Name: single-molecule super-resolution imaging of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the plasma membrane with novel fluorescent probes
Uploaded: 2016-10-15T13:00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes at JoVE.com

This work is supported by the National Institutes of Health (NIH) grants R01DK093953 (X.L.), P30NS069271, BRFSG-2014-07 (X.L.). C.J. is partially supported by American Heart Associate pre-doctoral fellowship (14PRE20380168, to C.J.).

The authors have nothing to disclose.

Для устранения неполадок, два процесса требуют особого внимания: мембранное производство листа и образца фиксации. Как описано в протоколе, время инкубации покровные на этапе 1.1.6 имеет важное значение для производства мембранного листа. Оптимальное время инкубации при нашем экспериментальном состоянии составляет 7-10 мин (рисунок 2). Более чем 10-минутной инкубации будет производить неповрежденные клетки вместо мембранных листов на PDL покровные и более короткой инкубации приведет к менее или без каких-либо мембранных листов на покровные PDL покрытием. Как описано в протоколе, то фиксаторов и температуры во время фиксации имеют решающее значение для поддержания PI (4,5) распределение P 2 в ПМ. Фиксирование при комнатной температуре или использование только 4% -PFA может исказить нормальное распределение липидов в ПМ. Применяя PALM микроскопии для исследования мембранных липидов, мы можем наблюдать распределение нанометрового масштаба по PI (4,5) P 2, ключ фосфоинозитидного , который посредничает млюбые фундаментальные клеточные активности. Такое пространственное распределение PI (4,5) P 2 с ограниченными градиентов концентрации в клетках INS-1 обеспечивает основу для переосмысления липидный-белковых взаимодействий и локальных сигнальных событий PI (4,5) P 2 в этих клетках. Кроме того, методы, разработанные в данной работе также могут быть применены к другим исследования мембранного фосфолипида с соответствующими зондами, таким образом, предлагая новые инструменты для изучения фосфоинозитиды в биологических процессах. Применение мембранных листов в этой работе обходит две основные проблемы в фосфолипидных морфологических исследований: Лечение моющее средство и потенциального загрязнения сигнала от цитоплазмы. Моющие средства часто вызывают кластеризацию и значительные потери сигнала фосфолипидов PM. Загрязнение цитозольного сигнала проблема особенно остро стоит в случае низких фосфоинозитидов изобилии на ПМ 23, таких как PI (3,4,5) P 3 и PI (3,4) P 2. Образцы мембран листа способны свободной циркуляцииmvent эти проблемы без существенного нарушения структуры , связанные с плазматической мембраной, такие как корковой актина сетчатая и клатриновых ямах 42,43. Относительное гомогенное распределение PI (4,5) P 2 в ПМ находится в хорошем согласии с другими быстрых исследований замораживания EM с использованием GST-PH PLC б1 зондов в фибробласты мембране 44. Важно отметить, что неправильные условия обработки образца могут генерировать ошибочные результаты. Во-первых, это имеет решающее значение для выполнения этапов фиксации при более низкой температуре (4 ° C) и использовать закрепляющего GA для производства мембранного листа. Как показано на рисунке 3, теплая температура и PFA фиксации без ГА не является достаточным , чтобы исправить фосфоинозитиды в ячейки PM. Это может исказить неповрежденную PI (4,5) P 2 распределения и генерировать острые кластеры, которые не наблюдаются в живых клетках при физиологических условиях. Во-вторых, использование в качестве PAmCherry1SMLM зонд, а не других зондов, имеет ключевое значение для количественного PALM визуализации. Преимущество применения PAmCherry1 исходит от его хорошо охарактеризованных отдельных молекулярных фото-физические свойства 35,40,45, такие как яркость, высокая эффективность фотоактивация и больше всего, очень ограничено фото-мигания. Эти свойства позволяют устранить потенциальные кассетные артефакты из фото-мигающим и количественного анализа молекулярной плотности мембранного PI (4,5) P 2. Этот подход также имеет свои ограничения. Во- первых, способ мембранного лист , используемый в этом исследовании , не может полностью имитировать физиологическое распределение PI (4,5) P 2 , потому что ячейка будет прервана до визуализации. Тем не менее, наша живая PALM визуализация показывает аналогичную относительно однородное распределение PI (4,5) P 2, поддерживая результаты с образцами мембраны листа. Во- вторых, как мы уже говорили в предыдущей работе 23, SMLM требует опыта обработки изображений и дополнительной намание, чтобы избежать артефактов визуализации, которые могут возникнуть в результате различных процессов, в том числе используемых зондов, подготовки образцов и фиксации, выборки изображений и реконструкции. И, наконец, хотя зонды и антитела , основанные домен , указанный ИД широко используются в исследованиях фосфоинозитидного 46,47 остается возможным , что не все PI (4,5) P 2 в мембране могут быть обнаружены с помощью этого подхода. Например, PI (4,5) P 2 связанными другими эндогенными белками , не могут быть доступны для PH зондов или антител, и это может привести к недооценке PI (4,5) P 2 из - за пространственной воспрепятствования зондировать себя. Альтернативный способ маркировки PI (4,5) P 2 будет использовать Top-Fluor PI (4,5) P 2 48, предварительно меченных PI (4,5) P 2 аналог с модификацией на хвосте оригинала PI (4,5) P 2. Тем не менее, она может быть быстро превращается в другие подтипы фосфоинозитидного быстрым клеточного метаболизма живых, так как его инозит кольцо такое же, как endogenous PI (4,5) P 2. В этой связи возникает озабоченность ли эта предварительно меченных PI (4,5) P 2 аналоговых в живых клетках может точно представлять PI (4,5) P 2 , а не его продукты метаболизма. Поэтому, несмотря на некоторые ограничения, зонды на основе домена PH по - прежнему один из лучших зондов, которые широко используются для мониторинга распределения PI (4,5) P 2 и динамику на ПМ клеток. Будущее применение этой методологии может быть распространена и на другие исследования фосфоинозитидного, таких как PI (3,4,5) P 3 и PI (3,4) P 2. Таким образом, новый SMLM подход, используемый здесь, открывает новые пути для изучения фосфоинозитидного в клетках. Использование PI (4,5) P 2 в качестве примера, мы покажем уникальные свойства изображения PALM в морфологической и количественного исследования клеточных мембран молекул, а также свои недостатки. Такой подход может быть адаптирован к другим молекулам интересов и будет иметь широкое применение в клеточной биологии.

Фосфоинозитиды внести свой вклад в небольшой части общего количества мембранных липидов, но играют важную роль в различных клеточных процессов. Они включают в себя семь членов , полученных из обратимого фосфорилирования или дефосфорилирования инозитольного колец на 3 - й, 4 - й и 5 - й позиции 1. Фосфатидилинозитол 4-фосфат (PI4P) и фосфатидилинозитол 4,5-бисфосфат (PI (4,5) P 2) являются двумя основными фосфоинозитиды , которые функционируют независимо друг от друга относительно как детерминант липидов клеточной мембраны плазмы (ПМ) 2,3. Фосфатидилинозитол (3,4,5) -trisphosphate (PIP 3) гораздо менее многочисленны , чем PI4P и PI (4,5) P 2, но она имеет уникальные функции в различных клеточных процессах , включая рак и диабет 4 5. Эти липиды имеют сложные молекулярные взаимодействия с их эффекторами и многих других белков. Поэтому крайне важно, чтобы понять пространственную организацию этих фоsphoinositides в ПМ в нанометровом масштабе. Монтажные данные показали , что белковые комплексы или кластеры молекулы в условиях ограниченного пространства ТЧ могут служить в качестве сигнальных точек доступа 6. Например, синтаксин 1a, ключевой белок , который регулирует слияние мембран 7-9, отображает организацию кластеров в ПМ. В отличие от представления консенсус кластера организации синтаксин 1а, пространственное распределение фосфоинозитидов в ПМ является спорным. Структуры распределения PI (4,5) P 2 в диапазоне от равномерного 10-12, крупные пятна 13,14, плотных кластеров 14-18, в зависимости от типов клеток и экспериментальных методов , используемых. Пространственная организация PI (4,5) P 2 с более высоким разрешением также противоречивы. Исследование , проведенное с использованием стимулированного излучения истощения (STED) микроскопии 19 показал большое количество плотной PI (4,5) P 2 нанокластеров (~ 73 нм в диаметре) в ПМ листов РС-12 ячеек 20 </sвверх&gt;. Этот результат отличается от исследований с использованием быстрого замораживания электронной микроскопии (ЭМ) 21,22, подход , который сохраняет цельную структуру ПМ живых клеток намного лучше , чем химической фиксации. Последние показали отличные бассейны PI (4,5) P 2; относительно концентрированным PI (4,5) P 2 в кавеол и покрытых ямок, а также равномерное распределение на плоской ПМ области. Кроме того, наноразмерные PI (4,5) P 2 организация в мембранных листов могут отличаться в живых и фиксированных клеток. Наша недавняя работа исследовал этот вопрос как стационарных , так и живых клеток INS-1 с использованием одной молекулы локализации микроскопии (SMLM) 23. SMLM основан на стохастически включении только небольшое подмножество флуорофоров в любой момент времени, так что отдельные флуорофоры могут быть локализованы с высокой точностью. Многие подходы формирования изображения сверхвысокого разрешения были разработаны с использованием аналогичных принципов, чтобы превзойти дифракционный предел обычной световой микроскопии, такойs фотоактивация локализации микроскопии (PALM) 24, флуоресценция локализация фотоактивация микроскопии (FPALM) 25, стохастические оптической микроскопии реконструкции (STORM) 26,27 и прямой STORM (dSTORM) 28. С фото-переключаемые или фотоактивируемых флуорофоров (красители или флуоресцентные белки), методы SMLM позволяют ученым изображения биологических структур на нанометровым разрешением 24,29,30 с видео-скоростью в живых клетках 31,32. Использование PI (4,5) P 2 в качестве примера, мы ввели SMLM подход к изучению распределения наноразмерных фосфоинозитидов на ПМ. Домен РН PLCδ1 (фосфолипазы C б1) , который специфически связывается с PI (4,5) P 2 представляет собой хорошо установленный зонд для визуализации PI (4,5) P 2 субклеточном распределения и динамики 33,34 в ПМ , Мы генетически помечены этот домен с двумя флуоресцентными белками, PAmCherry1 35 и iRFP 36 </SUP&gt; для получения двойного цвета слитый белок (iRFP-PAmCherry1-PH PLCδ1) (рис 1A-B). PAmCherry1 служит Фотоактивируемые зондом домена PH для PALM и iRFP служит общим индикатором для выявления трансфицированных клеток до приобретения PALM , Мы применяем этот двухцветными флуоресцентный зонд для SMLM визуализации в фиксированных мембранных листов. Для PALM изображений живых, мы помечены mEOS3 37 вместо PAmCherry1 к домену PH PLCδ1 для генерации mEOS3.1-PH PLCδ1 зонд для его лучшей эффективности фотонного и яркости (рис 1C-D). SMLM изображений с этими новыми зондами в ПМ INS-1 клеток , 38 секретирующих инсулин раскрыло гомогенную мечение PI (4,5) P 2 в большинстве регионов РМ, а также концентрированное PI (4,5) P 2 микродомены, которые слабо перемешаны в квартире PM и некоторых филоподий-подобных структур 23. Затемnoscale распределение PI (4,5) P 2 обеспечивает структурную основу для переосмысления , как он функционирует в живых клетках.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="791">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microscope</td>
			<td style="width:199px;">Nikon</td>
			<td style="width:184px;">Ti-U</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sCMOS camera</td>
			<td style="width:199px;">Andor</td>
			<td style="width:184px;">Neo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spinning disk</td>
			<td style="width:199px;">Yokogawa</td>
			<td style="width:184px;">CSU X-1, 10,000 rpm&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">&#160;High Power Monolithic Laser Combiner SP with 405, 488, 561 and 642 nm lasers.</td>
			<td style="width:199px;">Agilent</td>
			<td style="width:184px;">MLC400</td>
			<td style="width:193px;">laser original powers &#38; powers at the end of optical fiber) 
			405nm: 15 mW &#38; 13 mW; 
			488nm: 45 mW &#38; 42 mW; 
			561nm: 45 mW &#38; 40 mW; 
			640nm: 35 mW &#38; 16 mW.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100X Objective</td>
			<td style="width:199px;">Nikon</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td>APO 100X Oil, NA 1.49, WD 0.12mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nikon acquisition and analysis software(NIS Element)</td>
			<td style="width:199px;">Nikon</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Matlab</td>
			<td style="width:199px;">MathWorks</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Coverslip</td>
			<td style="width:199px;">Warner</td>
			<td style="width:184px;">64-0714</td>
			<td>Round 18mm coverslip, #1.5&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:199px;">Millipore</td>
			<td style="width:184px;">FC010-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Lipofectamin 3000(transfection reagent)</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:184px;">L3000-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:199px;">Electron Microscopy Science</td>
			<td style="width:184px;">#16120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PI(4,5)P2 1st antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-53412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">secondary antibody&#160; F(ab&#8217;)2-goat-anti-mouse Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen</td>
			<td>A-21237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tetraspeck beads</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:184px;">T7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">magnetic quick release imaging chamber&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:184px;">Cat#641994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">temperature controller</td>
			<td style="width:199px;">Warner Instruments</td>
			<td>TC-344C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phosphate buffer saline</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EGTA</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:184px;">3780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NH4Cl</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">A0171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Goat serum</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">bovine serum albumin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CaCl2*2H2O</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:184px;">223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MgCl2*6H2O</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraformaldyhyde</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule super-resolution imaging of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the plasma membrane with novel fluorescent probes

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a determinant phosphoinositide of the plasma membrane (PM), and it is required to modulate ion channels, actin dynamics, exocytosis, endocytosis, intracellular signaling, and many other cellular processes. However, the spatial organization of PI(4,5)P2 in the PM is controversial, and its nanoscale distribution is poorly understood due to the technical limitations of research approaches. Here by utilizing single molecule localization microscopy and the Pleckstrin Homology (PH) domain based dual color fluorescent probes, we describe a novel method to visualize the nanoscale distribution of PI(4,5)P2 in the PM in fixed membrane sheets as well as live cells.

Неопределенность локализации (σ) нашей системы супер-разрешение составляет 14,73 нм 23. Прямые сравнения между TIRF и пальмовое изображений продемонстрировали значительное улучшение пространственного разрешения. Рисунок 3A-B показывает , представитель PI (4,5) P 2 TIRF изображений , меченные PI (4,5) P 2 антитела и iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 в типичных мембранных листов и живых клеток. Изображения с традиционной TIRF микроскопии в мембранных листов удивительно похожи на те , в неповрежденных живых клеток , меченных с повышенной зеленого флуоресцентного белка (EGFP) помечено PH домены (EGFP-PH PLCδ1) (рис 3C). Все образцы показали равномерное распределение зондов. В противоположность этому , неоптимальное фиксация образцов привело к резкому плотной PI (4,5) P 2 кластеров и уменьшение интенсивности сигнала (рис 4). При оптимальных условиях фиксации, тон изображения супер-разрешением PI (4,5) P 2 в фиксированных клеток (рисунок 5) показал равномерное распределение зондов в значительной части ПМ только с ограниченным градиентов концентрации. Некоторые мембранные участки , обогащенные PI (4,5) P 2 зондов были распределены редко и имели различные размеры. Живая клетка PALM изображения отображаются аналогичное пространственное распределение в виде неподвижных клеток (рисунок 6). Детальный анализ PI (4,5) P 2 сигналов по времени приводит к быстрой динамики в локальных областях, без существенных изменений их численности в широких областях. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig1.jpg" /> Рисунок 1. Схема для флуоресцентных зондов , используемых в данном исследовании. (AB) iRFP-PAmCherry1-PH PLC б1 зонд , используемый в экспериментах с фиксированной мембраной листа. Во время обычного TIRF визуализации (А), 640 нм<html> лазер используется для возбуждения iRFP (Ex: 692 нм; Em: 713 нм). TIRF изображение , полученное в этом состоянии служит в качестве эталонного изображения TIRF для сверхвысокого разрешения изображений , полученных с помощью PALM томографии (B). 405 нм лазер используется для фото-активации флуорофор PAmCherry1 и 561 нм лазер используется для возбуждения PAmCherry1 (Ex: 564 нм, Em: 595 нм) для работы с изображениями PALM. (CD) mEos3.1-PH PLCδ1 зонд , используемый в экспериментах живых клеток. (C) Во время обычного TIRF визуализации, 488 нм лазер используется для возбуждения mEOS3.1 (Ex: 506 нм, Em: 519 нм). (D) После фотоконверсии по 405 нм лазером, mEos3.1 превращается в красной форме (Ex: 573 нм, Em: 584 нм). И 561 нм лазер используется для приобретения PALM <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig1large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig1large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию эта фигура.</a> s / ftp_upload / 54466 / 54466fig2.jpg &quot;/&gt; Рисунок 2. Схема мембранного препарата листа из клеток СИН-1. (А) Поместите покровное с культивируемыми клетками , стоящих вниз на покровное ФДЛ покрытием и ждать , 7 ~ 10 мин при 4 ° С , чтобы позволить прикрепление клеток к PDL- покровное покрытие. (B) снимите верхний покровное с помощью пинцета и закрепите мембранный лист , прикрепленный к предварительно покрытой покровным PDL. (C) Изображение образцов с TIRFM и пальмовое. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig2large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig2large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig3.jpg" /> Рисунок 3. PI (4,5) P 2 пространственная организация похожа между мембранными листами и неповрежденных живых клеток под обычным микроскопом TIRF. (A)Типичная TIRF изображение мембранных листов фиксируется при 4 ° С с 4% PFA и 0,2% GA. PI (4,5) P 2 метили PI (4,5) P 2 специфические антитела. (B) Мембрана лист из INS-1 клетки , экспрессирующие iRFP-PAmCherry1-PH PLC б1. (С) TIRF изображение двух интактных живых клеток , экспрессирующих EGFP-PH PLCδ1 на разных уровнях. Шкала баров: (A): 3 мкм; (B) и (C):. 5 мкм <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig3large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig3large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 4" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig4.jpg" /> Рисунок 4. PI (4,5) P 2 пространственная организация в мембранных листов чувствителен к общим условий фиксации. (А) очистки мембранным листов фиксируется при 37 ° С с 4% PFA в одиночкуи метили PI (4,5) P 2 специфическими антителами (как показано на Рисунке 3А). (B) Мембранный лист фиксируется при КТ только PFA и метили PI (4,5) P 2 специфические антитела. Следует отметить , что плотные скопления PI (4,5) P 2 зонда хорошо видны под микроскопом TIRF, в отличие от гораздо более даже флуоресцентных изображений , показанных на рисунке 3А. Шкала баров: AB:. 3 мкм <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig4large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig4large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 5" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig5.jpg" /> Рисунок 5. PALM визуализация PI (4,5) P 2 зондов показывает их распределение в нанометровом масштабе в ИНС-1 клеток PM. (A) iRFP TIRF изображение мембранного листа из INS-1 клетки , экспрессирующие iRFP-PAmCherry1-PH PLCδ1. (В) Соответствующая PALM образ ПМ в том же регионе на основе реконструкции PAmCherry1 сигнала. Обратите внимание на однородное PI (4,5) P 2 пространственное распределение в основных регионах PM и несколько PI (4,5) P 2 микродомены. (С) Увеличенный вид в штучной упаковке области в (B). Стрелки указывают единично PM микродоменов , обогащенные PI (4,5) P 2 датчика. Масштабные бары: А и Б: 3 мкм; C: 500 нм. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig5large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig5large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 6" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig6.jpg" /> Рисунок 6. PALM визуализации в клетках живых INS-1. (А) TIRF образ PI (4,5) P 2 в прямом эфире INS-1 клеток , экспрессирующих mEos3.1-PH PLCδ1. Изображение быстро приобрела в зеленом канале до приобретения PALM (35 ° C). (B) Последовательные живых клеток PALM изображения на 10 секундным интервалом. Вставках показаны профили интенсивности локального PI (4,5) P 2 плотности вдоль той же прямой линии 1 позицию в разное время в (В) и (С). Обратите внимание, их большие локальные изменения интенсивности в течение 10 сек. (D) Временной ход средних изменений интенсивности PI (4,5) P 2 в большой площади (BOX2, 3х3 мкм) и малых кругов (3, 4, и 5, диаметр 500 нм) в (B) в течение 5 мин изображения PALM (кадр / 10 сек). Обратите внимание на резкие колебания интенсивности локальных PI (4,5) P 2 зонда (круг 3, 4 и 5) по сравнению с очень небольшими изменениями в широкой области (вставка 2). (Е) Увеличенная PALM изображения региона BOX2 в (B) в указанное время. Стрелки указывают PI (4,5) P 2 , обогащенные мембранные участки под рhysiological условия. Шкала баров: C: 3 мкм; E: 500 нм. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig6large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig6large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig6large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes at JoVE.com

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

PI (4,5) P 2 регулирует различные клеточные функции, но его наноразмерных организация в клеточной мембране плазмы мало изучен. Навешивая PI (4,5) P 2 с двухцветными флуоресцентным зондом , слитого с доменом Pleckstrin гомологий, мы опишем новый подход для изучения PI (4,5) P 2 пространственное распределение в мембране плазмы в нанометровом масштабе ,

Одиночных молекул Super-Resolution Imaging фосфатидилинозит 4,5-бисфосфат в плазматической мембране с новыми флуоресцентных зондов

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Используя строительные леса, липосом Развести липидами проксимальный белок-белковых взаимодействий<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Высокая точность FRET на уровне одиночной молекулы для определения структуры биомолекулы

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Одноместный молекула манипуляции G-quadruplexes, Магнитные пинцеты

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

С использованием трехцветной сингл молекула лад для изучения корреляции взаимодействий протеина

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Измерения транс плазмы мембраны переноса электронов, C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Ковалентной иммобилизации белков для одной молекулы силой спектроскопии

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Количественная оценка протеома общесистемной маркировки однородность на уровне одной молекулы

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Одномолекулярная слежение за микроскопией - инструмент для определения диффузивных состояний цитосолильных молекул

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Взаимодействие с и Мембрана Пермябилизация митохондрий мозга амилоида Фибрилс

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Производство динамовских и кинезинских моторных ансамблей на наноструктурах ДНК оригами для наблюдения за одной молекулой

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...