Name: imaging g protein-coupled receptor-mediated chemotaxis and its signaling events in neutrophil-like hl60 cells
Uploaded: 2016-09-14T14:00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells at JoVE.com

This work is supported by the intramural fund of NIAID, NIH.

<ol>
	<li>Pocha, S. M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+single+and+collective+cell+migrations+in+Drosophila:+themes+and+variations.">Cellular and molecular mechanisms of single and collective cell migrations in Drosophila: themes and variations.</a> Annual review of genetics. 48, 295-318 (2014).</li><li>Wen, Z., Zheng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+guidance+of+nerve+growth+cones.">Directional guidance of nerve growth cones.</a> Current opinion in neurobiology. 16, 52-58 (2006).</li><li>Bravo-Cordero, J. J., Hodgson, L., Condeelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cell+invasion+and+migration+during+metastasis.">Directed cell invasion and migration during metastasis.</a> Current opinion in cell biology. 24, 277-283 (2012).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+by+polymorphonuclear+leukocytes.">Chemotaxis by polymorphonuclear leukocytes.</a> The Journal of cell biology. 77, 269-287 (1978).</li><li>Jin, T., Xu, X., Hereld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis,+receptors+and+human+disease.">Chemotaxis, receptors and human disease.</a> Cytokine. 44, 1-8 (2008).</li><li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-Rex1+is+a+primary+Rac2+guanine+nucleotide+exchange+factor+in+mouse+neutrophils.">P-Rex1 is a primary Rac2 guanine nucleotide exchange factor in mouse neutrophils.</a> Current biology : CB. 15, 1874-1879 (2005).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+sensing+requires+G+beta+gamma-mediated+PAK1+and+PIX+alpha-dependent+activation+of+Cdc42.">Directional sensing requires G beta gamma-mediated PAK1 and PIX alpha-dependent activation of Cdc42.</a> Cell. 114, 215-227 (2003).</li><li>Van Haastert, P. J., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis:+signalling+the+way+forward.">Chemotaxis: signalling the way forward.</a> Nature reviews: Molecular cell biology. 5, 626-634 (2004).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPCR-Mediated+PLCbetagamma/PKCbeta/PKD+Signaling+Pathway+Regulates+the+Cofilin+Phosphatase+Slingshot+2+in+Neutrophil+Chemotaxis.">GPCR-Mediated PLCbetagamma/PKCbeta/PKD Signaling Pathway Regulates the Cofilin Phosphatase Slingshot 2 in Neutrophil Chemotaxis.</a> Mol Biol Cell. , (2015).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of experimental medicine. 115, 453-466 (1962).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors.">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> The Journal of cell biology. 75, 606-616 (1977).</li><li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber.">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> Journal of cell science. 99 (Pt4), 769-775 (1991).</li><li>Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+chamber+for+direct+visualisation+of+chemotaxis.">An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis.</a> PloS one. 5, e15309 (2010).</li><li>Bozzaro, S., Fisher, P. R., Loomis, W., Satir, P., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guenther+Gerisch+and+Dictyostelium,+the+microbial+model+for+ameboid+motility+and+multicellular+morphogenesis.">Guenther Gerisch and Dictyostelium, the microbial model for ameboid motility and multicellular morphogenesis.</a> Trends in cell biology. 14, 585-588 (2004).</li><li>Xu, X., Jin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+G-protein+coupled+receptor+(GPCR)-mediated+signaling+events+that+control+chemotaxis+of+Dictyostelium+discoideum.">Imaging G-protein coupled receptor (GPCR)-mediated signaling events that control chemotaxis of Dictyostelium discoideum.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).</li><li>Lin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+dynamic+temporal+and+spatial+concentration+gradients+using+microfluidic+devices.">Generation of dynamic temporal and spatial concentration gradients using microfluidic devices.</a> Lab Chip. 4, 164-167 (2004).</li><li>Eiseler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+D1+regulates+cofilin-mediated+F-actin+reorganization+and+cell+motility+through+slingshot.">Protein kinase D1 regulates cofilin-mediated F-actin reorganization and cell motility through slingshot.</a> Nature cell biology. 11, 545-556 (2009).</li><li>Roddie, P. H., Paterson, T., Turner, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+to+primary+acute+myeloid+leukaemia+blasts+and+myeloid+leukaemia+cell+lines.">Gene transfer to primary acute myeloid leukaemia blasts and myeloid leukaemia cell lines.</a> Cytokines Cell Mol Ther. 6, 127-134 (2000).</li><li>Schakowski, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+non-viral+method+for+transfection+of+primary+leukemia+cells+and+cell+lines.">Novel non-viral method for transfection of primary leukemia cells and cell lines.</a> Genet Vaccines Ther. 2, 1 (2004).</li><li>Uchida, E., Mizuguchi, H., Ishii-Watabe, A., Hayakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+efficiency+and+safety+of+non-viral+vector-mediated+gene+transfer+into+a+wide+range+of+human+cells.">Comparison of the efficiency and safety of non-viral vector-mediated gene transfer into a wide range of human cells.</a> Biol Pharm Bull. 25, 891-897 (2002).</li></ol>

The authors declare no competing financial interest for this work.

במחקר הנוכחי, אנו מציגים שתי דוגמאות של מבחני chemotaxis: ראשון, ניטור סימולטני של מבחני chemotaxis מרובים על ידי מכשיר ניתוח ניידות תא; ושנית, ויזואליזציה של שיפוע chemoattractant ואת הדינמיקה spatiotemporal של איתות אירועים באותו תאים בזמן אמת. התקן ניתוח ניידות נייד עבור מבחני chemotaxis בו זמנית מספר רב במחקר הנוכחי, הצגנו פרוטוקול מפורט לביצוע מבחני chemotaxis בו זמנית מספר רב באמצעות מכשיר ניתוח ניידות התא. מכשיר זה מאפשר למשתמש לצפות התנהגות chemotaxis סלולרית עם עדשה 10X אובייקטיבית תצפית שדה הבהיר קונבנציונלית. בשל המאפיינים דומיננטי דיפוזיה של זרימת הנוזל, המכשיר ניתוח ניידות התא מייצר מאוד הדרגתי צפוי, יציב ומאפשר עד שישה מבחני chemotaxis להתבצע בו זמנית. השלבים הקריטיים של הפרוטוקול הםלהשיג הדרגתיים אמינים כדי ליישר את התאים על קו המרפסת. המשתמש צריך לעקוב בקפדנות אחר הוראות היצרן להרכבה בעל הזרקת של chemoattractants ותאים. הוראות מפורטות הם גם זמין באינטרנט. בהשוואה לשיטות chemotaxis אלטרנטיבה 11-13,15, המכשיר הזה משפר באופן משמעותי את האמינות והיעילות של מבחני chemotaxis. ארבעה גדלים של שבב התקן ניתוח ניידות תא בגדלים של 4, 5, 6, ו -8 מיקרומטר זמינים כדי להתאים סוגים וגדלים שונים של תאים. מצאנו כי שבב התקן ניתוח ניידות תא 4 או 5 מיקרומטר מתאים HL60 וד תאי discoideum, שהם כ 10-15 מיקרומטר קוטר. עם זאת, מגבלה אחת היא כי התקן זה אינו מתאים לכל סוגי תאים. היו לנו מעט הצלחה באמצעות assay chemotaxis התקן ניתוח ניידות תא עם תאים Raw267.4. הסיבה לכך עשויה להיות כי תאי Raw267.4 להעביר לאט מדי. כמה זמן נדרש עבור che ביותרmotaxis של תאי Raw267.4 עלול להיות הרבה יותר מזמן שיפוע מתוחזק על ידי המכשיר. במקום זאת, assay הגירה transwell עבד היטב תאים Raw267.4 9. מגבלה נוספת היא כי תצפית פלורסנט אינה אפשרית עם המכשיר הנוכחי. בכיוון העתיד הוא לפקח הדמיה ניאון עם הגדלה גבוהה. זה אפשרי עם מכשיר ניתוח ניידות תא המשופר, אשר מצויד עם זיהוי פלורסנט עדשה אובייקטיבית 100X. בנוסף, מספר מבחני סימולטני גם הוא עלה ל 12. כל השיפורים הללו להקל על התפוקה המשופרת של מבחני chemotaxis ואת התצפית של דינמיקת subcellular ב תאים נודדים. יעילות transfection גבוהה של HL60 תאים לבטא חלבונים-tagged ניאון תאי HL60 מהווים שורת תאים לוקמיה שעדיין מתחלקת ולגדול השעיה. כפי שדווח בעבר 18-20, תאי HL60 עמידים gהעברת פנטן. שניהם שומני העברת גני electroporation נבדקו, ויעילות transfection גבוהה הושגה עם electroporation, כמתואר בפירוט בסעיף 4. קבלת כדאיויות גבוהות לאחר electroporation הוא קריטי להשגת יעילות transfection גבוהה בגלל הפגיעה הקשה נובעת electroporation. בהמשך לכך, טיפול בתא יסודי ועדין נדרשים, במיוחד לאחר electroporation. כל כלי התקשורת צריכה להיות מחומם מראש והוספתי בעדינות אל התאים בכל שלבים לאחר electroporation. זה גם קריטי כדי למזער את זמן החשיפה של תאים מגיב electroporation. כדי למנוע מוות של תאים, לאחר electroporation, בינוני התאוששות electroporation RPMI 1640 יש להוסיף את התאים מיד. מצאנו כי FBS 20% בטווח הבינוני ההתאוששות נותן שיעור התאוששות תא הרבה יותר גבוה מ -10% FBS. לאחר electroporation, דגירה במדיום התאוששות electroporation RPMI 1640 למשך 30 דקות היא קריטית עבור כדאיות יותר transfectionיְעִילוּת. כדי להגביר עוד יותר את יעילות transfection, אנו גם בשימוש 4 פלסמיד דנ&quot;א מיקרוגרם לכל transfection, המהווה כמעט את הסכום פעמיים של פלסמיד המומלץ על ידי היצרן. ישנם שתי מגבלות עיקריות על transfection electroporation: את הארעיות של ביטוי החלבון ואת מגבלת המספר הסלולרי (2 x 10 6 תאים לכל transfection). בשנת תאים שלא עברו התמיינות, ביטוי ניתן לזהות רק במהלך הזוג הראשון של חלוקות תא, מאז פלסמיד הווקטור הוא מדולל בחצי אחרי כל חלוקת תא. For The HL60 הבדיל תאים לשרוד לא יותר מ -48 שעות. כתוצאה מכך, כל ניסוי מחייב transfections הטרי 6 שעות לפני הניסוי. מספר תאים עבור electroporation אחד רק עונה על הדרישה המינימלית עבור כל מבחני ביוכימיים. לצורך שימוש חוזר על עצמו או כמות גדולה, מומלץ מאוד כי שורת תאים שלא עברו התמיינות HL60 שתוקם ביציבות מבטא את החלבון של WHI ענייןch תויג עם חלבון פלואורסצנטי ידי וקטור ויראלי, אם וקטור ויראלי זמין או ניתן לבנות.

תאים איקריוטיים לחוש ולנוע לעבר הריכוז הגבוה בתוך שיפוע chemoattractant, בתהליכים תאיים כמו המכונים chemotaxis. Chemotaxis משחק תפקידים קריטיים בתהליכים פיזיולוגיים רבים, כגון העובר 1, נוירון דפוסים 2, גרורות של תאים סרטניים 3, גיוס של נויטרופילים לאתרים של דלקת 4, ואת הפיתוח של אורגניזם מודל Dictyostelium discoideum 5. באופן כללי, תאים איקריוטיים לחוש chemoattractants באמצעות קולטנים G- חלבון בשילוב 5. ההתקשרות של chemoattractants עם קולטנים אלה מקדמת דיסוציאציה של חלבוני G heterotrimeric Gα ו Gβγ, אשר בתורו להפעיל מסלולי העברת אותות במורד זרם כי בסופו של דבר לווסת את ארגון spatiotemporal של שלד התא יקטין לנהוג להגירה של תאי 5-9. ביולוגי Cell כבר בפיתוח ושיפור chemotaxמבחנים הוא לבחון כיצד קולטן המצומד לחלבון G (GPCR) איתות מתווכת מכוונים נדידת תאים. את assay ההגירה הקאמרית או transwell בוידן פותחה בשנת 1960 על ידי בוידן 10. את assay פועלת על ידי יצירת שיפוע של תרכובות chemoattractant בין שתי בארות, כי הם מופרדים על ידי קרום microporous. פשטות וקלות השימוש בו הופכות אותו assay chemotaxis הנפוצה ביותר עד כה. עם זאת, assay אינו מאפשר התהליך הנודד של התאים להיות מדמיינת. תא זיגמונד הוא המכשיר microfluidic החזותי הראשון המאפשר הדמיה ברורה של נדידת תאים על coverslip פני התכווצות צרה לעבר מקור chemoattractant 11. 12 דאן Insall 13 שונה ושפרו את ברזולוציה הגבוהה ויכולת הדמיה לטווח ארוכה של assay chemotaxis הקאמרית Zigmond. בשל המאפיינים צפויים, דיפוזיה דומיננטית מאוד של זרימת נוזל, מיקרופלואידיקה כבר במתן פתרונות-generati הבאעל מבחני chemotaxis כגון EZ-TAXIScan (התקן ניתוח ניידות התא). עם היציבות של השיפוע המובטח, המכשיר מאפשר שישה מבחני chemotaxis להתבצע בו זמנית (איור 1 א). בניגוד הדרגתיים הקבועים directionally שנוצרו המבחנים הקאמריים לעיל, assay המחט או micropipette שפותח על ידי גינתר Gerisch יוצר שיפוע עם מקור מטלטלי 14. ב assay, chemoattractant הוא שוחרר מבית micropipette מטלטלין כדי ליצור שיפוע יציב. עם assay מחט זה, חוקרים מצאו כי תאים שונים ליצור pseudopods עם מאפיינים שונים באופן מהותי. החלה מיקרוסקופ פלואורסצנטי, הצלחנו לחזות את השיפוע כדי להקל מדידת כמותית שלה ברחבי 15. במחקר זה, אנו מתארים שיטות מפורטות להכנת HL60 chemotactic (לוקמיה פרומיילוציטית אדם) תאים, ניטור אסא chemotaxis המרובה בו זמניתys עם המכשיר ניתוח ניידות התא, באופן חזותי את הדינמיקה spatiotemporal בתיווך GPCR של מולקולות איתות כגון חלבון קינאז D1 בתאים חיים יחיד בתגובה גלוי, גירויים chemoattractant לשליטה spatiotemporally. שיטות ההדמיה המתקדמות שלנו יכולות להיות מיושמות על מחקרי chemotaxis כלליים, ומתאים במיוחד עבור מערכות תא יונקות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="459">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:120px;">RPMI 1640 Medium GlutaMAX</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:120px;">61870-036</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Fisher Scietific</td>
			<td style="width:120px;">11360-070</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:107px;">Gemini Bio-Products</td>
			<td style="width:120px;">100-106</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">1M HEPES sterile solution, pH7.3</td>
			<td style="width:107px;">Quality Biological Inc.</td>
			<td style="width:120px;">A611-J848-06</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:120px;">Penicillin streptomycin solution</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:120px;">15140122</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:120px;">NucleofectorTM 2b</td>
			<td style="width:107px;">Lonza</td>
			<td style="width:120px;">AAB-1001</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="217">
			<td height="217" style="height:217px;width:120px;">AmaxaTM Cell Line NucleofectorTM Kit V including NucleofectorTM Solution, Singe use pipettes, AmaxaTM certified 100 ml aluminum electrode cuvettes</td>
			<td style="width:107px;">Lonza</td>
			<td style="width:120px;">VCA-1003</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:120px;">Lab-Tek chambered #1.0 Borosilicate Coverglass</td>
			<td style="width:107px;">Nalge Nunc International Inc</td>
			<td align="right" style="width:120px;">155383</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">2 % Gelatin solution</td>
			<td style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">G1393</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">F1141</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:120px;">HBSS (Hanks&#8217; Balanced Salt Solution)</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:120px;">14025-076</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="60" rowspan="2" style="height:60px;width:120px;">Bovine serum albumin</td>
			<td rowspan="2" style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:120px;">A3803</td>
			<td rowspan="2" style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:120px;">Single well Lab-Tek II coverglass chambers</td>
			<td style="width:107px;">Nalge Nunc International Inc</td>
			<td align="right" style="width:120px;">155361</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:120px;">Four-well Lab-Tek II coverglass chambers</td>
			<td style="width:107px;">Nalge Nunc International Inc</td>
			<td align="right" style="width:120px;">155383</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Alexa 594</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">A-10438</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">fMLP</td>
			<td style="width:107px;">Sigma -Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">F3506-5MG</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:120px;">Cover glass thickness 2 22 x 22 mm</td>
			<td style="width:107px;">Corning</td>
			<td style="width:120px;">2855-22</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">EZ-TAXIScan</td>
			<td style="width:107px;">Effector Cell Institute, Inc.</td>
			<td style="width:120px;">MIC-1001</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">EZ-TAXIScan chip (5 mm)</td>
			<td style="width:107px;">Effector Cell Institute, Inc.</td>
			<td style="width:120px;">EZT-F01-5</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">1701RN 10ul syringe</td>
			<td style="width:107px;">Hamilton</td>
			<td align="right" style="width:120px;">80030</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Femtotips II Injection tips</td>
			<td style="width:107px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:120px;">5242956003</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">Femtotips II</td>
			<td style="width:107px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:120px;">930000043</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;width:120px;">TransferMan NK2, including motor module, X head with angle adjuster, and Positioning aids.&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:120px;">5188900056</td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">DIAS software</td>
			<td style="width:107px;">Solltech Inc.</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="181">
			<td height="181" style="height:181px;width:120px;">LSM 780 META or equivalent confocal microscope with a 40X 1.3 NA or 60X 1.4 NA oil DIC Plan-Neofluar objective lens</td>
			<td style="width:107px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging g protein-coupled receptor-mediated chemotaxis and its signaling events in neutrophil-like hl60 cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

הדמיה סימולטני של chemotaxis של תאי HL60 מרובים באמצעות מכשיר ניתוח ניידות תא בהתבסס על העיקרון של מיקרופלואידיקה 16, היצרנית ספקה פרופילים מדומים של מילויים: שיפוע נוצר בתוך דקות 1, התייצבה תוך 5 דקות, ומתוחזק על 2 hr. הפרופילים והצפויים למדי של הדרגתיים היציבים שנוצרו על ידי מיקרופלואידיקה לאפשר מבחני chemotaxis המרובה להתבצע בו זמנית. במחקר הנוכחי, צפינו בשלושה מבחני chemotaxis סימולטני (איור 2 א ו סרט 1). מצאנו כי HL60 תאים נכתבו chemotaxing מייד לאחר chemoattractant שהוזרק לתוך הבאר של chemoattractant, והמשכתי chemotaxing בנתיב ישר עבור 60 הדקות הבאות, עולות בקנה אחד עם תוצאות הסימולציה ליציבות שיפוע. איתור את הנתיב ואת מורפולוגיה נסיעותשל התאים מאפשרת מדידות כמותיות והשוואה הבאות של התנהגויות chemotaxis באמצעות מדד chemotaxis הכוללת אורך הדרך כולל, מהירות, כיווניות, עגלגלות של תאים (תרשים 2B). אורך מסלול הכולל הוא סכום האורכים של מקטעי הקו המחבר בין centroids של השביל. מהירות מתקבלת על ידי חלוקת אורך הדרך כולל על ידי הזמן. כיווניות נמדדו כלפי מעלה, והוא מוגדר כ: (Y של לסוף הנתיב מינוס Y של התחילה) חלקיות אורך דרך כלל. זה נותן 1.0 עבור אובייקט נע ישירות כלפי מעלה. את העגלגלות של התא היא מדד (באחוזים) של מידת יעילות כמות נתונה של מערכת סוגרת באזור. מעגל יש את השטח הגדול ביותר עבור כל מערכת נתונה יש פרמטר עגלגלות של 100%. קו ישר סוגר שום תחום ויש לו פרמטר עגלגלות של 0%. אנו מציגים את התנהגות chemotaxis נמדד כמותית כפי שתואר על ידי הפרמטרים chemotaxis שנבחרו(איור 2 ג). ניטור לוקליזציה subcellular PKD בתאים HL60 תחת גירוי fMLP גלוי לשליטה spatiotemporally זהו מראש טכניים גדולים ליישם שכותרתו fluorescently וגירוי chemoattractant לשליטה על מערכת ניסיונית. מבחינה היסטורית, יש לנו בקשה אחת הומוגנית (המכונה גם אחיד) גירוי או גירוי שיפוע לצפות תגובת התא והתנהגויות. עם זאת, &quot;עיוור&quot; גירוי לא רק מספק שום מידע spatiotemporal כיצד הגירוי מגיע התאים, אלא גם מטיל ספק על כל תצפיות &quot;נורמליות&quot; של תגובת תא לגירוי, פשוט כי אנחנו לא רואים את הגירוי. הראינו בעבר כי צבע פלואורסצנטי (Alexa594) יכול להיות מיושם עם chemoattractant ליצור מערכת יחסים ליניארי בין ריכוז chemoattractant ו- mצבע פלואורסצנטי onitored עוצמת 15. עם תצורת רכישת החלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), פליטת אדום של צבע פלואורסצנטי (Alexa594), ואת האור מועבר, אנו מסוגלים לפקח על התאים הדבקים, היישום של הגירוי, ואת תגובת התא לגירוי (איור 3A). D קינאז חלבון היא משפחה של קינאזות סרין / תראונין כי לשחק תפקידים חיוניים נדידת תאים מכוונת 9,17. בתגובה אחידה שימושי fMLP (אדום) גירוי, תאי HL60 לתווך טרנסלוקציה קרום חזקה של ה- GFP-tagged חלבון קינאז D1 (ירוק) (2 האיור 3B ו Movie). בשנת שיפוע fMLP (אדום) (איור 4 א), תאי HL60 פעילים לגייס PKD1 אל הקצה המוביל (איור 4 ב ו סרט 3). השוואה מדוקדקת של לוקליזציה subcellular של GFP ב בליטה של ​​הקצה הקדמי עולה כי PKD1 localizes בחלק האחורי של הקצה הקדמי (4C איור). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54511/54511fig1.jpg" /> איור 1. התקן ניתוח ניידות נייד מאפשר עד 6 מבחני chemotaxis סימולטני. (א) Scheme מציגה את העיצוב של שבב התקן ניתוח ניידות תא עבור ניטור סימולטני של 6 מבחני chemotaxis עצמאיים. מופעים אדומים chemoattractant מתווספים הבארות. (ב) מבוא של HL60 תאים כדי הבארות של תאים בעוד chemoattractant מפזרת כדי ליצור שיפוע fMLP יציב. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54511/54511fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54511/54511fig2.jpg" /> איור 2. ניטור סימולטני של מבחני chemotaxis מרובים עם תאים HL60. (א </stro<html> ng&gt;) Montage מראה תמונות של assay chemotaxis התקן ניתוח ניידות תא לבחון את השפעתו המעכבת של מעכבי PKD ספציפי על chemotaxis בזמנים של 0 ו -12 דקות לאחר יישום הדרגתי. תאי Chemotactic HL60 היו טרום שטופלו CID755673 מעכב PKD 1 מיקרומטר למשך 30 דקות. תאי HL60 עם או בלי טיפול מעכב PKD הורשו chemotax בשני בינוני רעב RPMI1640 או 100 הדרגתי ננומטר fMLP במשך 12 דקות. (ב) תכנית מציגה את אורך מסלול הנסיעה ומורפולוגיה של תאי HL60 לייחס. (C) כימות chemotaxis כמו אורך הדרך כולל, מהירות, כיווניות, עגלגלות. ממוצע ± סטיית תקן מוצג; n = 10, 12, או 11 ללא שיפוע, שיפוע fMLP ללא טיפול CID755673, וטיפול fMLP עם טיפול CID755673, בהתאמה. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54511/54511fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> FO: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54511/54511fig3.jpg" /> איור 3. בתיווך GPCR טרנסלוקציה קרום חזקים של PKD1 בתגובה לגירויים fMLP אחיד. (א) ניטור רב-ערוצי של PKD1-GFP (ירוק), chemoattractant (1 מיקרומטר fMLP מעורבב עם 0.1 מיקרוגרם / מ&quot;ל צבע פלואורסצנטי אלקסה 594, אדום) , ודסק&quot;ש (התערבות הפרש לעומת זאת) כדי לזהות את תאי HL60 הדבקים בבאר תא 4well צופה ג&#39;לטין 0.2% בטווח בינוני RPMI 1640. בר סולם = 10 מיקרומטר. (ב) Montage מראה כי באופן אחיד השימושי fMLP (אדום) גורמת טרנסלוקציה קרום החזק של PKD1-GFP (ירוק). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54511/54511fig3large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54511/54511fig4.jpg" /> Figurלוקליזציה קצה מובילים דואר 4. PKD1 ב chemotaxing תאים HL60. (א) מצב ערוצים רכישת תצורה מקל על ויזואליזציה של שיפוע fMLP ואת הדינמיקה spatiotemporal של PKD1. In A - C, תאי HL60 הביעו זמנים PKD1 GFP-tagged; כדי להמחיש את שיפוע fMLP המופק micropipette (DIC), 100 ננומטר fMLP (אדום) עורבב עם 0.1 מיקרוגרם / מ&quot;ל צבע פלואורסצנטי אלקסה 594. (ב) מועשר לוקליזציה של PKD1 בחוד החנית של התא chemotaxing. בר סולם = 10 מיקרומטר. (ג) תמונות ממוזגות מראות כי PKD1 localizes בחלק האחורי של הקצה הקדמי בתאי HL60. הירוק מצביע על לוקליזציה הסלולר PKD1, ותמונת דסק&quot;ש מציגה את האזור הבולט של הקצה הקדמי. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54511/54511fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells at JoVE.com

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

מבחני chemotaxis חזותיים חיוניים להבנה טובה יותר של איך איקריוטיים תאים לשלוט נדידת תאים כיוונית בתיווך chemoattractant. כאן אנו מתארים שיטות מפורטות: 1) בזמן אמת, ניטור ברזולוציה גבוהה של מבחני chemotaxis מרובים, ו -2) בו זמנית לדמיין את שיפוע chemoattractant ואת דינמיקת spatiotemporal של איתות אירועים בתאי HL60 דמוי נויטרופילים.

G הדמית חלבון בשילוב קולטן בתיווך Chemotaxis ואירועי האיתות שלה בתאי HL60 נויטרופילים דמויים

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

Research

JoVE Journal

Biology

Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects

השרשה של Ferumoxides תווית אדם בתאי גזע mesenchymal ב פגמים סחוס

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

ב כימות vivo של G מצמידים חלבון קולטן אינטראקציות באמצעות נפתר Spectrally שני פוטון מיקרוסקופית

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

קולטן הדמיה G-חלבון יחד (GPCR) בתיווך אירועים איתות כי הפיקוח של Chemotaxis Discoideum Dictyostelium</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors

כימות פעילות אגוניסט ב G-חלבון יחד רצפטורים

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

סריג מיקרוסקופי לניטור בזמן אמת של אירועי איתות בתאים חיים באמצעות Biosensors Unimolecular

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

לחיות תא הדמיה של אירועי autophagy מוקדמים: Omegasomes ומעבר

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

מטבולית תיוג וממברנה היפוך חלוקה לניתוח השוואתי של proteomic<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; תא תרבויות השעיה

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

בדיקות מולקולריות גנטי מקודדות לחקר רצפטורים מצמידים חלבון G

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation  Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

זיהוי של subpopulation מועשר Murine Erythroblast באירועי Enucleating ידי Multi-רפאים הדמיה תזרים cytometry

Erythropoiesis in mammals concludes with the dramatic process of enucleation that results in reticulocyte formation. The mechanism of enucleation has not ...

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

אפיון של רצפטורים מצמידים גרמו חלבון על ידי Assay גיוס סיד הקרינה מבוססת

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...