Name: "phagosome closure assay" to visualize phagosome formation in three dimensions using total internal reflection fluorescent microscopy (tirfm)
Uploaded: 2016-08-26T15:00:00
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We thank Dr. Alexandre Benmerah (Institut Imagine Necker, Paris, France) for initial discussions on the experimental approach and Dr. Jamil Jubrail for reading the manuscript. Nad&#232;ge Kambou and Susanna Borreill are acknowledged for performing experiments with the method in our laboratory. This work was supported by grants from CNRS (ATIP Program), Ville de Paris and Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), Fondation pour la Recherche M&#233;dicale (FRM INE20041102865, FRM DEQ20130326518 including a doctoral fellowship for FMA) to FN, and Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les h&#233;patites virales" (ANRS) including a doctoral fellowship for JM.

Nota: El plásmido utilizado Lifeact-mCherry es una especie de regalo del Dr. Guillaume Montagnac, Institut Curie, París, generada tras 17. 1. Células y transfección Nota: los macrófagos RAW264.7 se cultivan a sub confluencia en medio completo (RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640, HEPES 10 mM, piruvato de sodio 1 mM, 50 mM β-mercaptoetanol, 2 mM L-glutamina y 10% de FCS ( fetal Calf Serum)) en una placa de 100 mm. Ellos son transfectadas con plásmidos que codifican las proteínas e...

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	<li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+phagocytosis.">The cell biology of phagocytosis.</a> Ann Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).</li><li>Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+cups+into+phagosomes+and+macropinosomes.">Shaping cups into phagosomes and macropinosomes.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 639-649 (2008).</li><li>Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+and+comparative+innate+immunity:+learning+on+the+fly.">Phagocytosis and comparative innate immunity: learning on the fly.</a> Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).</li><li>Niedergang, F., Bradshaw, R. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate+hydrolysis+directs+actin+remodeling+during+phagocytosis.">Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis.</a> J Cell Biol. 169, 139-149 (2005).</li><li>Schlam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositide+3-kinase+enables+phagocytosis+of+large+particles+by+terminating+actin+assembly+through+Rac/Cdc42+GTPase-activating+proteins.">Phosphoinositide 3-kinase enables phagocytosis of large particles by terminating actin assembly through Rac/Cdc42 GTPase-activating proteins.</a> Nat Commun. 6, 8623 (2015).</li><li>Marion, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NF-kappaB+Signaling+Protein+Bcl10+Regulates+Actin+Dynamics+by+Controlling+AP1+and+OCRL-Bearing+Vesicles.">The NF-kappaB Signaling Protein Bcl10 Regulates Actin Dynamics by Controlling AP1 and OCRL-Bearing Vesicles.</a> Dev Cell. 23, 954-967 (2012).</li><li>Loovers, H. 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The experimental protocol described here proposes an unprecedented method to follow in real time and in living cells, with high-resolution, the formation of a phagosome and in particular its closure. Several technical aspects have to be discussed. Firstly, the assay is very sensitive to temperature. It is very important to check that the heating chamber is at 37 &#176;C and that all media, devices or cells are kept within the chamber to avoid temperature changes that could impair the efficiency of phagocytosis. We notice...

La fagocitosis es un función de la célula importante que comienza con el reconocimiento y la unión de material a receptores de superficie, que entonces conduce a la internalización y la degradación del material ingerido. Mientras que los eucariotas unicelulares, como el moho Dictyostelium discoideum amebas y utilizan para la alimentación de la fagocitosis de las bacterias, organismos superiores han evolucionado con células profesionales. Los macrófagos o células dendríticas son la primera línea de defensa contra los patógenos en diversos tejidos y órganos, y son cruciales para activar el sistema inmune adaptativo a través de la presentación de antígenos y la producción de citoquinas 1-4. Bajo ciertas circunstancias fagocitosis se puede realizar por las células fagocíticas no profesionales, por ejemplo, células endoteliales y epiteliales. Este proceso es importante para mantener la homeostasis durante el desarrollo y en la edad adulta para recambio de tejido normal y de remodelación. fagocitos Por último, especializadas tales como células de Sertoli en los testículos o de la retinacélulas epiteliales pigmentarias son extremadamente potentes fagocitos 5. La formación de un fagosoma donde la degradación de microorganismos o restos celulares se produce comienza con la agrupación de receptores fagocíticas en la superficie de la célula fagocítica. los eventos de señalización siguientes agrupación de receptores opsónicos tales como receptores de Fc (FcR) o receptores del complemento (CRS) han sido bien caracterizados. Sin embargo, también hay numerosos receptores no opsónicos incluyendo los receptores tipo Toll (TLRs), lectinas, receptores de manosa y receptores scavenger. Estos receptores reconocen determinantes en la superficie de las partículas tales como manosa o fucosa residuos, la fosfatidilserina, y lipopolisacáridos 1,6-9. reconocimiento de patógenos o restos de células implica la unión a y la agrupación de varios tipos de receptor fagocítico, que luego conducen a la intensa y transitoria remodelación de actina. En paralelo exocitosis, focal de compartmen intracelularts contribuye a la liberación de tensión de la membrana y es importante para la fagocitosis eficaz de partículas grandes. Los eventos de señalización que conducen a la actina polimerización y la deformación de la membrana fueron disecados en modelos experimentales que han activado un único receptor de fagocitosis. Durante la fagocitosis mediada por FcR, hay una intensa polimerización de actina que se rige por las pequeñas GTPasas (Rac, Cdc42). Entre sus efectores, la proteína del síndrome de Wiskott-Aldrich (WASP) conduce a la activación de la proteína actina-Related 2/3 compleja (Arp2 / 3) que nuclea los filamentos de actina 1,2,4,10. La producción local de, 5-bisfosfato (PI (4,5) P2) fosfatidilinositol-4 es crucial para la polimerización de actina inicial que impulsa la formación de pseudópodos. Se requiere su conversión a PI (3,4,5) P 3 para la extensión de pseudópodos y el cierre fagosoma 11. Varias vías contribuyen a la desaparición de PI (4,5) P 2. En primer lugar el desprendimiento de Kina fosfato fosfatidilinositolses (PIPKIs) del PI detenciones fagosoma (4,5) P2 síntesis. En segundo lugar, puede ser fosforilada y consumida por la clase I PI3K quinasas (PI3K) y convertido en PI (3,4,5) P 3 12. El papel de las fosfatasas y fosfolipasas también se ha implicado en el PI (4,5) P2 hidrólisis y eliminación de F-actina durante la fagocitosis en células de mamíferos y en Dictyostelium 13,14. La fosfolipasa C (PLC) δ hidroliza PI (4,5) P 2 en diacilglicerol y fosfato de tris inositol-1,4,5-. El OCRL fosfatasa PI (4,5) P 2 y PI (3,4,5) P 3 (síndrome oculocerebrorenal de Lowe) también ha sido implicado en la formación de fagosoma. formación local precisa de F-actina y su despolimerización está estrechamente regulada en el espacio y el tiempo y hemos demostrado que el reclutamiento de los compartimentos intracelulares es importante entregar localmente la fosfatasa OCRL, contribuyendo así a la despolimerización de la actina local en la base de la copa de fagocitosis <sup&gt; 13,15. Para ello, se utilizó el dispositivo experimental descrito aquí. El mecanismo y moleculares jugadores necesarios para el cierre fagosoma y escisión de la membrana aún bien definidos debido a las dificultades en la visualización y el control de la sede de cierre fagosoma. Hasta hace poco, se observó fagocitosis en células fijadas o que viven que internalizan las partículas en su cara dorsal o en sus lados, por lo que la visualización oportuna del sitio de cierre fagosoma difícil. Además, los métodos de fijación pueden provocar la retracción de las membranas y el sesgo de los resultados sobre la extensión de pseudópodos y cierre. Por el contrario, el ensayo que hemos establecido y describir aquí nos permite visualizar la extensión de pseudópodos y la etapa de cierre de la fagocitosis en células vivas 13, basado en microscopía de reflexión interna total (TIRFM) 16. Esta técnica óptico utiliza una onda evanescente para excitar fluoróforos en un área delgada en la interfaz entre un modo transparentetapa (cubreobjetos) y un (medio de cultivo celular) de líquido. El grosor de la profundidad de excitación es de alrededor de 100 nm desde la superficie sólida, que permite la visualización de los eventos moleculares cerca de la membrana plasmática. TIRFM permite una alta relación de señal a fondo, y limita la fluorescencia fuera de foco recogido y la citotoxicidad debido a la iluminación de las células. Aprovechando TIRFM, desarrollamos el &quot;ensayo de cierre fagosoma&quot; en el que los cubreobjetos se activan con poli-lisina y luego recubiertas con células rojas de la sangre opsonizadas-IgG (IgG-SRBC). Los macrófagos que expresan proteínas transitoriamente marcado con fluorescencia de interés se dejan engullir las IgG-SRBC. Mientras que las células se separan las partículas objetivo que están no covalentemente unido a la superficie del vidrio, las puntas de los seudópodos pueden ser observados y registrados en el modo de TIRF. adquisiciones TIRF se combinan con adquisiciones en el modo de epifluorescencia, después de cambiar la etapa 3 m por encima, lo que permite la visualization de la base de la copa de fagocitosis. La adición de fármacos farmacológicos tales como los que la inhibición de la actina o dynamin durante el proceso también es posible diseccionar más el proceso a nivel molecular. El protocolo se describe en detalle aquí es de una línea celular de macrófagos murinos RAW264.7 y partículas opsonizadas, pero prácticamente, puede ser adaptado a cualquier otra célula fagocítica y con otros objetivos tales como perlas. Este método permitirá una mejor caracterización de la regulación en el tiempo y en el espacio de los jugadores moleculares implicados en la extensión de pseudópodos y el cierre fagosoma durante varios procesos de fagocíticas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-sheep red blood cells IgG</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>55806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin heat shock fraction, pH 7, &#8805;98%&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes 4mm</td>
			<td>Cell project</td>
			<td>EP104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>Room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrobuffer kit</td>
			<td>Cell project</td>
			<td>EB110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm TC-Treated Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene X-cell pulser</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>165-2661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dishes 35 mm uncoated 1.5</td>
			<td>MatTek corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C Case</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMIC&#160;</td>
			<td>TILL Photonics</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Oil-immersion objective&#160;(N 100x, NA1.49.),&#160; heating chamber with CO2, a camera single photon detection EMCCD ( Electron Multiplying Charge Coupled Device) and a 1.5X lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine Solution 0.1%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920-100ml</td>
			<td>Dilution at 0.01% in water&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium GLUTAMAX&#160; Supplement</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium, no phenol red (10x500 ml)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11835-105</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep red blood cells (SRBCs)</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>DSGMTN00-0Q</td>
			<td>Conserved in Alsever buffer at 4&#176;C before use</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

"phagosome closure assay" to visualize phagosome formation in three dimensions using total internal reflection fluorescent microscopy (tirfm)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements of the actin cytoskeleton that is the driving force for plasma membrane extension around the particle. In addition, efficient engulfment of large material relies on focal exocytosis of intracellular compartments. This process is highly dynamic and numerous molecular players have been described to have a role during phagocytic cup formation. The precise regulation in time and space of all of these molecules, however, remains elusive. In addition, the last step of phagosome closure has been very difficult to observe because inhibition by RNA interference or dominant negative mutants often results in stalled phagocytic cup formation. 
We have set up a dedicated experimental approach using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) combined with epifluorescence to monitor step by step the extension of pseudopods and their tips in a phagosome growing around a particle loosely bound to a coverslip. This method allows us to observe, with high resolution the very tips of the pseudopods and their fusion during closure of the phagosome in living cells for two different fluorescently tagged proteins at the same time.

El sistema experimental descrito en este manuscrito se representa esquemáticamente en la Figura 1. Macrófagos RAW264.7 transfectadas que expresan las proteínas de interés fusionado a una etiqueta fluorescente se colocan en contacto con ovejas opsonizado-IgG glóbulos rojos (SRBC) que se fijaron de forma no covalente en el cubreobjetos. Los macrófagos pueden separar el SRBC del cubreobjetos para envolverlo. El microscopio TIRF utilizado permite la adquisición simult...

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"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy TIRFM

We describe an experimental setup to visualize with unprecedented high resolution phagosome formation and closure in three dimensions in living macrophages, using total internal reflection fluorescence microscopy. It allows monitoring of the base of the phagocytic cup, the extending pseudopods, as well as the precise site of phagosome scission.

&quot;Fagosoma Cierre de ensayo&quot; para visualizar Fagosoma Formación en tres dimensiones utilizando la reflexión interna total fluorescente Microscopía (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements ...

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