Name: rapid one-step enzymatic synthesis and all-aqueous purification of trehalose analogues
Uploaded: 2017-02-17T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues at JoVE.com

This work was funded by a grant from the National Institutes of Health (R15 AI117670) to B.M.S and P.J.W, as well as a Cottrell College Scholar Award from the Research Corporation (20185) to P.J.W. L.M.M. was supported by a Provost's Fellowship from CMU.

1. ביטוי טיהור של TreT מ coli Top10 E. הערה: נא ליצור קשר עם הכותבים לבקש זן החיידק TreT להביע (פלסמיד pBAD TreT, המכיל את הגן ט Tenax tret בשליטת החלבון AraC, הופך Top10 E. coli 19) והסכם העברת החומר הנלווה . הפרוטוקול הבא בדרך כלל נותן ת...

<ol>
	<li>Elbein, A. D., Pan, Y. T., Pastuszak, I., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+on+trehalose:+a+multifunctional+molecule.">New insights on trehalose: a multifunctional molecule.</a> Glycobiology. 13, 17-27 (2003).</li><li>Tournu, H., Fiori, A., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+trehalose+in+pathogenicity:+some+general+rules,+yet+many+exceptions.">Relevance of trehalose in pathogenicity: some general rules, yet many exceptions.</a> PLoS Pathog. 9, 1003447 (2013).</li><li>Ohtake, S., Wang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose:+Current+use+and+future+applications.">Trehalose: Current use and future applications.</a> J. Pharm. Sci. 100, 2020-2053 (2011).</li><li>Adams, R. P., Kendall, E., Kartha, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+free+sugars+in+growing+and+desiccated+plants+of+Selaginella+lepidophylla.">Comparison of free sugars in growing and desiccated plants of Selaginella lepidophylla.</a> Biochem. Syst. Ecol. 18, 107-110 (1990).</li><li>Kubota, M., Ohnishi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Glycoenzymes. , (2000).</li><li>Walmagh, M., Zhao, R., Desmet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+analogues:+latest+insights+in+properties+and+biocatalytic+production.">Trehalose analogues: latest insights in properties and biocatalytic production.</a> Int. J. Mol. Sci. 16, 13729-13745 (2015).</li><li>Kim, H. -. M., Chang, Y. -. K., Ryu, S. -. I., Moon, S. -. G., Lee, S. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+synthesis+of+a+galactose-containing+trehalose+analogue+disaccharide+by+Pyrococcus+horikoshii+trehalose-synthesizing+glycosyltransferase:+Inhibitory+effects+on+several+disaccharidase+activities.">Enzymatic synthesis of a galactose-containing trehalose analogue disaccharide by Pyrococcus horikoshii trehalose-synthesizing glycosyltransferase: Inhibitory effects on several disaccharidase activities.</a> J. Mol. Catal. B: Enzym. 49, 98-103 (2007).</li><li>Backus, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+of+unnatural+trehalose+analogs+as+a+reporter+for+Mycobacterium+tuberculosis.">Uptake of unnatural trehalose analogs as a reporter for Mycobacterium tuberculosis.</a> Nat. Chem. Biol. 7, 228-235 (2011).</li><li>Swarts, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+mycobacterial+trehalome+with+bioorthogonal+chemistry.">Probing the mycobacterial trehalome with bioorthogonal chemistry.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 16123-16126 (2012).</li><li>Rose, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+biological+evaluation+of+trehalose+analogs+as+potential+inhibitors+of+mycobacterial+cell+wall+biosynthesis.">Synthesis and biological evaluation of trehalose analogs as potential inhibitors of mycobacterial cell wall biosynthesis.</a> Carbohydr. Res. 337, 105-120 (2002).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+trehalose-based+compounds+and+their+inhibitory+activities+against+Mycobacterium+smegmatis.">Synthesis of trehalose-based compounds and their inhibitory activities against Mycobacterium smegmatis.</a> Bioorg. Med. Chem. 12, 6397-6413 (2004).</li><li>Gobec, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+synthesis,+biochemical+evaluation+and+antimycobacterial+action+of+phosphonate+inhibitors+of+antigen+85C,+a+crucial+enzyme+involved+in+biosynthesis+of+the+mycobacterial+cell+wall.">Design, synthesis, biochemical evaluation and antimycobacterial action of phosphonate inhibitors of antigen 85C, a crucial enzyme involved in biosynthesis of the mycobacterial cell wall.</a> Eur. J. Med. Chem. 42, 54-63 (2007).</li><li>Sarpe, V. A., Kulkarni, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regioselective+protection+and+functionalization+of+trehalose.">Regioselective protection and functionalization of trehalose.</a> Trends in Carbohydr. Res. 5, 8-33 (2013).</li><li>Chaube, M. A., Kulkarni, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereoselective+construction+of+1,1-alpha,alpha-glycosidic+bonds.">Stereoselective construction of 1,1-alpha,alpha-glycosidic bonds.</a> Trends in Carbohydr. Res. 4, 1-19 (2013).</li><li>Leigh, C. D., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+studies+toward+Mycobacterium+tuberculosis+sulfolipid-I.">Synthetic studies toward Mycobacterium tuberculosis sulfolipid-I.</a> J. Org. Chem. 73, 1008-1017 (2008).</li><li>Chaen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+enzymatic+synthesis+of+disaccharide,+alpha-D-galactosyl-alpha-D-glucoside,+by+trehalose+phosphorylase+from+Thermoanaerobacter+brockii.">Efficient enzymatic synthesis of disaccharide, alpha-D-galactosyl-alpha-D-glucoside, by trehalose phosphorylase from Thermoanaerobacter brockii.</a> J. Appl. Glycosci. 48, 135-137 (2001).</li><li>Vander Borght, J., Soetaert, W., Desmet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+acceptor+specificity+of+trehalose+phosphorylase+for+the+production+of+trehalose+analogs.">Engineering the acceptor specificity of trehalose phosphorylase for the production of trehalose analogs.</a> Biotechnol. Progr. 28, 1257-1262 (2012).</li><li>Kouril, T., Zaparty, M., Marrero, J., Brinkmann, H., Siebers, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+trehalose+synthesizing+pathway+in+the+hyperthermophilic+Crenarchaeon+Thermoproteus+tenax:+the+unidirectional+TreT+pathway.">A novel trehalose synthesizing pathway in the hyperthermophilic Crenarchaeon Thermoproteus tenax: the unidirectional TreT pathway.</a> Arch. Microbiol. 190, 355-369 (2008).</li><li>Urbanek, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoenzymatic+synthesis+of+trehalose+analogues:+rapid+access+to+chemical+probes+for+investigating+mycobacteria.">Chemoenzymatic synthesis of trehalose analogues: rapid access to chemical probes for investigating mycobacteria.</a> ChemBioChem. 15, 2066-2070 (2014).</li><li>Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stepwise+Huisgen+cycloaddition+process:+copper(I)-catalyzed+regioselective+"ligation"+of+azides+and+terminal+alkynes.">A stepwise Huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 41, 2596-2599 (2002).</li><li>Torn&#248;e, C. W., Christensen, C., Meldal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidotriazoles+on+solid+phase:+[1,2,3]-triazoles+by+regiospecific+copper(I)-catalyzed+1,3-dipolar+cycloadditions+of+terminal+alkynes+to+azides.">Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(I)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides.</a> J. Org. Chem. 67, 3057-3064 (2002).</li><li>Kalscheuer, R., Weinrick, B., Veeraraghavan, U., Besra, G. S., Jacobs, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose-recycling+ABC+transporter+LpqY-SugA-SugB-SugC+is+essential+for+virulence+of+Mycobacterium+tuberculosis.">Trehalose-recycling ABC transporter LpqY-SugA-SugB-SugC is essential for virulence of Mycobacterium tuberculosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 21761-21766 (2010).</li></ol>

אנלוגים trehalose יש פוטנציאל להשפיע בתחומים שונים, החל משימור מזון ותרופות כדי אבחון וטיפול של זיהומים חיידקים 6. שיטות קיימות סינתזה כימית רבות שלבים שימושיות להפקת אנלוגים trehalose מורכבים עם מספר אתרים של שינוי (למשל, המתרחשים glycolipids mycobacterial מורכב באופן...

Trehalose הוא דו סוכר סימטרי הלא צמצום מורכב משני moieties גלוקוז כי מצטרפים (איור 1 א) 1,1-α, α-glycosidic אג&quot;ח. בעוד trehalose נעדר בני אדם ויונקים אחרים, הוא נפוץ למצוא חיידקים, פטריות, צמחים, וחסרי חוליות 1. התפקיד העיקרי של trehalose ברוב האורגניזמים הוא להגן מפני לחצים סביבתיים, כגון התייבשות 1. בנוסף, פתוגנים אנושיים מסוימים דורשים trehalose עבור ארסיות, כולל שחפת Mycobacterium גרימה-שחפת, אשר מנצלת trehalose כמתווך של ביוסינתזה מעטפת תא כאבן בניין לבניית glycolipids אימונו-2. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54485/54485fig1.jpg" /> איור 1: trehalose ו אנלוגים trehalose. (אמבנים) של trehalose הטבעי באנלוג trehalose טבעי, כאשר X הוא שינוי מבני. (ב) דוגמאות של אנלוגים trehalose מהמדווח בספרות כי יש יישומים פוטנציאליים biopreservation ו bioimaging. בשל המבנה פיסיולוגי הפונקציות הייחודיים שלה, trehalose משך תשומת לב משמעותית לשימוש ביו (טכנו) יישומים הגיוניים ביו 3. מאפייני המגן של trehalose שנצפתה Nature-למשל, היכולת המרשימה שלה כדי לסייע לקיים חיים בצמחים &quot;תחיית מתים&quot; שעברו התייבשות קיצונית 4 -האם דרבנו השימוש הנרחב שלה ביישומי biopreservation. Trehalose נעשה שימוש כדי לשמור על מגוון רחב של דגימות ביולוגיות, כגון חומצות גרעין, חלבונים, תאים ורקמות 3. למשל, trehalose משמש כתוסף מייצב מספר t תרופותכובע הנמצא בשוק, כולל נוגדנים חד שבטיים כמה אנטי סרטניים 3. כמו כן, trehalose משמש כממתיק בתעשיית המזון, וזה נעשה שימוש נרחב לשימור מוצר בשתי תעשיות המזון והקוסמטיקה. אימוץ trehalose עבור סוגים אלה של יישומים מסחריים בתחילה היה מוגבל על ידי חוסר היכולת להשיג בכמויות גדולות של trehalose הטהור ממקורות טבעיים או באמצעות סינתזה. עם זאת, תהליך אנזימטי יעיל לייצור החסכוני של trehalose מעמילן פותח לאחרונה, אשר דרבן השימוש המסחרי הנרחב שלו 5. מבחינה כימית שונה נגזרות של trehalose, תיקרא להלן אנלוגים trehalose, צברו תשומת לב גוברת עבור יישומים שונים (מבנה גנרי שמוצג באיור 1 א; דוגמאות ספציפיות של אנלוגים trehalose שמוצג באיור 1) 6. לדוגמה, לקטו-trehalose הוא אנלוגי trehalose עם אחת מיחידות גלוקוז שלה מוחלף עם גלקטוז, ובכך קבוצת הידרוקסיל 4-עמדתה בעל תצורה stereochemical הפוכה. יש לקטו-trehalose אותו במאפייני הייצוב כמו trehalose אבל הוא עמיד השפלה ידי אנזימים במעיים, מה שהופך אותו אטרקטיבי כתוסף מזון שאינו הקלורי 6, 7. העניין של הקבוצה שלנו ב אנלוגים trehalose מתייחס בעיקר לשווים כפי בדיקות ספציפיות mycobacteria ומעכבים. קבוצות בארי דייוויס פתחו אנלוגי trehalose-keto מצומדות-והעמסה, בשם FITC-קטו-trehalose, אשר הוצג מטבולית לתייג את דופן התא של שחפת חייה, מה שמאפשר זיהוי על ידי הקרינה מיקרוסקופיה 8. המעבדה Bertozzi שפותחה קטן azido-trehalose (TreAz) אנלוגים שיכול מבחינה מטבולית לתייג את דופן התא, ובהמשך להיות detected באמצעות כימיה לחץ קרינת ניתוח 9. ההתפתחויות הללו מצביעות על האפשרות של שימוש בדיקות מבוסס trehalose כסוכני הדמיה לאבחון שחפת. אנלוגים trehalose יש גם רדופים כמו מעכבים מ שהחפת בשל הפוטנציאל שלהם לשבש מסלולי החיידק חיוניים כדאי ארסי 10, 11, 12. עד כה, המכשול העיקרי לפיתוח אנלוגים trehalose עבור ביו (טכנו) יישומים הגיוניים ביו הוא חוסר שיטות סינטטיות יעילות. שני המסלולים המסורתיים לייצור אנלוגים trehalose להסתמך על סינתזה כימית (איור 2). תוואי אחד כרוך desymmetrization / שינוי של trehalose הטבעי, ואילו השני כרוך החל אובניים בניין monosaccharide פונקציונלי כראוי וביצוע הכימי glycosylation כדילזייף את הקשר 1,1-α, α-glycosidic. גישות אלה, ואשר נדונו לאחרונה במאמרי ביקורת 13, 14, הוכיחו שימושיות עבור להשיג סינתזה רבה שלבים של כמויות קטנות של מוצרים טבעיים מורכבים המכיל trehalose, כגון -1 sulfolipid משחפת מ 15. עם זאת, שתי הגישות הן בדרך כלל לא יעילות, זמן רב, נגיש שאינם כימאים, וכן, בנוסף, אינם נחשבים להיות ידידותי לסביבה. לפיכך, סינתזת סוגים מסוימים של אנלוגים trehalose, אסטרטגיות אלה אינן אידיאליות. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54485/54485fig2.jpg" /> איור 2: גישות סינתזה אנלוגית trehalose. כימית גישות סינתזה אנלוגית trehalose, יוצגה בפינה השמאלית, השתמש נהלים רבים שלבים שכוללים פרוטק קשהtion / deprotection, desymmetrization, ו / או צעדים glycosylation. סינתזה אנזימתי, יוצג בפינה הימנית, משתמשת אנזים (ים) האחרונים stereoselectively להמיר מצעים פשוטים, לא מוגנים כדי trehalose אנלוגים בתמיסה מימית. פרוטוקול האנזימטית דיווחה בזאת משתמשת synthase trehalose (TreT) אנזים להמיר אנלוגים גלוקוז ו- UDP גלוקוז לתוך אנלוגים trehalose בשלב אחד. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54485/54485fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> תוואי biocatalytic יעילים אנלוגים trehalose יקלו על הייצור, הערכה, והיישום של הכיתה המבטיחה הזה של מולקולות. בעוד התהליך המסחרי אנזימטי לייצור trehalose 5 אינו מסתגל כדי לסנתז אנלוגים משום שהוא מנצל עמילן כמו מצע, יש נתיב biosynthetic אחרדרכים בטבע כי עשוי להיות מנוצלת לסינתזה אנלוגית trehalose. עם זאת, המחקר בתחום זה, אשר נסקר 6 לאחרונה, היה מוגבל. אחד הדיווחים השתמשו בשיטה בהשראת מסלול biosynthetic trehalose Escherichia coli לגשת אנלוגי fluoro-trehalose אחת מן-גלוקוז fluoro המקביל. עם זאת, גישה זו דורשת מערכה תלת-אנזים הגבילה יעילות בכלליות 8. גישה אחרת, שהיה כבר בחנה היא להשתמש phosphorylase trehalose (TreP) בכיוון ההפוך, אשר באופן עקרוני מתיר סינתזת צעד אחד של אנלוגים trehalose לבין מקבילי גלוקוז וגלוקוז-1-פוספט 6, 16, 17. למרות שגישה זו עשויה להיות הבטחה עתידית, הן TrePs ההיפוך והשמירה כרגע יש חסרונות לסינתזה אנלוגית. לדוגמה, TrePs היפוך יש expe להחרידמולקולת תורם nsive (β-D- גלוקוז 1-פוספט) ו TrePs שמירה יש תשואות ביטוי אנזים עניה / יציבות הפקרות מצע מוגבלת. שיפורים משמעותיים (למשל, באמצעות הנדסת אנזים) יהיה צורך לפני הסינתזה אנלוגית בתיווך TreP הוא מעשי. כיום, הגישה המעשית ביותר לסינתזה האנזימטית של אנלוגים trehalose היא להשתמש synthase trehalose (TreT) אנזים, אשר ממירה דיפוספט גלוקוז uridine (UDP) -glucose לתוך trehalose בתוך יחיד בשלב 6. אנחנו דיווחנו לאחרונה על שימוש Thermoproteus Tenax TreT-אנזים thermostable ו חד כיווני 18 -כדי לסנתז אנלוגים trehalose לבין מקבילי גלוקוז ו- UDP-גלוקוז (איור 3) 19. אנזים זה פועל רק בכיוון הסינטטי ימנע את הבעיה של שפלת trehalose נמצאת במערכת TreP. coul תגובה חד-שלבית זוd להסתיים 1 שעה, ועוד מגוון רחב של אנלוגים trehalose היו לגשת בתשואה גבוהה (עד&gt; 99% כפי שנקבע על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC)) מ מצעים אנלוגיים גלוקוז זמינים (ראה לוח 1 נציג התוצאות סָעִיף). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54485/54485fig3.jpg" /> איור 3: סינתזת צעד אחד TreT-זרז של אנלוגים trehalose. האנזים TreT מהטי Tenax יכול stereoselectively להצטרף אנלוגים גלוקוז זמינים ו- UDP גלוקוז כדי ליצור אנלוגים trehalose בצעד אחד. R 1 -R 4 = שינוי המבנים משתנים, למשל azido-, fluoro-, deoxy-, thio-, stereochemical, או שינויי תווית איזוטופי; Y = heteroatom משתנה, למשל חמצן או גופרית, או isotopically שכותרתו heteroatom. כאן, אנו מספקים מודעהפרוטוקול etailed עבור תהליך סינתזת TreT, כוללים ביטוי וטיהור TreT מן E. coli, אופטימיזציה תנאי תגובת TreT, וכן שיטת טיהור משופרת כי מתבצעת לחלוטין בשלב המימי. פרוטוקול שונה זו מאפשר סינתזה וטיהור ומועילות ויעילה של אנלוגים trehalose המגוונים בסולם למחצה preparative (10-100 מ&quot;ג). כמו כן, אנו מדגימים את השימוש בפרוטוקול זה להכנה ונהל בדיקה מבוססת-trehalose כדי mycobacteria בתוך פחות משעה 1, הדבר שאפשרה גילוי הקרינה המהיר של תאי mycobacterial.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>L24021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria broth</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>L24045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T15050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(+)-Arabinose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate,</td>
			<td rowspan="2">Fisher Scientific</td>
			<td rowspan="2">S374</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monobasic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09719D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor mini-tablets, EDTA-free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap HP nickel affinity column, 5 mL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5248-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS base ultrapure</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T60040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing, MWCO 12&#8211;14,000</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-152-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Glucose analogues</td>
			<td>CarboSynth,</td>
			<td rowspan="3"></td>
			<td rowspan="3">Examples of vendors that offer numerous glucose analogues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma Aldrich,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, American Radiolabeled Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Azido-6-deoxy glucopyranose (6-GlcAz)</td>
			<td>CarboSynth</td>
			<td>MA02620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UDP-Glucose</td>
			<td>abcam Biochemicals</td>
			<td>ab120384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rex RG 501-X8 mixed-bed ion-exchange resin</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>444-9999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra-Fine Bio-Gel P2 media</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>150-4118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-backed silica gel thin-layer chromatography plates</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1056280001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Butanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25310A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>AX0145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide, 99.8%</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>351430075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminopropyl HPLC column</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>58338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Para-formaldehyde</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>18505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkyne-488</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>761621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium ascorbate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA)</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>360538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W387520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting medium</td>
			<td>Southern Biotechnology</td>
			<td>10001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid one-step enzymatic synthesis and all-aqueous purification of trehalose analogues

מבחינה כימית גרסאות מותאמות של trehalose, או אנלוגים trehalose, יש יישומים בביולוגיה, ביוטכנולוגיה, ומדע התרופות, בין שדות אחרים. למשל, אנלוגים trehalose נושאות תגים לזיהוי שימשו לגילוי שחפת Mycobacterium ייתכן יישומים כסוכני הדמיה לאבחון שחפת. גרסאות יציבה hydrolytically של trehalose גם אלה נשאפים בשל הפוטנציאל שלהם לשמש ממתיקים שאינם הקלורי וסוכני מוגני ביו. למרות הערעור של מש&#39; זו של חומרים עבור יישומים שונים, את הפוטנציאל שלהם נשאר בלתי ממומש בשל חוסר מסלול חזק לייצור שלהם. כאן אנו מדווחים פרוטוקול מפורט לסינתזת biocatalytic צעד אחד המהירה ויעילה של אנלוגים trehalose שעוקפת את הבעיות קשורות סינתזה כימית. על ידי ניצול של synthase trehalose thermostable (TreT) האנזים מן Thermoproteus Tenax, אנלוגים trehalose יכול להיות generatאד בשינה בצעד אחד לבין מקבילי גלוקוז וגלוקוז דיפוספט uridine בתשואה גבוהה (עד מרה כמוני) ב 15-60 דקות. פרוטוקול טיהור פשוט ומהיר ללא chromatographic, אשר מורכב של דיאליזת ספין חילוף יונים, יכול לספק אנלוגים trehalose רבים של ריכוז ידוע בתמיסה מימית קטן כמו 45 דקות. במקרים בהם אנלוגי גלוקוז unreacted עדיין נשאר, טיהור chromatographic של המוצר אנלוגי trehalose יכול להתבצע. בסך הכל, שיטה זו מספקת פלטפורמת biocatalytic &quot;ירוקה&quot; לסינתזה המזורזת וטיהור אנלוגים trehalose כי הוא יעיל ונגיש-כימאים לא. כדי להדגים את תחולתה של שיטה זו, אנו מתארים פרוטוקול לסינתזה, כל-מימית טיהור, והמינהל של בדיקה הכימיה לחץ מבוסס-trehalose כדי mycobacteria, שכולן לקח פחות משעה 1 ואפשרה גילוי הקרינה של mycobacteria. בעתיד, אנו צופים כי, בין othאה יישומים, פרוטוקול זה ניתן להחיל את הסינתזה המהירה של בדיקות מבוססות trehalose לאבחון שחפת. למשל, נמשך זמן קצר אנלוגים trehalose שונים-רדיונוקלידים (למשל, 18 F-modified trehalose) יוכל לשמש עבור שיטות הדמיה קליניות מתקדמות כגון טומוגרפיה-טומוגרפיה ממוחשבת של פליטת פוזיטרונים (PET-CT).

ט Tenax TreT התקבל בחיידק הזה תשואה של כ -4 מ&quot;ג / L להשתמש בביטוי חלבון סטנדרטי טכניקות טיהור. צעד כרומטוגרפיה זיקת ניקל יחיד היה מספיק כדי לטהר TreT מן lysate coli (עקבות FPLC נציג מוצגות באיור 4). כפי שנקבע בפרסום הראשוני שלנו על תהליך הסינ?...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues at JoVE.com

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

Trehalose analogues are emerging as important molecules for bio(techno)logical and biomedical applications. We describe an optimized protocol for enzymatically synthesizing and purifying trehalose analogues that is simple, efficient, fast, and environmentally friendly. Its application to the rapid production and administration of a probe for the detection of mycobacteria is demonstrated.

צעד אחד ראפיד סינתזה האנזימטית-כל מימית טיהור של אנלוגים trehalose

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

הפקה בקנה מידה מעבדתי וטיהור של נוגדן רפואי

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

הביטוי, טיהור, פעילות אנטי מיקרוביאלית של S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 ב 1: בשלב אחד טיהור זיקה לניתוח מקבילים של חלבון, מתחמי חלבון-מטבוליט

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

טיהור, בנייתו מחדש של TRPV1 לניתוח Spectroscopic

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

ביטוי וטיהור של תעלות יונים Bestrophin מידע יונקים

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

בידוד מהיר של Mitoribosome מתאי HEK

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

מיצוי קפאין, פעילות אנזימטיות, ביטוי גנים של קפאין סינתאז מ המתלים תא צמח

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

ביטוי Solubilization, טיהור של בוראט האיקריוטים שנאים

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

גישה ניתנת להתאמה אישית לייצור אנזימטי וטיהור המוצרים הטבעיים של Diterpenoid

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

PeptiQuick, שילוב של צעד אחד של חלבונים ממברנות לתוך ביוטילדיסקי Peptiquick עבור כריכת חלבון מפושטת

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...