Name: ploidy manipulation of zebrafish embryos with heat shock 2 treatment
Uploaded: 2016-12-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment at JoVE.com

This work was supported by NIH grants R21 HD068949-01 and RO1 GM065303.

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com a University of Wisconsin - Madison e Animal Care Institucional e diretrizes Use Committee (IACUC) (University of Wisconsin - Madison Assurance número A3368-01). 1. Seleção de fêmeas para coleta de ovos via acasalamento Interrompida NOTA: protocolos baseados em FIV contar com a extrusão dos óvulos maduros de fêmeas através de pressão manual 9. protocolos anteriores usaram fêmeas diretamente de tanques ou em acasalamentos ...

<ol>
	<li>Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+(Brachydanio+rerio).">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291, 293-296 (1981).</li><li>Heier, J., Takle, K., Hasley, A., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ploidy+manipulation+and+induction+of+alternate+clevage+patterns+through+inhibition+of+centrosome+duplication+in+the+early+zebrafish+embryo.">Ploidy manipulation and induction of alternate clevage patterns through inhibition of centrosome duplication in the early zebrafish embryo.</a> Dev. Dyn. 244, 1300-1312 (2015).</li><li>Zhang, X., Onozato, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrostatic+pressure+treatment+during+the+first+mitosis+does+not+suppress+the+first+cleavage+but+the+second+one.">Hydrostatic pressure treatment during the first mitosis does not suppress the first cleavage but the second one.</a> Aquaculture. 240, 101-113 (2004).</li><li>Zhu, X. P., You, F., Zhang, P. J., Xu, J. H., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+hydrostatic+pressure+on+microtubule+organization+and+cell+cycle+in+gynogenetically+activated+eggs+of+olive+flounder+(Paralichthys+olivaceus).">Effects of hydrostatic pressure on microtubule organization and cell cycle in gynogenetically activated eggs of olive flounder (Paralichthys olivaceus).</a> Theriogenology. 68, 873-881 (2007).</li><li>Vertii, A., Zimmerman, W., Ivshina, M., Doxsey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome-intrinsic+mechanisms+modulate+centrosome+integrity+during+fever.">Centrosome-intrinsic mechanisms modulate centrosome integrity during fever.</a> Mol. Biol. Cell. 26, 3451-3463 (2015).</li><li>Walker, C., Detrich, W. H., Westerfield, M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish: Genetics and genomics. Vol. 60 Methods in Cell Biology. , 43-70 (1999).</li><li>Blanco-Vives, B., S&#225;nchez-V&#225;zquez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronisation+to+light+and+feeding+time+of+circadian+rhythms+of+spawning+and+locomotor+activity+in+zebrafish.">Synchronisation to light and feeding time of circadian rhythms of spawning and locomotor activity in zebrafish.</a> Physiol. Behav. 98, 268-275 (2009).</li><li>Dekens, M. P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+regulates+the+cell+cycle+in+zebrafish.">Light regulates the cell cycle in zebrafish.</a> Curr. Biol. 13, 2051-2057 (2003).</li><li>Pelegri, F., Schulte-Merker, S., Detrich, W., Zon, L. I., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish: Genetics and Genomics Vol. 60 Methods in Cell Biology. , 1-20 (1999).</li><li>Hart, N. H., Becker, K. A., Wolenski, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sperm+entry+site+during+fertilization+of+the+zebrafish+egg:+localization+of+actin.">The sperm entry site during fertilization of the zebrafish egg: localization of actin.</a> Mol. Reprod. Dev. 32, 217-228 (1992).</li><li>Tsaadon, A., Eliyahu, E., Shtraizent, N., Shalgi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+a+sperm+meets+an+egg:+block+to+polyspermy.">When a sperm meets an egg: block to polyspermy.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 252, 107-114 (2006).</li><li>Wong, J. L., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defending+the+zygote:+search+for+the+ancestral+animal+block+to+polyspermy.">Defending the zygote: search for the ancestral animal block to polyspermy.</a> Curr. Top. Dev. Biol. 72, 1-151 (2006).</li><li>Rappaport, R., Rappaport, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+cleavage+furrows+by+the+mitotic+spindle.">Establishment of cleavage furrows by the mitotic spindle.</a> J. Exp. Zool. 189, 189-196 (1974).</li><li>W&#252;hr, M., Tan, E. S., Parker, S. K., Detrich, H. W. I., Mitchinson, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+cleavage+plane+determination+in+early+amphibian+and+fish+embryos.">A model for cleavage plane determination in early amphibian and fish embryos.</a> Curr. Biol. 20, 2040-2045 (2010).</li><li>Yabe, T., Ge, X., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+maternal-effect+gene+cellular+atoll+encodes+the+centriolar+component+Sas-6+and+defects+in+its+paternal+function+promote+whole+genome+duplication.">The zebrafish maternal-effect gene cellular atoll encodes the centriolar component Sas-6 and defects in its paternal function promote whole genome duplication.</a> Dev. Biol. 312, 44-60 (2007).</li><li>Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+aneuploidy+in+zebrafish+with+mutations+in+the+mitotic+checkpoint+gene+mps1.">Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1.</a> Genes Dev. 18, 1527-1532 (2004).</li><li>Sakai, N., Burgess, S., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+in+vitro+fertilization+of+zebrafish+eggs+in+Hank's+saline+containing+bovine+serum+albumin.">Delayed in vitro fertilization of zebrafish eggs in Hank's saline containing bovine serum albumin.</a> Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 6, 84-87 (1997).</li><li>Roco, A. S., Olmstead, A. W., Degitz, S. J., Amano, T., Zimmerman, L. B., Bullejos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexistence+of+Y,+W,+and+Z+sex+chromosomes+in+Xenopus+tropicalis.">Coexistence of Y, W, and Z sex chromosomes in Xenopus tropicalis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112, 4752-4761 (2015).</li><li>Streisinger, G., Singer, F., Walker, C., Knauber, D., Dower, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+analyses+and+gene-centromere+distances+in+zebrafish.">Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish.</a> Genetics. 112, 311-319 (1986).</li><li>Dekens, M. P. S., Pelegri, F. J., Maischein, H. -. M., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maternal-effect+gene+futile+cycle.is+essential+for+pronuclear+congression+and+mitotic+spindle+assembly+in+the+zebrafish+zygote.">The maternal-effect gene futile cycle.is essential for pronuclear congression and mitotic spindle assembly in the zebrafish zygote.</a> Development. 130, 3907-3916 (2003).</li><li>Pelegri, F., Mullins, M., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Met. Cell Biol. Vol. 104. , 83-120 (2011).</li></ol>

As etapas críticas É fundamental para o trabalho em condições de efetiva em fertilização in vitro. Para garantir um bom suprimento de óvulos maduros (passo 1), as fêmeas configurado para o acasalamento não deveria ter sido criado em cruzes de acasalamento durante pelo menos 5 dias e deve aparecer grávida. Durante a interrupção da reprodução, um observador pode monitorar 15-30 tanques de forma adequada para a primeira aparição de extrusão de ovo natural. Interrupção de acoplam...

Este protocolo permite a manipulação de ploidia de embriões de peixe-zebra, tal como na geração de diplóides ginogenéticos homozigóticos de haplóides ginogenéticos (Figura 1) ou a produção de tetraplóides. Isto é conseguido através da indução de um atraso na citocinese correspondente a precisamente um ciclo celular (Figura 2A, 2B). O atraso tecla de um ciclo na citocinese é conseguido por tratamento com choque térmico. O protocolo padrão de Choque Térmico (SH) como originalmente descrito por Streisinger e colegas envolvido um impulso de temperatura durante o período de MPF 13-15, resultando em uma tenda a divisão celular de um ciclo durante o primeiro ciclo celular 1. A eficiência deste protocolo foi recentemente melhorado pela digitalização dos ciclos celulares início com uma janela deslizante temporal do tratamento de choque térmico. Esta verificação identificado um ponto de tempo depois de um choque de calor, ainda dentro do primeiro ciclo celular (22-24 MPF), que resulta em uma maior taxa de EMBRyos com uma tenda a divisão celular de um ciclo, que neste caso afecta o segundo ciclo celular 2. A observação de que as manipulações experimentais durante o primeiro ciclo celular interferir com a divisão celular durante o segundo ciclo celular e causar a duplicação do ADN conteúdo também tem sido relatada em outras espécies de peixe 3,4. Referimo-nos a este protocolo modificado como Choque Térmico 2 (HS2 - o termo &quot;2&quot; indica que o impulso de calor ocorre num ponto de tempo mais tarde do que o método HS padrão, e que o atraso do ciclo celular causado por HS2 ocorre durante o segundo ciclo celular ). Estes estudos mostraram que a base de prisão citocinese após o choque térmico é a inibição de duplicação centriole durante o impulso de calor, o que afecta a formação do fuso e indução sulco no seguinte ciclo celular. Resultados HS2 em rendimentos de parada do ciclo celular se aproximando de 100%, e as taxas de ploidia duplicação até 4 vezes superior HS standard 2. sagacidade embriões tratadosha choque térmico durante o ciclo celular blastomere apresentam muitos efeitos deletérios, sugerindo que o choque térmico afeta vários processos necessários para a divisão celular 2. Por outro lado, se o choque de calor é aplicada antes do início do ciclo celular (período de tempo de 0-30 MPF), parece ter efeitos consistentes com interferência específica com a duplicação centriole e não parece afectar outros processos celulares essenciais 2 . Estes estudos mostraram que o tempo antes da iniciação da divisão blastï¿½ero parece ser um período de desenvolvimento passível de choque térmico utilizando como ferramenta para manipular especificamente através da inibição de ploidia centriole. A causa subjacente da aparente selectividade para a choque térmico na duplicação centríolo é desconhecida, mas pode estar relacionada a uma degradação seletiva de subestruturas centrossoma observados em estresse por calor em certos tipos de células, como leucócitos 5. sincronização temporal de embrionáriosenvolvimento é conseguido por fertilização in vitro (FIV). O uso de esperma não tratada durante resultados de fertilização em embriões diplóides que após a HS2 induzidas por um ciclo tenda cytokinesis tornar tetraploid. O uso de espermatozóides tratados com UV, que transporta ligações cruzadas que inativam o seu DNA, resulta em embriões haplóides ginogenéticos 6, que após HSII induzidas por um ciclo cytokinesis tenda tornar diplóides ginogenéticos 2. Devido a toda a duplicação do genoma, resultando, os últimos ginogenéticos diplóides são homozigóticos em cada locus único em todo o genoma. Para concisão, nos referimos a ginogenéticos embriões haplóides como &quot;haplóides&quot; e embriões diplóides ginogenéticos homozigotos como &quot;diplóides homozigotos&quot;. Se viáveis ​​e férteis, diplóides homozigóticos pode ser utilizado para iniciar linhas estéreis e letais-livre. homozygosity direta induzida por HS2 deve também ser facilmente incorporados na análise genética ou telas genéticas, uma vez que diplóides homozigotos de fêmeas que são portadores heterozigotos de Muttaxas de exposição ções de homozigose em altas e fixas (50%) rácios 2. O protocolo a seguir descreve etapas para executar HS2 e induzem a duplicação ploidy com homozigose completa. Para a produção tetraplóide, solução de esperma deve ser tratada. Para a produção de diplóide homozigótica, o esperma deve ser inactivado por tratamento com UV. Além disso, como descrito na discussão, marcadores de pigmentos visíveis pode também ser usado para facilitar a identificação dos diplóides homozigóticos. Companheiro de peixe-zebra, principalmente durante a primeira 3 horas do início do seu ciclo de luz 7, e ambos os adultos e os ovos são sensíveis aos ritmos circadianos 8, portanto, para obter os melhores resultados do procedimento de fertilização in vitro deve ocorrer dentro deste período de tempo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Zebrafish mating boxes</td>
			<td style="width:71px;">Aqua Schwarz</td>
			<td style="width:119px;">SpawningBox1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CaCl2</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MgSO4-7H2O</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">63138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tricaine</td>
			<td style="width:71px;">Western Chemical</td>
			<td style="width:119px;">Tricaine-D (MS 222)</td>
			<td>FDA approved (ANADA 200-226)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris base</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">77-86-1</td>
			<td>to prepare 1 M Tris pH 9.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">920-1</td>
			<td>to prepare 1 M Tris pH 9.0</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fish net (fine mesh) (4-5 in)</td>
			<td style="width:71px;">PennPlax</td>
			<td style="width:119px;">(ThatFishThatPlace # 212370)</td>
			<td>available in ThatFishThatPlace</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plastic spoon</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>available in most standard stores</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dissecting scissors</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">14091-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dissecting forceps</td>
			<td style="width:71px;">Dumont</td>
			<td style="width:119px;">SS</td>
			<td>available from Fine Science Tools</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dissecting stereoscope (with transmitted light source)</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Reflective light source (LED arms)</td>
			<td style="width:71px;">Fostec</td>
			<td style="width:119px;">KL1600 LED</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri plates 10 cm diameter</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Eppendorf tubes 1.5 ml</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ice bucket</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipetteman P-1000</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette tips 1000 &#181;l</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Narrow spatula</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">14-374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Depression glass plate</td>
			<td style="width:71px;">Corning Inc</td>
			<td style="width:119px;">722085 (Fisher cat. No 13-748B)</td>
			<td>available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">UV lamp</td>
			<td style="width:71px;">UVP</td>
			<td style="width:119px;">Model XX-15 (cat No. UVP18006201)</td>
			<td>available from Fisher Scientific. Although not observed by us with this model, some UV sources have been observed to experience a decrease of intensity over time (if this is the case, see Modifications and Troubleshooting)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UV glasses</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paper towels</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:71px;">Kimberly-Clark</td>
			<td style="width:119px;">06-666-11</td>
			<td>available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Timer stop watch</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wash bottle</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">24020500</td>
			<td>available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tea strainer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>available in kitchen stores</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">beakers, 250 ml (2)</td>
			<td style="width:71px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:119px;">1000250</td>
			<td>available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">water bath (2)</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker, with accurary to 0.1 C (e.g. Shel Lab H2O Bath Series)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;">Hanks&#8217; Solution 1</td>
			<td style="width:71px;">see above</td>
			<td style="width:119px;">see above</td>
			<td>8.0g NaCl, 0.4g KCl in 100ml ddH2O. Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hanks&#8217; Solution 2</td>
			<td style="width:71px;">see above</td>
			<td style="width:119px;">see above</td>
			<td>0.358g Anhydrous Na2HPO4, 0.6g KH2PO4 in 100ml ddH2O. Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hanks&#8217; Solution 4</td>
			<td style="width:71px;">see above</td>
			<td style="width:119px;">see above</td>
			<td>0.72g CaCl2 in 50ml ddH2O. Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hanks&#8217; Solution 5</td>
			<td style="width:71px;">see above</td>
			<td style="width:119px;">see above</td>
			<td>1.23g MgSO4 &#8729; 7H2O in 50ml ddH2O. Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hank&#39;s Premix</td>
			<td style="width:71px;">see above</td>
			<td style="width:119px;">see above</td>
			<td>add, in the following order: 10.0 ml Solution 1;&#160; 1.0 ml Solution 2;&#160; 1.0 ml Solution 4;&#160; 86.0 ml ddH2O;&#160; 1.0 ml Solution 5. Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hanks&#8217; Solution 6</td>
			<td style="width:71px;">see above</td>
			<td style="width:119px;">see above</td>
			<td>0.33g NaHCO3 in 10ml ddH2O. Prepare fresh the morning of the IVF procedure.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hank&#39;s Solution (final solution)</td>
			<td style="width:71px;">see above</td>
			<td style="width:119px;">see above</td>
			<td>Combine 990ul of Hank&#8217;s Premix and 10ul of freshly made Solution 6 (NaHCO3 solution)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ploidy manipulation of zebrafish embryos with heat shock 2 treatment

Manipulação de ploidia permite transformações úteis, tais como diplóides para tetraploids, ou haplóides para diplóides. No peixe-zebra Danio rerio, especificamente a geração de diplóides ginogenéticos homozigóticos é útil na análise genética, porque permite a produção directa de homozigotos de um único mãe heterozigótica. Este artigo descreve um protocolo modificado para a duplicação de ploidia com base num impulso de calor durante o primeiro ciclo celular, choque térmico 2 (HS2). Através da inibição de duplicação centriole, este método resulta em uma tenda preciso divisão celular durante o segundo ciclo celular. A baia de divisão de um ciclo preciso, acoplado a duplicação DNA afetado, resulta na duplicação do genoma inteiro. Protocolos associados com este método incluem ovo e esperma recolha, tratamento com UV de esperma, fertilização in vitro e pulso de calor para provocar um atraso da divisão do ciclo de uma célula e a duplicação de ploidia. Uma versão modificada deste protocolo pode ser aplicadopara induzir alterações de ploidia em outras espécies animais.

Apesar de a uma célula-box ciclo citocinese, a replicação do ADN ocorre normalmente em tais embriões, o que resulta na duplicação do teor de ADN do embrião (figura 1). O protocolo Streisinger Choque Térmico (HS standard) envolve um pulso de calor durante o período de 13-15 minutos após a fertilização (MPF) e induz principalmente detenção cytokinesis durante a primeira divisão celular embrionária em 35 mpf 1,2, enquanto que o método derivado de...

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Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Um protocolo modificado para a manipulação ploidy usa um choque de calor para induzir uma tenda de um ciclo na citocinese no embrião. Este protocolo é demonstrado no peixe-zebra, mas podem ser aplicados a outras espécies.

Manipulação de ploidia de embriões Zebrafish com choque térmico 2 Tratamento

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Lesão Vessel Mecânica em embriões Zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Biologia do Desenvolvimento

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolamento e caracterização de células individuais de embriões Zebrafish

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Geração de parabiótica embriões Zebrafish por Fusion cirúrgica de Desenvolvimento blástulas

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

Afinidade Detecção de Etiquetagem endógena Receptores de embriões Zebrafish

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Manipulação funcional do gene materno produtos Usando<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturação do oócito em Zebrafish

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Potencial de membrana de neurônio motor biossensível em embriões vivos de peixe-zebra

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Indução de hipóxia em sapos vivos e embriões de peixe-zebra

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Aplicação de RNAi e calor-choque-induzida expressão de fator de transcrição para reprogramar as células germinativas de neurônios em c. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Visualização da atividade elétrica celular no Zebrafish embriões adiantados e tumores

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Imunohistoquímica do Monte Inteiro em Embriões e Larvas de Zebrafish

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...