studier kan være nødvendig for å generere en optimal deteksjonsgrensen som verken tar for mange ukvalifiserte (dim) peker heller ikke filtrerer ut for mange kvalifiserte (lyse) poeng. Justere andre parametere for å optimalisere dataanalyse. Her er nabolaget avstand (fluorescens punkter i nabo rammer innenfor en avstand kombineres) satt som 65 nm (1/2 pixel bredde) og utstyrt som et enkelt molekyl. Gap rammer (enkelte molekyl hendelser som fant sted innenfor disse rammene og nabolag avstand ble kombinert og utstyrt som et enkelt molekyl hendelse) erangitt som 26 rammer (1,3 sek) for PAmCherry1 bildebehandling 40. Juster disse parameter i henhold til egenskapene til enkelt molekyl sonder og oppkjøp hastighet for å unngå over telle 40 i SMLM. Påfør korreksjon av drifting med fluoriserende perler i løpet av rekonstruksjoner. <ol><li> For bildebehandling de faste membraner merket med iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1, rekonstruere hele bildestakker fra samme membran i en enkelt super-oppløsning 37. </li><li> For levende celle prøver merket ved mEOS3.1-PH PLC δ1, separere hele bildet stabelen i flere mindre stabler av 1,000 rammer, slik at 1000-rad-ramme stabelen blir rekonstruert som en ett super-oppløsning, som har en tidsmessig oppløsning av 10 sek. Til slutt, kombinere alle de tidsseriebilder i den endelige tidsserier stabelen 23. MERK: I levende celle PALM bildebehandling, kan et lite antall aktiverte prober flytte eller distanserefra PI (4,5) P 2 i PM før bleking. Å ta hensyn til oversampling av sondene, kombinere individuelle molekyl signaler i nabo rammer innenfor 130 nm (i stedet for 65 nm) i en enkelt utslipp hendelse i løpet bildeanalyse. </li></ol></li><li> Etter å ha fått de rekonstruerte bilder, gjennomføre ytterligere bildeanalyse med spesial skrevet program i Matlab for å kvantifisere molekyl tetthet, mikro-domene tetthet / størrelse, og cluster analyse med par-korrelasjon 41. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

For feilsøking, to prosesser trenger ekstra oppmerksomhet: membran produksjon og prøve fiksering. Som beskrevet i protokollen, er det inkubasjonstid på objektglassene i trinn 1.1.6 viktig for membranarket produksjon. Optimal inkubasjonstid i henhold til vårt eksperimentelle betingelse er 7-10 min (figur 2). Lenger enn 10 min inkubasjon vil produsere intakte celler i stedet for membraner i PDL-dekkglass og kortere inkubasjonstid vil føre til mindre eller ingen membran ark på PDL-belagte dekkglass. Som beskrevet i protokollen, den fiksativer og temperatur under fiksering er kritisk for å opprettholde den PI (4,5) P 2 fordeling i pm. Fiksering ved RT eller bruk av 4% -PFA alene kan forvrenge normal lipid fordelingen i PM. Ved å bruke PALM mikros til membran lipid forskning, er vi i stand til å observere nanometer skala distribusjon av PI (4,5) P 2, en nøkkel phosphoinositide som formidler mnoen grunnleggende cellulære aktiviteter. Denne romlige fordelingen av PI (4,5) P 2 med begrensede konsentrasjons gradienter i INS-1 celler gir et rammeverk for å tenke nytt lipid-protein interaksjoner og lokale signal hendelsene i PI (4,5) P 2 i disse cellene. Videre kan metoder som er utviklet i dette arbeidet også anvendes for andre membranfosfolipid forskning med passende prober, for derved, å tilby nye verktøy for å studere phosphoinositides i biologiske prosesser. Bruk av membraner i dette arbeidet omgår to store bekymringer i fosfolipid morfologiske studier: vaskemiddel behandling og potensielle signal forurensning fra cytosol. Vaskemidler ofte føre clustering og betydelig tap av PM fosfolipid signal. Forurensning av cytosolisk signal er spesielt problematisk når det gjelder lav overflod phosphoinositides på PM 23, for eksempel PI (3,4,5) P3 og PI (3,4) P-2. Membranen plateprøvene er i stand til å sirkuleremvent disse problemene uten i vesentlig grad å forstyrre strukturer forbundet med plasmamembranen, så som kortikal aktin nettverket og det klatrin-belagte groper 42,43. Den relative homogene fordeling av PI (4,5) P 2 i PM er i god overensstemmelse med andre raske frysing EM studier ved hjelp av GST-PH PLC δ1 sonder i fibroblast membran 44. Det er viktig å merke seg at feil utvalgets behandling som kan danne misvisende resultater. For det første er det viktig å utføre festetrinn ved en lavere temperatur (4 ° C) og bruke den fiksativ GA for membranarket produksjon. Som vist i figur 3, er varm temperatur og PFA fiksering uten GA ikke er tilstrekkelig til å feste phosphoinositides i cellen PM. Dette kan forvrenge intakt PI (4,5) P 2 distribusjon og generere skarpe klynger som ikke er observert i levende celler under fysiologiske forhold. For det andre, bruk av PAmCherry1 somden SMLM sonde, snarere enn andre sonder, er avgjørende for kvantitativ PALM bildebehandling. Fordelen med PAmCherry1 søknaden kommer fra sine veldefinerte enkle molekylære foto fysiske egenskaper 35,40,45, som lysstyrke, høy fotoaktivering effektivitet og mest av alt, svært begrenset foto blinke. Disse egenskapene gjør oss i stand til å eliminere potensielle klase gjenstander fra foto blinker og kvantitativt analysere molekylær tetthet av membran PI (4,5) P 2. Denne tilnærmingen har også sine begrensninger. For det første kan membranen arket fremgangsmåten anvendt i denne studien ikke fullt ut etterligner den fysiologiske fordelingen av PI (4,5) P 2 fordi cellen blir forstyrret før avbildning. Imidlertid viser vår live PALM bildebehandling lignende relativt homogen fordeling av PI (4,5) P 2, støtter resultatene observert med membran ark prøver. For det andre, som vi diskuterte i vår tidligere arbeid 23, krever SMLM Ekspertise og ekstra påtention å unngå bilde gjenstander som kan oppstå fra forskjellige prosesser, inkludert sondene brukes, prøveopparbeidelse og feste, bilde prøvetaking og gjenoppbygging. Til slutt, selv om PH domenebaserte prober og antistoffer er blitt mye brukt i fosfoinositid studier 46,47 er det fortsatt mulig at ikke alle PI (4,5) P 2 i membranen kan detekteres ved denne fremgangsmåten. For eksempel kan PI (4,5) P-2 bundet til andre endogene proteiner ikke være tilgjengelig for PH-prober eller antistoffer, og dette kan føre til en undervurdering av PI (4,5) P-2 på grunn av den plass hindring av sonde seg selv. En alternativ måte å merking PI (4,5) P 2 ville være med Top-Fluor PI (4,5) P 2 48, en pre-merket PI (4,5) P 2 analog med en modifikasjon på halen av originale PI (4,5) P 2. Imidlertid kan den omdannes hurtig til andre undertyper av fosfoinositid rask levende cellemetabolisme siden inositol ingen er den samme som endogenous PI (4,5) P 2. Dette reiser bekymring om denne pre-merket PI (4,5) P 2 analoge i levende celler kan trofast representere PI (4,5) P 2 snarere enn sine metabolske produkter. Derfor, til tross for noen begrensninger, PH domene basert sonder er fortsatt blant de beste sonder som har blitt mye brukt til å overvåke PI (4,5) P 2 fordeling og dynamikk på PM av celler. Den fremtidig anvendelse av denne metoden kan utvides til andre phosphoinositide studier, for eksempel PI (3,4,5) P3 og PI (3,4) P-2. Oppsummert romanen SMLM tilnærmingen som brukes her åpner nye måter å studere phosphoinositide i celler. Bruke PI (4,5) P 2 som et eksempel viser vi de unike egenskapene til PALM bildebehandling i den morfologiske og kvantitativ studie av cellemembranmolekyler, samt sine ulemper. Denne tilnærmingen kan tilpasses til andre molekyler steder og vil ha brede programmer i cellebiologi.

Phosphoinositides bidra til en liten del av de totale membranlipider, men spiller avgjørende roller i en rekke forskjellige cellulære prosesser. De omfatter syv medlemmer som stammer fra reversibel fosforylering eller defosforylering av inositol ringene på 3., 4. og 5. posisjon 1. Fosfatidylinositol 4-fosfat (PI4P) og fosfatidylinositol 4,5-bisfosfat (PI (4,5) P 2) er to viktige phosphoinositides som fungerer relativt uavhengig som de avgjørende lipider av celleplasmamembran (PM) 2,3. Fosfatidylinositol (3,4,5) -trisphosphate (PIP 3) er mye mindre enn rikelig PI4P og PI (4,5) P 2, men det har unike funksjoner i ulike cellulære prosesser, inkludert kreft 4 og diabetes fem. Disse lipider har komplekse molekylære interaksjoner med sine effektbokser og mange andre proteiner. Derfor er det viktig å forstå den romlige organiseringen av disse phosphoinositides i PM på nanometer skala. Montering bevis har vist at proteinkomplekser eller molekyl klynger i trange PM områder kan tjene som signaliserer hotspots 6. For eksempel syntaxin 1a, et nøkkelprotein som regulerer membranfusjon 7-9, viser klynge organisasjon i PM. Til forskjell fra konsensus visningen av klyngen organisering av syntaxin 1a, er den romlige fordelingen av phosphoinositides i PM kontroversielt. PI (4,5) P to fordelingsmønstre varierer fra uniform 10-12, store oppdateringer 13,14, for å tette klynger 14-18, avhengig av celletyper og eksperimentelle metoder som brukes. Den romlige organiseringen av PI (4,5) P 2 ved høyere oppløsning er også inkonsekvent. En undersøkelse ved hjelp av stimulert-utslipps uttømming (STED) mikroskopi 19 har avdekket et stort antall tett PI (4,5) P 2 nano-klynger (~ 73 nm i diameter) i PM ark av PC-12-celler 20 </sopp&gt;. Dette resultatet er forskjellig fra studier med rask frysing elektronmikroskopi (EM) 21,22, en tilnærming som bevarer intakt PM strukturen i levende celler mye bedre enn kjemisk fiksering. Sistnevnte viste tydelige bassenger av PI (4,5) P 2; relativt konsentrert PI (4,5) P 2 i caveolae og belagte groper samt jevn fordeling på flat PM regionen. Videre kan nanoskala PI (4,5) P 2 organisasjon i membranplater varierer i levende og fikserte celler. Vår siste arbeid utredet saken, både faste og bor INS-1 celler ved hjelp av enkelt-molekyl lokalisering mikroskopi (SMLM) 23. SMLM er basert på stokastisk å bytte på bare en liten undergruppe av fluoroforer til enhver tid, slik at de enkelte fluoroforer kan lokaliseres med stor nøyaktighet. Mange super-Resolution Imaging tilnærminger har blitt utviklet ved hjelp av tilsvarende prinsipper for å overgå diffraksjon grensen av konvensjonell lysmikroskopi, sliks fotoaktivering lokalisering mikroskopi (PALM) 24, fluorescens fotoaktivering lokalisering mikroskopi (FPALM) 25, stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi (STORM) 26,27 og direkte STORM (dSTORM) 28. Med foto valgbar eller photoactivatable fluoroforer (fargestoffer eller fluorescerende proteiner), SMLM teknikker tillate forskere til bilde biologiske strukturer på nanometer oppløsning 24,29,30 med video-rate i levende celler 31,32. Bruke PI (4,5) P 2 som et eksempel, introduserte vi SMLM tilnærming for å studere nanoskala fordelingen av phosphoinositides på PM. PH domenet PLCδ1 (fosfolipase C δ1) som binder seg til PI (4,5) P 2 er et veletablert probe for bildebehandling PI (4,5) P to sub-cellulære distribusjon og dynamikk 33,34 i PM . Vi har genetisk merket dette domenet med to fluorescerende proteiner, PAmCherry1 35 og iRFP 36 </sup&gt; for å produsere en dual-color fusjonsprotein (iRFP-PAmCherry1-PH PLCδ1) (figur 1A-B). PAmCherry1 fungerer som photoactivatable probe av PH domene for PALM og iRFP fungerer som en generell indikator for å identifisere transfekterte celler før PALM oppkjøp . Vi bruker denne dual-farge fluorescerende probe for SMLM bildebehandling i de faste membraner. For levende PALM bildebehandling, merket vi mEOS3 37 i stedet for PAmCherry1 til PH PLCδ1 domene for å generere mEOS3.1-PH PLCδ1 probe for sin bedre foton effektivitet og lysstyrke (figur 1C-D). SMLM avbildning med disse nye prober i PM av insulin-sekresjon INS-1 celler 38 har avdekket homogen merking av PI (4,5) P 2 i flertallet av PM regioner, samt konsentrert PI (4,5) P 2 mikroområder som er tynt insprängda i leiligheten PM og noen filopodia-lignende strukturer 23. Så ennoscale fordeling av PI (4,5) P 2 gir en strukturell utgangspunkt for å tenke nytt om hvordan den fungerer i levende celler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="791">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microscope</td>
			<td style="width:199px;">Nikon</td>
			<td style="width:184px;">Ti-U</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sCMOS camera</td>
			<td style="width:199px;">Andor</td>
			<td style="width:184px;">Neo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spinning disk</td>
			<td style="width:199px;">Yokogawa</td>
			<td style="width:184px;">CSU X-1, 10,000 rpm&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">&#160;High Power Monolithic Laser Combiner SP with 405, 488, 561 and 642 nm lasers.</td>
			<td style="width:199px;">Agilent</td>
			<td style="width:184px;">MLC400</td>
			<td style="width:193px;">laser original powers &#38; powers at the end of optical fiber) 
			405nm: 15 mW &#38; 13 mW; 
			488nm: 45 mW &#38; 42 mW; 
			561nm: 45 mW &#38; 40 mW; 
			640nm: 35 mW &#38; 16 mW.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100X Objective</td>
			<td style="width:199px;">Nikon</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td>APO 100X Oil, NA 1.49, WD 0.12mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nikon acquisition and analysis software(NIS Element)</td>
			<td style="width:199px;">Nikon</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Matlab</td>
			<td style="width:199px;">MathWorks</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Coverslip</td>
			<td style="width:199px;">Warner</td>
			<td style="width:184px;">64-0714</td>
			<td>Round 18mm coverslip, #1.5&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:199px;">Millipore</td>
			<td style="width:184px;">FC010-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Lipofectamin 3000(transfection reagent)</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:184px;">L3000-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:199px;">Electron Microscopy Science</td>
			<td style="width:184px;">#16120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PI(4,5)P2 1st antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-53412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">secondary antibody&#160; F(ab&#8217;)2-goat-anti-mouse Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen</td>
			<td>A-21237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tetraspeck beads</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:184px;">T7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">magnetic quick release imaging chamber&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:184px;">Cat#641994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">temperature controller</td>
			<td style="width:199px;">Warner Instruments</td>
			<td>TC-344C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phosphate buffer saline</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EGTA</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:184px;">3780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NH4Cl</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">A0171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Goat serum</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">bovine serum albumin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CaCl2*2H2O</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:184px;">223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MgCl2*6H2O</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraformaldyhyde</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule super-resolution imaging of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the plasma membrane with novel fluorescent probes

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a determinant phosphoinositide of the plasma membrane (PM), and it is required to modulate ion channels, actin dynamics, exocytosis, endocytosis, intracellular signaling, and many other cellular processes. However, the spatial organization of PI(4,5)P2 in the PM is controversial, and its nanoscale distribution is poorly understood due to the technical limitations of research approaches. Here by utilizing single molecule localization microscopy and the Pleckstrin Homology (PH) domain based dual color fluorescent probes, we describe a novel method to visualize the nanoscale distribution of PI(4,5)P2 in the PM in fixed membrane sheets as well as live cells.

Lokaliseringen usikkerhet (σ) av vår super-oppløsning system er 14,73 nm 23. Direkte sammenligninger mellom TIRF og Palm bildene viser en signifikant forbedring av romlig oppløsning. 3A-B viser representative PI (4,5) P 2 TIRF bilder merket med PI (4,5) P 2 antistoff og iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 i typiske membraner og levende celler. Bildene med konvensjonell TIRF mikros i membraner er bemerkelsesverdig lik de i intakte levende celler merket med den forbedrede grønn fluorescens protein (EGFP) merket PH domener (EGFP-PH PLCδ1) (figur 3C). Alle prøver viste en jevn fordeling av prober. I motsetning til ikke-optimal fiksering av prøvene resulterte i skarp tett PI (4,5) P 2 klynger og en reduksjon i signalintensitet (figur 4). Under optimale festeforhold, than super oppløsning av PI (4,5) P 2 i fikserte celler (figur 5) viste en homogen fordeling av sondene i en betydelig del av PM med bare begrenset konsentrasjonsgradienter. Noen membran flekker anriket med PI (4,5) P 2 prober ble tynt fordelt og hadde forskjellige størrelser. Live-celle PALM bildene viser en tilsvarende romlig fordeling som anleggs celler (figur 6). Detaljert analyse av PI (4,5) P 2 signaler over tid fører til raske dynamikken i lokale områder, uten vesentlige endringer av sin overflod i brede områder. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig1.jpg" /> Figur 1. Skjema for fluorescerende prober som brukes i denne studien. (AB) iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 probe brukes i de faste eksperimenter membran ark. Under konvensjonelle TIRF imaging (A), en 640 nm<html> laser brukes til å opphisse iRFP (Ex: 692 nm; Em: 713 nm). TIRF bilde tatt i denne tilstanden fungerer som en TIRF referansebilde for super oppløsning bildebehandling oppnås ved PALM imaging (B). En 405 nm laser brukes til foto aktivere PAmCherry1 fluoroforen og en 561 nm laser brukes til å opphisse PAmCherry1 (Ex: 564 nm; Em: 595 nm) for PALM bildebehandling. (CD) mEos3.1-PH PLCδ1 probe anvendt i de levende celleforsøk. (C) Under vanlig TIRF imaging, er en 488 nm laser brukes til å opphisse mEOS3.1 (Ex: 506 nm; Em: 519 nm). (D) Etter photoconversion av en 405 nm laser, slår mEos3.1 inn i den røde form (Ex: 573 nm; Em: 584 nm). Og en 561 nm laser brukes for PALM oppkjøp <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> s / ftp_upload / 54466 / 54466fig2.jpg &quot;/&gt; Figur 2. Reaksjonsskjema for membranarket preparat fra Ins-1-celler. (A) Plasser dekkglass med dyrkede celler som vender ned på en PDL-belagte dekkglass og vente på 7 ~ 10 minutter ved 4 ° C for å tillate cellefesting til PDL- belagt dekkglass. (B) Ta av toppdekkglass med pinsett og fikse membran festet til PDL pre-belagt dekkglass. (C) Bilde prøvene med TIRFM og PALM. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig3.jpg" /> Figur 3. PI (4,5) P to romlige organiseringen er lik mellom membraner og intakte levende celler under vanlig TIRF mikroskop. (A) Atypisk TIRF bilde av membraner fiksert ved 4 ° C med 4% PFA og 0,2% GA. PI (4,5) P-2 ble merket med PI (4,5) P-2 spesifikt antistoff. (B) En membran ark fra INS-en celle som uttrykker iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1. (C) TIRF bilde av to intakte levende celler som uttrykker EGFP-PH PLCδ1 på ulike nivåer. Skala barer: (A): 3 mikrometer; (B) og (C). 5 mikrometer <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig4.jpg" /> Figur 4. PI (4,5) P to romlig organisasjon i membraner er følsomme overfor vanlige festeforhold. (A) Membran ark fast ved 37 ° C med 4% PFA aleneog merket med PI (4,5) P-2 spesifikt antistoff (som i figur 3A). (B) Membran ark fast ved RT med PFA alene og merket med PI (4,5) P-2 spesifikt antistoff. Legg merke til at den tette klynger av PI (4,5) P 2 prober er tydelige under TIRF mikroskop, i motsetning til de mye mer med fluorescens bilder vist i figur 3A. Skala barer: AB:. 3 mikrometer <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig5.jpg" /> Figur 5. PALM avbildning av PI (4,5) P 2 prober avslører deres nanometer skala distribusjon i en INS-en celle PM. (A) iRFP TIRF bilde av en membran fra en INS-en celle som uttrykker iRFP-PAmCherry1-PH PLCδ1. (B) Tilsvarende PALM bilde av PM i samme region basert på PAmCherry1 signal gjenoppbygging. Legg merke til den homogene PI (4,5) P to romlige fordelingen i store PM regioner og flere PI (4,5) P 2 mikroområder. (C) Et forstørret riss av den eske regionen i (B). Pilene viser tynt fordelt PM mikroområder beriket med PI (4,5) P 2 prober. Skala barer: A og B: 3 mikrometer; C: 500 nm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig6.jpg" /> Figur 6. PALM bildebehandling i levende INS-1 celler. (A) TIRF bilde av PI (4,5) P 2 i en live INS-en celle som uttrykker mEos3.1-PH PLCδ1. Bildet ble raskt kjøpt opp i den grønne kanalen før PALM oppkjøp (35 ° C). (B) sekvensielle levende celle PALM bilder med 10 sek intervall. Innfellinger viser intensitets profiler av den lokale PI (4,5) P 2 tetthet langs den samme rette linje en posisjon til forskjellige tider i (B) og (C). Merk sine store lokale intensitet endringer innen 10 sek. (D) Tidsforløp av den gjennomsnittlige intensitetsforandringer PI (4,5) P 2 i det store området (BOX2, 3x3 um) og små sirkler (3, 4, og 5, 500 nm diameter) i (B) i løpet av fem min av PALM imaging (ramme / 10 sek). Legg merke til den raske intensitetsvariasjoner av lokal PI (4,5) P 2 sonder (sirkel 3, 4 og 5) sammenlignet med meget små endringer i bredt område (boks 2). (E) Forstørret PALM bilder av BOX2 regionen i (B) på angitte tider. Pilene viser PI (4,5) P 2 beriket membran flekker under physiological forhold. Skala barer: C: 3 mikrometer, E: 500 nm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig6large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes at JoVE.com

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

PI (4,5) P 2 regulerer ulike cellulære funksjoner, men nanoskala organisasjon i cellen plasmamembranen er dårlig forstått. Ved merking PI (4,5) P-2 med en to-farge fluorescerende probe sammensmeltet til Pleckstrin Homologi domene, beskriver vi en ny tilnærming for å studere PI (4,5) P to romlig fordeling i plasmamembranen til nanometerskala .

Single-molekyl Super-Resolution Imaging of phosphatidylinositol 4,5-bisfosfat i plasmamembranen med Novel fluorescerende prober

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Bruke Stillas liposomer for å rekonstituere Lipid-proksimale Protein-protein interaksjoner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Høy presisjon FRET ved enkeltmolekylivå for biomolekylstrukturbestemmelse

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Single-molekylet manipulering av G-quadruplexes av magnetiske pinsett

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Bruker tre farger Single-molekylet bånd å studere sammenhengen av Protein interaksjoner

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Måle Trans-Plasma membran elektronet Transport av C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalente immobilisering av proteiner for ett molekyl Force spektroskopi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom hele kvantifisering av merking homogenitet på ett molekyl nivå

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-molekylet Tracking mikroskopi-et verktøy for fastsettelse av Diffusive statene cytosolic molekyler

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interaksjoner med og membran Permeabilization av Brain mitokondrier av amyloid fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produksjon av Dynein og Kinesin motor ensembler på DNA Origami nanostrukturer for single molekyl observasjon

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...