Name: ploidy manipulation of zebrafish embryos with heat shock 2 treatment
Uploaded: 2016-12-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment at JoVE.com

This work was supported by NIH grants R21 HD068949-01 and RO1 GM065303.

Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с университетом штата Висконсин - Мэдисон и Уходу за животными и рекомендациями по использованию комитета (IACUC) (Университет штата Висконсин - Мэдисон Обеспечение номер A3368-01). 1. Выбор самок для откладки коллекции с помощью П?...

<ol>
	<li>Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+(Brachydanio+rerio).">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291, 293-296 (1981).</li><li>Heier, J., Takle, K., Hasley, A., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ploidy+manipulation+and+induction+of+alternate+clevage+patterns+through+inhibition+of+centrosome+duplication+in+the+early+zebrafish+embryo.">Ploidy manipulation and induction of alternate clevage patterns through inhibition of centrosome duplication in the early zebrafish embryo.</a> Dev. Dyn. 244, 1300-1312 (2015).</li><li>Zhang, X., Onozato, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrostatic+pressure+treatment+during+the+first+mitosis+does+not+suppress+the+first+cleavage+but+the+second+one.">Hydrostatic pressure treatment during the first mitosis does not suppress the first cleavage but the second one.</a> Aquaculture. 240, 101-113 (2004).</li><li>Zhu, X. P., You, F., Zhang, P. J., Xu, J. H., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+hydrostatic+pressure+on+microtubule+organization+and+cell+cycle+in+gynogenetically+activated+eggs+of+olive+flounder+(Paralichthys+olivaceus).">Effects of hydrostatic pressure on microtubule organization and cell cycle in gynogenetically activated eggs of olive flounder (Paralichthys olivaceus).</a> Theriogenology. 68, 873-881 (2007).</li><li>Vertii, A., Zimmerman, W., Ivshina, M., Doxsey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome-intrinsic+mechanisms+modulate+centrosome+integrity+during+fever.">Centrosome-intrinsic mechanisms modulate centrosome integrity during fever.</a> Mol. Biol. Cell. 26, 3451-3463 (2015).</li><li>Walker, C., Detrich, W. H., Westerfield, M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish: Genetics and genomics. Vol. 60 Methods in Cell Biology. , 43-70 (1999).</li><li>Blanco-Vives, B., S&#225;nchez-V&#225;zquez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronisation+to+light+and+feeding+time+of+circadian+rhythms+of+spawning+and+locomotor+activity+in+zebrafish.">Synchronisation to light and feeding time of circadian rhythms of spawning and locomotor activity in zebrafish.</a> Physiol. Behav. 98, 268-275 (2009).</li><li>Dekens, M. P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+regulates+the+cell+cycle+in+zebrafish.">Light regulates the cell cycle in zebrafish.</a> Curr. Biol. 13, 2051-2057 (2003).</li><li>Pelegri, F., Schulte-Merker, S., Detrich, W., Zon, L. I., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish: Genetics and Genomics Vol. 60 Methods in Cell Biology. , 1-20 (1999).</li><li>Hart, N. H., Becker, K. A., Wolenski, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sperm+entry+site+during+fertilization+of+the+zebrafish+egg:+localization+of+actin.">The sperm entry site during fertilization of the zebrafish egg: localization of actin.</a> Mol. Reprod. Dev. 32, 217-228 (1992).</li><li>Tsaadon, A., Eliyahu, E., Shtraizent, N., Shalgi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+a+sperm+meets+an+egg:+block+to+polyspermy.">When a sperm meets an egg: block to polyspermy.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 252, 107-114 (2006).</li><li>Wong, J. L., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defending+the+zygote:+search+for+the+ancestral+animal+block+to+polyspermy.">Defending the zygote: search for the ancestral animal block to polyspermy.</a> Curr. Top. Dev. Biol. 72, 1-151 (2006).</li><li>Rappaport, R., Rappaport, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+cleavage+furrows+by+the+mitotic+spindle.">Establishment of cleavage furrows by the mitotic spindle.</a> J. Exp. Zool. 189, 189-196 (1974).</li><li>W&#252;hr, M., Tan, E. S., Parker, S. K., Detrich, H. W. I., Mitchinson, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+cleavage+plane+determination+in+early+amphibian+and+fish+embryos.">A model for cleavage plane determination in early amphibian and fish embryos.</a> Curr. Biol. 20, 2040-2045 (2010).</li><li>Yabe, T., Ge, X., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+maternal-effect+gene+cellular+atoll+encodes+the+centriolar+component+Sas-6+and+defects+in+its+paternal+function+promote+whole+genome+duplication.">The zebrafish maternal-effect gene cellular atoll encodes the centriolar component Sas-6 and defects in its paternal function promote whole genome duplication.</a> Dev. Biol. 312, 44-60 (2007).</li><li>Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+aneuploidy+in+zebrafish+with+mutations+in+the+mitotic+checkpoint+gene+mps1.">Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1.</a> Genes Dev. 18, 1527-1532 (2004).</li><li>Sakai, N., Burgess, S., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+in+vitro+fertilization+of+zebrafish+eggs+in+Hank's+saline+containing+bovine+serum+albumin.">Delayed in vitro fertilization of zebrafish eggs in Hank's saline containing bovine serum albumin.</a> Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 6, 84-87 (1997).</li><li>Roco, A. S., Olmstead, A. W., Degitz, S. J., Amano, T., Zimmerman, L. B., Bullejos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexistence+of+Y,+W,+and+Z+sex+chromosomes+in+Xenopus+tropicalis.">Coexistence of Y, W, and Z sex chromosomes in Xenopus tropicalis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112, 4752-4761 (2015).</li><li>Streisinger, G., Singer, F., Walker, C., Knauber, D., Dower, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+analyses+and+gene-centromere+distances+in+zebrafish.">Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish.</a> Genetics. 112, 311-319 (1986).</li><li>Dekens, M. P. S., Pelegri, F. J., Maischein, H. -. M., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maternal-effect+gene+futile+cycle.is+essential+for+pronuclear+congression+and+mitotic+spindle+assembly+in+the+zebrafish+zygote.">The maternal-effect gene futile cycle.is essential for pronuclear congression and mitotic spindle assembly in the zebrafish zygote.</a> Development. 130, 3907-3916 (2003).</li><li>Pelegri, F., Mullins, M., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Met. Cell Biol. Vol. 104. , 83-120 (2011).</li></ol>

Критические шаги Крайне важно, чтобы работать в условиях эффективной экстракорпорального оплодотворения. Для того, чтобы обеспечить хороший запас зрелых яиц (этап 1), самки установить для вязки не должны были быть созданы в брачных крестов, по крайней мере, 5 дней и должен ?...

Этот протокол позволяет манипулировать плоидности у эмбрионов данио рерио, таких , как в поколении гомозиготных гиногенетических диплоидами из гиногенетических гаплоидов (рисунок 1) или для производства тетраплоидов. Это достигается за счет индукции задержки в цитокинеза , соответствующей точности одного клеточного цикла (фиг 2А, 2В). Ключом задержка в один цикл в цитокинезе достигается путем обработки теплового шока. Стандартный протокол теплового шока (HS), первоначально описанной Streisinger и его коллеги участвуют импульс температуры в течение периода 13-15 МПФ, в результате чего один цикл клеточного деления киоска в течение первого клеточного цикла 1. Эффективность данного протокола была недавно улучшена путем сканирования ранних клеточных циклов с выдвижным временного окна теплового шока лечения. Это сканирование определили более поздний момент времени для теплового шока, до сих пор в течение первого клеточного цикла (22-24 MPF), что приводит к более высокой скорости EMBRYos с деления клетки стойло на один такт, что в данном случае не влияет на вторую клеточный цикл 2. Наблюдение , что экспериментальные манипуляции во время первого клеточного цикла мешают деления клеток во время второго клеточного цикла и привести к ДНК дублирования контента также сообщалось в других видов рыб 3,4. Мы имеем в виду этого модифицированного протокола в качестве теплового шока 2 (HS2 - термин &quot;2&quot; отражает, что тепловой импульс происходит в более поздний момент времени, чем стандартный метод HS, и что задержка клеточного цикла, вызванное HS2 происходит во время второго клеточного цикла ). Эти исследования показали, что основанием для ареста цитотомии после теплового шока является ингибирование центриолей дублирования во время теплового импульса, который влияет на формирование веретена и борозды индукции следующим клеточного цикла. Результаты HS2 с выходом остановки клеточного цикла , приближающиеся 100%, а темпы плоидности дублирования в 4 раза выше , чем стандартные HS 2. Эмбрионы лечение остроумиега теплового шока во время езды на велосипеде бластомеров клеток обнаруживают много вредных эффектов, предполагая , что тепловой шок влияет на несколько процессов , необходимых для клеточного деления 2. С другой стороны, если тепловой удар наносится до начала клеточного езда на велосипеде (период времени 0-30 MPF), по- видимому, имели эффекты в соответствии с конкретным вмешательством центриолей дублирования и, кажется , не влияют на другие важные процессы в клетке 2 , Эти исследования показали, что время до начала деления бластомеров, как представляется, период развития поддаются с помощью теплового шока в качестве инструмента для специфически манипулировать плоидность через центриолей торможения. Основная причина кажущейся селективности в отношении теплового шока на центриолей дублирования неизвестна, но может быть связано с селективной деградации центросомой субструктур , наблюдаемых при тепловом стрессе в определенных типах клеток, таких как лейкоциты 5. Временная синхронизация эмбрионального девития достигается путем экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Использование необработанной спермы во время оплодотворения результатов в диплоидных эмбрионов, что при HS2-индуцированных один цикл цитокинез стойло стать тетраплоид. Использование УФ - обработанной спермы, который несет сшивок , которые инактивируют ее ДНК, результаты в гиногенетических гаплоидных эмбрионов 6, который при HSII-индуцированных один цикл цитокинез стойло стал гиногенетических Диплоиды 2. Из-за полученного целого генома дублирования, последний гиногенетических Диплоиды являются гомозиготными в каждом локусе через геном. Для краткости, мы имеем в виду гиногенетических гаплоидные эмбрионы как &quot;гаплоидов&quot;, и гомозиготных гиногенетических диплоидных эмбрионов, как &quot;гомозиготных диплоидами&quot;. Если жизнеспособной и плодородные, гомозиготные Диплоиды могут быть использованы для инициирования стерильных и летальные свободных линий. Прямой гомозиготность, индуцированный HS2 также должны быть легко включены в генетический анализ или генетических экранов, так как гомозиготных диплоидами от самок, которые являются гетерозиготными носителями Мутations ставки демонстрируют гомозиготности при высоких и фиксированной (50%). пропорции 2 Следующий протокол описывает шаги для выполнения Hs2 и индуцируют плоидности дублирования с полной гомозиготности. Для тетраплоидной производства, решение спермы должно быть не лечить. Для получения гомозиготных диплоидных производства, сперма должна быть инактивированной с помощью УФ-обработки. Кроме того, как описано в дискуссии, видимые маркеры пигмента также могут быть использованы для облегчения идентификации гомозиготных диплоидами. Данио мате в основном в течение первых 3 ч от начала их светового цикла 7, и как взрослым , так и яйца чувствительны к циркадных ритмов 8, так что для достижения наилучших результатов процедура ЭКО должно происходить в течение этого периода времени.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Zebrafish mating boxes</td>
			<td style="width:71px;">Aqua Schwarz</td>
			<td style="width:119px;">SpawningBox1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CaCl2</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MgSO4-7H2O</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">63138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tricaine</td>
			<td style="width:71px;">Western Chemical</td>
			<td style="width:119px;">Tricaine-D (MS 222)</td>
			<td>FDA approved (ANADA 200-226)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris base</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">77-86-1</td>
			<td>to prepare 1 M Tris pH 9.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">920-1</td>
			<td>to prepare 1 M Tris pH 9.0</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fish net (fine mesh) (4-5 in)</td>
			<td style="width:71px;">PennPlax</td>
			<td style="width:119px;">(ThatFishThatPlace # 212370)</td>
			<td>available in ThatFishThatPlace</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plastic spoon</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>available in most standard stores</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dissecting scissors</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">14091-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dissecting forceps</td>
			<td style="width:71px;">Dumont</td>
			<td style="width:119px;">SS</td>
			<td>available from Fine Science Tools</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dissecting stereoscope (with transmitted light source)</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Reflective light source (LED arms)</td>
			<td style="width:71px;">Fostec</td>
			<td style="width:119px;">KL1600 LED</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri plates 10 cm diameter</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Eppendorf tubes 1.5 ml</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ice bucket</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipetteman P-1000</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette tips 1000 &#181;l</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Narrow spatula</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">14-374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Depression glass plate</td>
			<td style="width:71px;">Corning Inc</td>
			<td style="width:119px;">722085 (Fisher cat. No 13-748B)</td>
			<td>available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">UV lamp</td>
			<td style="width:71px;">UVP</td>
			<td style="width:119px;">Model XX-15 (cat No. UVP18006201)</td>
			<td>available from Fisher Scientific. Although not observed by us with this model, some UV sources have been observed to experience a decrease of intensity over time (if this is the case, see Modifications and Troubleshooting)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UV glasses</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paper towels</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:71px;">Kimberly-Clark</td>
			<td style="width:119px;">06-666-11</td>
			<td>available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Timer stop watch</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wash bottle</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">24020500</td>
			<td>available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tea strainer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>available in kitchen stores</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">beakers, 250 ml (2)</td>
			<td style="width:71px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:119px;">1000250</td>
			<td>available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">water bath (2)</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker, with accurary to 0.1 C (e.g. Shel Lab H2O Bath Series)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;">Hanks&#8217; Solution 1</td>
			<td style="width:71px;">see above</td>
			<td style="width:119px;">see above</td>
			<td>8.0g NaCl, 0.4g KCl in 100ml ddH2O. Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hanks&#8217; Solution 2</td>
			<td style="width:71px;">see above</td>
			<td style="width:119px;">see above</td>
			<td>0.358g Anhydrous Na2HPO4, 0.6g KH2PO4 in 100ml ddH2O. Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hanks&#8217; Solution 4</td>
			<td style="width:71px;">see above</td>
			<td style="width:119px;">see above</td>
			<td>0.72g CaCl2 in 50ml ddH2O. Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hanks&#8217; Solution 5</td>
			<td style="width:71px;">see above</td>
			<td style="width:119px;">see above</td>
			<td>1.23g MgSO4 &#8729; 7H2O in 50ml ddH2O. Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hank&#39;s Premix</td>
			<td style="width:71px;">see above</td>
			<td style="width:119px;">see above</td>
			<td>add, in the following order: 10.0 ml Solution 1;&#160; 1.0 ml Solution 2;&#160; 1.0 ml Solution 4;&#160; 86.0 ml ddH2O;&#160; 1.0 ml Solution 5. Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hanks&#8217; Solution 6</td>
			<td style="width:71px;">see above</td>
			<td style="width:119px;">see above</td>
			<td>0.33g NaHCO3 in 10ml ddH2O. Prepare fresh the morning of the IVF procedure.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hank&#39;s Solution (final solution)</td>
			<td style="width:71px;">see above</td>
			<td style="width:119px;">see above</td>
			<td>Combine 990ul of Hank&#8217;s Premix and 10ul of freshly made Solution 6 (NaHCO3 solution)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ploidy manipulation of zebrafish embryos with heat shock 2 treatment

Манипуляция плоидности позволяет полезных преобразований, таких как диплоидами к тетраплоидов или гаплоидов к диплоидами. В данио Danio rerio, в частности генерация гомозиготных гиногенетических диплоидами полезен для генетического анализа , поскольку он позволяет прямое производство гомозигот из одной гетерозиготной матери. В данной статье описывается модифицированный протокол для дублирования плоидности, основанный на теплового импульса во время первого клеточного цикла, Heat Shock 2 (HS2). Путем ингибирования центриолей дублирования, этот способ приводит к точному стойло деления клеток во время второго клеточного цикла. Точный один цикл деления стойло, в сочетании с дублированием незатронутой ДНК, приводит к дублированию всего генома. Протоколы , связанные с этим способом , включают яйца и сбора спермы, УФ - обработка спермы, оплодотворение и тепловой импульс , чтобы вызвать задержку цикла деления одноклеточного и плоидности дублирования. Модифицированная версия этого протокола может быть примененчтобы вызвать изменения плоидности у других видов животных.

Несмотря на один клеточного цикла цитокинеза стойло, репликация ДНК происходит обычно в таких эмбрионов, что приводит к дублированию содержания ДНК эмбриона (рисунок 1). Протокол Streisinger теплового шока (стандарт HS) включает в себя тепловой импульс в течение пер...

Watch this Scientific Journal Video about Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment at JoVE.com

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Модифицированный протокол для плоидности манипуляции использует тепловой шок, чтобы вызвать срыв одного цикла в цитокинеза у ранних эмбрионов. Этот протокол демонстрируется в данио, но могут быть применимы и к другим видам.

Плоидность Манипуляция эмбрионов данио рерио с теплового шока 2 Лечение

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Механическая судно Травмы у эмбрионов данио рерио

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Выделение и характеристика отдельных клеток из эмбрионов данио рерио

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Поколение парабиотического эмбрионов данио рерио хирургическим путем Fusion разработки Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

Аффинное мечение Обнаружение эндогенного Рецепторы из эмбрионов данио рерио

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Функциональная Манипуляция материнских генных продуктов с помощью<em&gt; In Vitro</em&gt; Созревание ооцитов в данио рерио

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Мембранный потенциал монокристалла монокристалла в живых эмбрионах данио

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Индукция гипоксии у живых лягушек и эмбрионов рыбок данио

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Применение РНК-интерференции и тепло шок индуцированной выражение фактор транскрипции для перепрограммирования клетки семенозачатка нейронов в C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Визуализация сотовой электрической активности в Zebrafish ранних эмбрионов и опухоли

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Целая гора иммуногистохимия в зебрафиш эмбрионов и ларьков

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...