Name: imaging g protein-coupled receptor-mediated chemotaxis and its signaling events in neutrophil-like hl60 cells
Uploaded: 2016-09-14T14:00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells at JoVE.com

This work is supported by the intramural fund of NIAID, NIH.

<ol>
	<li>Pocha, S. M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+single+and+collective+cell+migrations+in+Drosophila:+themes+and+variations.">Cellular and molecular mechanisms of single and collective cell migrations in Drosophila: themes and variations.</a> Annual review of genetics. 48, 295-318 (2014).</li><li>Wen, Z., Zheng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+guidance+of+nerve+growth+cones.">Directional guidance of nerve growth cones.</a> Current opinion in neurobiology. 16, 52-58 (2006).</li><li>Bravo-Cordero, J. J., Hodgson, L., Condeelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cell+invasion+and+migration+during+metastasis.">Directed cell invasion and migration during metastasis.</a> Current opinion in cell biology. 24, 277-283 (2012).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+by+polymorphonuclear+leukocytes.">Chemotaxis by polymorphonuclear leukocytes.</a> The Journal of cell biology. 77, 269-287 (1978).</li><li>Jin, T., Xu, X., Hereld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis,+receptors+and+human+disease.">Chemotaxis, receptors and human disease.</a> Cytokine. 44, 1-8 (2008).</li><li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-Rex1+is+a+primary+Rac2+guanine+nucleotide+exchange+factor+in+mouse+neutrophils.">P-Rex1 is a primary Rac2 guanine nucleotide exchange factor in mouse neutrophils.</a> Current biology : CB. 15, 1874-1879 (2005).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+sensing+requires+G+beta+gamma-mediated+PAK1+and+PIX+alpha-dependent+activation+of+Cdc42.">Directional sensing requires G beta gamma-mediated PAK1 and PIX alpha-dependent activation of Cdc42.</a> Cell. 114, 215-227 (2003).</li><li>Van Haastert, P. J., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis:+signalling+the+way+forward.">Chemotaxis: signalling the way forward.</a> Nature reviews: Molecular cell biology. 5, 626-634 (2004).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPCR-Mediated+PLCbetagamma/PKCbeta/PKD+Signaling+Pathway+Regulates+the+Cofilin+Phosphatase+Slingshot+2+in+Neutrophil+Chemotaxis.">GPCR-Mediated PLCbetagamma/PKCbeta/PKD Signaling Pathway Regulates the Cofilin Phosphatase Slingshot 2 in Neutrophil Chemotaxis.</a> Mol Biol Cell. , (2015).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of experimental medicine. 115, 453-466 (1962).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors.">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> The Journal of cell biology. 75, 606-616 (1977).</li><li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber.">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> Journal of cell science. 99 (Pt4), 769-775 (1991).</li><li>Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+chamber+for+direct+visualisation+of+chemotaxis.">An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis.</a> PloS one. 5, e15309 (2010).</li><li>Bozzaro, S., Fisher, P. R., Loomis, W., Satir, P., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guenther+Gerisch+and+Dictyostelium,+the+microbial+model+for+ameboid+motility+and+multicellular+morphogenesis.">Guenther Gerisch and Dictyostelium, the microbial model for ameboid motility and multicellular morphogenesis.</a> Trends in cell biology. 14, 585-588 (2004).</li><li>Xu, X., Jin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+G-protein+coupled+receptor+(GPCR)-mediated+signaling+events+that+control+chemotaxis+of+Dictyostelium+discoideum.">Imaging G-protein coupled receptor (GPCR)-mediated signaling events that control chemotaxis of Dictyostelium discoideum.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).</li><li>Lin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+dynamic+temporal+and+spatial+concentration+gradients+using+microfluidic+devices.">Generation of dynamic temporal and spatial concentration gradients using microfluidic devices.</a> Lab Chip. 4, 164-167 (2004).</li><li>Eiseler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+D1+regulates+cofilin-mediated+F-actin+reorganization+and+cell+motility+through+slingshot.">Protein kinase D1 regulates cofilin-mediated F-actin reorganization and cell motility through slingshot.</a> Nature cell biology. 11, 545-556 (2009).</li><li>Roddie, P. H., Paterson, T., Turner, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+to+primary+acute+myeloid+leukaemia+blasts+and+myeloid+leukaemia+cell+lines.">Gene transfer to primary acute myeloid leukaemia blasts and myeloid leukaemia cell lines.</a> Cytokines Cell Mol Ther. 6, 127-134 (2000).</li><li>Schakowski, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+non-viral+method+for+transfection+of+primary+leukemia+cells+and+cell+lines.">Novel non-viral method for transfection of primary leukemia cells and cell lines.</a> Genet Vaccines Ther. 2, 1 (2004).</li><li>Uchida, E., Mizuguchi, H., Ishii-Watabe, A., Hayakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+efficiency+and+safety+of+non-viral+vector-mediated+gene+transfer+into+a+wide+range+of+human+cells.">Comparison of the efficiency and safety of non-viral vector-mediated gene transfer into a wide range of human cells.</a> Biol Pharm Bull. 25, 891-897 (2002).</li></ol>

The authors declare no competing financial interest for this work.

في هذه الدراسة، وتبين لنا مثالين من المقايسات الكيميائي: لأول مرة، ورصد في وقت واحد من المقايسات الكيميائي متعددة من قبل الجهاز تحليل حركية الخلية؛ والثانية، والتصور التدرج جاذب كيميائي وديناميات الزمانية المكانية من الإشارات الأحداث في نفس الخلايا في الوقت الحقيقي. جهاز تحليل التنقل خلية لعدة فحوصات الكيميائي في وقت واحد في هذه الدراسة، قدمنا ​​بروتوكول مفصلة لأداء عدة فحوصات الكيميائي في وقت واحد باستخدام جهاز تحليل الحركة الخلية. هذا الجهاز يسمح للمستخدم لمراقبة السلوك الكيميائي الخلوي مع 10X عدسة موضوعية في مراقبة مشرق الميدان التقليدية. بسبب الخصائص نشر المهيمن على تدفق السوائل، وجهاز تحليل التنقل خلية يولد يمكن التنبؤ بها للغاية، التدرجات مستقرة ويسمح ما يصل الى ستة الكيميائي المقايسات التي يتعين الاضطلاع بها في وقت واحد. الخطوات الحاسمة في البروتوكول هيللحصول على تدرجات موثوقة ولمحاذاة الخلايا على خط شرفة. يجب على المستخدم تتبع بدقة تعليمات الشركة الصانعة لتجميع حامل وحقن chemoattractants والخلايا. أيضا تعليمات مفصلة على شبكة الإنترنت. بالمقارنة مع الطرق البديلة الكيميائي 11-13،15، وهذا الجهاز بشكل كبير على تحسين موثوقية وكفاءة فحوصات الكيميائي. أربعة أحجام للحراك خلية التحليل رقاقة الجهاز في أحجام 4، 5، 6، و 8 ميكرون تتوفر لاستيعاب أنواع وأحجام مختلفة من الخلايا المختلفة. وجدنا أن 4 أو 5 ميكرون التنقل خلية رقاقة جهاز تحليل مناسب لHL60 ود. خلايا discoideum، والتي هي حوالي 10-15 ميكرون في القطر. ومع ذلك، الحد واحد هو أن هذا الجهاز غير مناسب لجميع أنواع من الخلايا. كان لدينا نجاح يذكر باستخدام التنقل خلية جهاز التحليل الكيميائي مقايسة مع الخلايا Raw267.4. قد يكون السبب أن الخلايا Raw267.4 تهاجر ببطء شديد. الوقت اللازم لتشي كفاءةmotaxis الخلايا Raw267.4 قد تكون أطول بكثير من الوقت الذي يتم الحفاظ على التدرج من قبل الجهاز. بدلا من ذلك، عملت فحص transwell الهجرة بشكل جيد لخلايا Raw267.4 9. الحد الآخر هو أن المراقبة الفلورسنت غير ممكن مع الجهاز الحالي. والاتجاه المستقبلي هو رصد التصوير الفلورسنت مع أعلى التكبير. وهذا ممكن مع تحسن جهاز تحليل حركية الخلية، وهو مجهز الكشف الفلوري وعدسة الهدف 100X. وبالإضافة إلى ذلك، يتم زيادة عدد فحوصات في وقت واحد أيضا إلى 12. كل هذه التحسينات تسهيل إنتاجية محسنة من المقايسات الكيميائي ومراقبة ديناميات التحت خلوية في الخلايا المهاجرة. كفاءة ترنسفكأيشن عالية من HL60 الخلايا للتعبير عن الفلورسنت البروتين الموسومة البروتين خلايا HL60 هي خط خلية سرطان الدم تقسيم بنشاط وتنمو في تعليق. كما ذكرت سابقا 18-20، وخلايا HL60 مقاومة لزنقل الشم. على حد سواء وقد تم اختبار الدهون ونقل Electroporation للجينات، وتم الحصول على أعلى كفاءة ترنسفكأيشن مع Electroporation لل، كما هو موضح بالتفصيل في القسم 4. الحصول على قابلية عالية بعد Electroporation للأمر بالغ الأهمية للحصول على كفاءة ترنسفكأيشن عالية بسبب الضرر الشديد الذي ينتج من Electroporation لل. بعد ذلك، يطلب من التعامل مع الخلية دقيق ولطيف، خصوصا بعد Electroporation لل. تحتوي كافة وسائل الإعلام أن تكون قبل حرارة وأضاف بلطف إلى الخلايا في أي خطوات بعد Electroporation لل. فمن الأهمية بمكان لتقليل الوقت تعرض الخلايا إلى كاشف Electroporation للأيضا. لتجنب موت الخلايا، بعد Electroporation لل، يجب إضافة RPMI 1640 الانتعاش Electroporation للمتوسطة إلى الخلايا على الفور. لقد وجدنا أن 20٪ FBS في المتوسط ​​الانتعاش يعطي معدل استرداد خلية أعلى بكثير من 10٪ FBS. بعد Electroporation لل، الحضانة في RPMI 1640 Electroporation للمتوسطة الانتعاش لمدة 30 دقيقة أمر بالغ الأهمية لزيادة سلامة وترنسفكأيشنكفاءة. لزيادة كفاءة ترنسفكأيشن، وكنا أيضا 4 ميكروغرام DNA البلازميد في ترنسفكأيشن، الذي هو تقريبا مبلغ مرتين البلازميد الموصى بها من قبل الشركة المصنعة. هناك نوعان من القيود الرئيسية على ترنسفكأيشن Electroporation لل: وtransiency للتعبير البروتين والحد عدد الخلايا (2 × 10 6 خلايا لكل ترنسفكأيشن). في خلايا غير متمايزة، والتعبير هو كشفها فقط خلال أول زوجين من انقسامات الخلية، حيث يتم المخفف البلازميد ناقلات بمقدار النصف بعد كل انقسام الخلايا. لوHL60 متباينة خلايا البقاء على قيد الحياة لا أكثر من 48 ساعة. ونتيجة لذلك، فإن أي تجربة تتطلب تعداء جديدة 6 ساعة قبل التجربة. عدد الخلايا ل electroporation واحد فقط يلبي الحد الأدنى من المتطلبات لأي فحوصات البيوكيميائية. لغرض الاستخدام المتكرر أو كمية كبيرة، فمن المستحسن أن يتم إنشاء خط الخلية HL60 غير متمايزة تعبر عن ثبات البروتين من مبادرة الخوذ البيضاء الفائدةوقد تم وسمها الفصل مع بروتين فلوري من قبل ناقلات فيروسية، إذا كان ناقلات فيروسية غير متوفرة أو يمكن بناؤها.

الخلايا حقيقية النواة بمعنى والتحرك نحو التركيز العالي في التدرج جاذب كيميائي، المشار عملية الخلوية كما الكيميائي. يلعب الكيميائي أدوارا حاسمة في العديد من العمليات الفسيولوجية، مثل التطور الجنيني 1، الخلايا العصبية الزخرفة 2، ورم خبيث من الخلايا السرطانية 3، تجنيد العدلات إلى مواضع الالتهابات 4، وتطوير نموذج حي Dictyostelium discoideum 5. بشكل عام، والخلايا حقيقية النواة بمعنى chemoattractants باستخدام G البروتين يقترن مستقبلات 5. إشراك chemoattractants مع هذه المستقبلات يعزز تفكك البروتينات G heterotrimeric Gα وGβγ، والتي بدورها تفعيل المصب مسارات نقل الإشارة التي تنظم في نهاية المطاف تنظيم الزمانية المكانية من الهيكل الخلوي الأكتين لقيادة خلية الهجرة 5-9. تم البيولوجيا الخلوية تطوير وتحسين chemotaxغير المقايسات لدراسة كيف وجهت مجموعة مستقبلات البروتين يقترن (GPCR) يشير يتوسط الهجرة الخلية. تم تطوير بويدن غرفة أو الهجرة transwell فحص في عام 1960 من قبل بويدن 10. الفحص يعمل عن طريق إنشاء التدرج من المركبات جاذب كيميائي بين اثنين من الآبار التي يتم فصلها بواسطة غشاء الصغيرة التي يسهل اختراقها. بساطته وسهولة الاستخدام جعله الأكثر استخداما على نطاق واسع الكيميائي فحص حتى الآن. ومع ذلك، فإن الفحص لا تمكن عملية الهجرة من الخلايا أن تصور. غرفة زيجموند هو أول جهاز ميكروفلويديك البصرية التي تتيح التصوير واضح للهجرة الخلايا على ساترة عبر انقباض الضيق نحو جاذب كيميائي مصدر 11. دان 12 وInsall 13 معدلة ومحسنة عالية الدقة والقدرة على التصوير على المدى الطويل من زيجموند الكيميائي غرفة الفحص. بسبب خصائص يمكن التنبؤ بها للغاية،-نشر المهيمن تدفق السوائل، وكان على microfluidics توفير حلول للالمقبل من الجيلعلى المقايسات الكيميائي مثل EZ-TAXIScan (جهاز تحليل حركية الخلية). مع استقرار التدرج ضمان، يسمح الجهاز ستة الكيميائي المقايسات التي يتعين القيام بها في وقت واحد (الشكل 1A). وعلى النقيض من التدرجات الثابتة إتجاهي ولدت في مختلف المقايسات غرفة أعلاه، الإبرة أو micropipette مقايسة التي وضعتها جونتر Gerisch يولد التدرج مع مصدر متحرك 14. في الفحص، يتم تحريرها جاذب كيميائي من micropipette المنقولة لتوليد التدرج مستقرة. مع هذا الاختبار إبرة، وجد الباحثون أن خلايا مختلفة تولد pseudopods مع خصائص مختلفة جذريا. تطبيق المجهر الفلورسنت، كنا قادرين على تصور التدرج لتسهيل قياس الكمي في جميع أنحاء 15. في هذه الدراسة، ونحن تصف الأساليب التفصيلية لإعداد HL60 الكيميائي (اللوكيميا البشري) خلايا، ورصد في وقت واحد عدة أسا الكيميائييس مع جهاز تحليل حركية الخلية، وتصور ديناميات الزمانية المكانية بوساطة هذه العملية من الجزيئات يشير مثل بروتين كيناز D1 في الخلايا الحية واحدة ردا على مرئية، منبهات جاذب كيميائي يمكن السيطرة عليها spatiotemporally. يمكن تطبيقها لدينا طرق التصوير المتقدمة للدراسات الكيميائي العامة، وهي مناسبة خاصة بالنسبة للأنظمة خلايا الثدييات.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="459">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:120px;">RPMI 1640 Medium GlutaMAX</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:120px;">61870-036</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Fisher Scietific</td>
			<td style="width:120px;">11360-070</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:107px;">Gemini Bio-Products</td>
			<td style="width:120px;">100-106</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">1M HEPES sterile solution, pH7.3</td>
			<td style="width:107px;">Quality Biological Inc.</td>
			<td style="width:120px;">A611-J848-06</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:120px;">Penicillin streptomycin solution</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:120px;">15140122</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:120px;">NucleofectorTM 2b</td>
			<td style="width:107px;">Lonza</td>
			<td style="width:120px;">AAB-1001</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="217">
			<td height="217" style="height:217px;width:120px;">AmaxaTM Cell Line NucleofectorTM Kit V including NucleofectorTM Solution, Singe use pipettes, AmaxaTM certified 100 ml aluminum electrode cuvettes</td>
			<td style="width:107px;">Lonza</td>
			<td style="width:120px;">VCA-1003</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:120px;">Lab-Tek chambered #1.0 Borosilicate Coverglass</td>
			<td style="width:107px;">Nalge Nunc International Inc</td>
			<td align="right" style="width:120px;">155383</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">2 % Gelatin solution</td>
			<td style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">G1393</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">F1141</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:120px;">HBSS (Hanks&#8217; Balanced Salt Solution)</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:120px;">14025-076</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="60" rowspan="2" style="height:60px;width:120px;">Bovine serum albumin</td>
			<td rowspan="2" style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:120px;">A3803</td>
			<td rowspan="2" style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:120px;">Single well Lab-Tek II coverglass chambers</td>
			<td style="width:107px;">Nalge Nunc International Inc</td>
			<td align="right" style="width:120px;">155361</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:120px;">Four-well Lab-Tek II coverglass chambers</td>
			<td style="width:107px;">Nalge Nunc International Inc</td>
			<td align="right" style="width:120px;">155383</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Alexa 594</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">A-10438</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">fMLP</td>
			<td style="width:107px;">Sigma -Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">F3506-5MG</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:120px;">Cover glass thickness 2 22 x 22 mm</td>
			<td style="width:107px;">Corning</td>
			<td style="width:120px;">2855-22</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">EZ-TAXIScan</td>
			<td style="width:107px;">Effector Cell Institute, Inc.</td>
			<td style="width:120px;">MIC-1001</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">EZ-TAXIScan chip (5 mm)</td>
			<td style="width:107px;">Effector Cell Institute, Inc.</td>
			<td style="width:120px;">EZT-F01-5</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">1701RN 10ul syringe</td>
			<td style="width:107px;">Hamilton</td>
			<td align="right" style="width:120px;">80030</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Femtotips II Injection tips</td>
			<td style="width:107px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:120px;">5242956003</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">Femtotips II</td>
			<td style="width:107px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:120px;">930000043</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;width:120px;">TransferMan NK2, including motor module, X head with angle adjuster, and Positioning aids.&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:120px;">5188900056</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">DIAS software</td>
			<td style="width:107px;">Solltech Inc.</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="181">
			<td height="181" style="height:181px;width:120px;">LSM 780 META or equivalent confocal microscope with a 40X 1.3 NA or 60X 1.4 NA oil DIC Plan-Neofluar objective lens</td>
			<td style="width:107px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging g protein-coupled receptor-mediated chemotaxis and its signaling events in neutrophil-like hl60 cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

التصوير في وقت واحد الكيميائي للخلايا HL60 متعددة باستخدام جهاز تحليل الحركة الخلية واستنادا إلى مبدأ على microfluidics 16، وقد وفرت الشركة المصنعة لمحات محاكاة التدرجات: يتم إنشاء التدرج في 1 دقيقة، استقر في 5 دقائق، والحفاظ على أكثر من 2 ساعة. لمحات متوقع بشكل كبير من التدرجات مستقرة التي تولدها على microfluidics تسمح متعددة الكيميائي المقايسات التي يتعين القيام بها في وقت واحد. في هذه الدراسة، لاحظنا ثلاثة فحوصات الكيميائي في وقت واحد (الشكل 2A وفيلم 1). وجدنا أن HL60 الخلايا التي chemotaxing على الفور بعد حقن جاذب كيميائي في البئر من جاذب كيميائي، وأبقى chemotaxing في الطريق المستقيم لدقيقة 60 التالية، بما يتفق مع نتائج المحاكاة للاستقرار الانحدار. تتبع مسار السفر ومورفولوجيامن الخلايا يسمح القياسات الكمية والمقارنة لاحقة من السلوكيات الكيميائي باستخدام مؤشر الكيميائي يتضمن إجمالي طول المسار والسرعة واتجاهها، والاستدارة من الخلايا (الشكل 2B). إجمالي طول المسار هو مجموع أطوال أجزاء الخط الذي يربط بين centroids المسار. يتم الحصول على سرعة بقسمة مجموع طول الطريق من الوقت. يتم قياس اتجاهها التصاعدي وتعرف على النحو التالي: (Y تنسيق من نهاية المسار ناقص Y تنسيق من البداية) مقسوما على إجمالي طول المسار. وهذا يعطي 1.0 لكائن الانتقال مباشرة إلى أعلى. استدارة الخلية هي مقياس (في المائة) من مدى كفاءة كمية معينة من محيط يرفق المنطقة. دائرة لديها أكبر منطقة للأي محيط معين، ولها معلمة استدارة 100٪. وخط مستقيم يرفق أي مجال، ولها معلمة استدارة 0٪. نقدم لك مجموعة من السلوك الكيميائي قياسها كميا كما هو موضح من قبل المعلمات الكيميائي المحدد(الشكل 2C). مراقبة PKD توطين التحت خلوية في الخلايا HL60 تحت حافزا fMLP مرئية spatiotemporally والسيطرة عليها وهو التقدم التقني الكبير لتطبيق fluorescently المسمى والتحفيز جاذب كيميائي يمكن السيطرة عليها إلى نظام تجريبي. تاريخيا، فقد قدمنا ​​طلبا إما متجانسة (وتسمى أيضا موحدة) تحفيز أو تنشيط التدرج لمراقبة استجابة الخلايا والسلوكيات. ومع ذلك، &quot;الأعمى&quot; التحفيز لا يوفر فقط أي معلومات الزمانية المكانية على مدى يصل إلى تحفيز الخلايا، ولكن أيضا يلقي بظلال من الشك على أي ملاحظات &quot;غير طبيعية&quot; من استجابة الخلايا لتحفيز، وذلك ببساطة لأننا لا نرى التحفيز. لقد أظهرنا سابقا أن صبغة الفلورسنت (Alexa594) يمكن تطبيقها مع جاذب كيميائي لإقامة علاقة خطية بين تركيز جاذب كيميائي ومonitored الفلورسنت كثافة الصبغة 15. مع تكوين اكتساب البروتين الفلوري الأخضر (GFP)، انبعاث الأحمر من صبغة الفلورسنت (Alexa594)، والضوء المرسل، ونحن قادرون على رصد الخلايا الالتزام، وتطبيق حافز، واستجابة الخلية لحافز (الشكل 3A). بروتين كيناز D هي عائلة سيرين / ثريونين كاينيسات التي تلعب دورا أساسيا في توجه الخلايا الهجرة 9،17. وردا على موحد التطبيقية fMLP (الحمراء) تحفيز خلايا HL60 توسط إزفاء غشاء قوي من GFP الموسومة البروتين كيناز D1 (الأخضر) (الشكل 3B وفيلم 2). في التدرج fMLP (أحمر) (الشكل 4A)، وخلايا HL60 تجنيد بنشاط PKD1 إلى الحافة الأمامية (الشكل 4B و فيلم 3). مقارنة وثيقة للتوطين التحت خلوية من GFP في بروز الحافة الأمامية إلى أن PKD1 يموضع في الجزء الخلفي من حافة الرائدة (الشكل 4C). <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54511/54511fig1.jpg" /> الشكل 1. خلية جهاز تحليل الحركة يسمح ما يصل إلى 6 فحوصات الكيميائي في وقت واحد. (A) مخطط يبين تصميم حراكا خلية التحليل رقاقة جهاز لرصد وقت واحد من 6 المقايسات الكيميائي مستقلة. يظهر الحمراء جاذب كيميائي تضاف إلى الآبار. (ب) مقدمة من HL60 الخلايا إلى الآبار الخلايا في حين تبعثر جاذب كيميائي لإقامة fMLP الانحدار المستمر. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54511/54511fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54511/54511fig2.jpg" /> الشكل 2. مراقبة في وقت واحد من المقايسات الكيميائي متعددة مع خلايا HL60. (A </stro<html> نانوغرام&gt;) المونتاج يظهر صورا لتنقل الخلية الكيميائي جهاز تحليل فحص لفحص الآثار المثبطة للمثبطات PKD محددة على الكيميائي في أوقات 0 و 12 دقيقة بعد تطبيق التدرج. وقبل تعامل خلايا الكيميائي HL60 مع PKD المانع 1 ميكرومتر CID755673 لمدة 30 دقيقة. سمح خلايا HL60 مع أو بدون علاج مثبط PKD لchemotax في أي RPMI1640 تجويع 100 التدرجات نانومتر fMLP لمدة 12 دقيقة أو المتوسطة. (ب) خطة يدل على طول مسار السفر ومورفولوجيا الخلايا HL60 تتبعها. (C) الكمي الكيميائي كما يبلغ طول الطريق، والسرعة، واتجاهها، واستدارة. يعني ± يظهر SD. ن = 10، 12، أو 11 من دون التدرج، fMLP التدرج من دون علاج CID755673، والعلاج fMLP مع العلاج CID755673، على التوالي. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54511/54511fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> FO: المحافظة على together.within الصفحات = &quot;1&quot;&gt; <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/54511/54511fig3.jpg" /> الشكل 3. النوع من الاختزال بوساطة النبات غشاء قوي من PKD1 استجابة للمؤثرات fMLP التطبيقية بشكل موحد. (A) المتعددة رصد PKD1-GFP (الأخضر)، وجاذب كيميائي (1 ميكرومتر fMLP مختلطة مع 0.1 ميكروغرام / مل صبغة الفلورسنت اليكسا 594، أحمر) ، ومدينة دبي للإنترنت (التفاضل تدخل على النقيض) لتحديد الخلايا HL60 الالتزام في بئر من غرفة 4well المغلفة مع 0.2٪ الجيلاتين في المتوسط ​​1640 RPMI. شريط النطاق = 10 ميكرون. (ب) المونتاج يدل على أن تطبيقها بشكل موحد fMLP (الحمراء) يدفع النبات غشاء قوي من PKD1-GFP (الأخضر). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54511/54511fig3large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/54511/54511fig4.jpg" /> شملت رقمه 4. قيادة توطين حافة PKD1 في chemotaxing خلايا HL60. (A) قناة التكوين اكتساب وضع يسهل تصور التدرج fMLP وديناميات الزمانية المكانية من PKD1. في A - C، أعرب خلايا HL60 عابر PKD1 الموسومة GFP. لتصور التدرج fMLP ولدت من micropipette (DIC)، و 100 نانومتر fMLP (الأحمر) كانت مختلطة مع 0.1 ميكروغرام / مل صبغة الفلورسنت اليكسا 594. (ب) توطين المخصب من PKD1 في طليعة من الخلية chemotaxing. شريط النطاق = 10 ميكرون. وتشير (C) الصور المدمجة التي PKD1 يموضع في الجزء الخلفي من حافة الرائدة في الخلايا HL60. يظهر اللون الأخضر PKD1 توطين الخلوية، وتظهر صورة مدينة دبي للإنترنت ومنطقة جاحظ من الحافة الأمامية. مقياس شريط = 5 ميكرون. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54511/54511fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells at JoVE.com

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

المقايسات الكيميائي البصرية ضرورية لفهم أفضل لكيفية الخلايا حقيقية النواة التحكم بوساطة جاذب كيميائي الاتجاه الهجرة الخلية. هنا، نحن تصف الأساليب التفصيلية ل: 1) في الوقت الحقيقي، وارتفاع القرار، رصد المقايسات الكيميائي متعددة، و2) تصور في وقت واحد التدرج جاذب كيميائي وديناميات الزمانية المكانية من الإشارات الأحداث في الخلايا HL60 مثل العدلات.

يقترن تصوير البروتين G مستقبلات بوساطة الكيميائي والأحداث يشير في خلايا HL60 العدلات مثل

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

Research

JoVE Journal

Biology

Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects

غرس Ferumoxides إعتبر الإنسان الخلايا الجذعية الوسيطة في عيوب الغضروف

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

الكمي في الجسم الحي من التفاعلات بروتين G مستقبلات اقترن به الطيفي ثنائي الفوتون الميكروسكوب

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

التصوير G - مستقبلات البروتين يقترن (GPCR) بوساطة الأحداث يشير إلى أن التحكم في الانجذاب الكيميائي Dictyostelium Discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors

قياس نشاط ناهض في مستقبلات البروتين يقترن G

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

الحنق المجهر لمراقبة الوقت الحقيقي من أحداث في اشارة الخلايا الحية باستخدام أجهزة الاستشعار Unimolecular

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

يعيش التصوير خلية من الأحداث الالتهام الذاتي المبكر: Omegasomes وما بعدها

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

الأيضية وصفها وغشاء التقطير للالمقارن تحليل البروتين من<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس thaliana</em&gt; الثقافات تعليق خلية

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

المسابر الجزيئية المشفرة وراثيا لدراسة G مستقبلات البروتين يقترن

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation  Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

التعرف على الفئران أرومة الحمراء حيوانية المخصب في Enucleating الأحداث بواسطة متعدد الأطياف التصوير التدفق الخلوي

Erythropoiesis in mammals concludes with the dramatic process of enucleation that results in reticulocyte formation. The mechanism of enucleation has not ...

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

توصيف G مستقبلات البروتين يقترن بها الكالسيوم تعبئة الفحص القائم على الإسفار

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...